猪囊尾蚴排泄分泌抗原TPx蛋白的筛选验证、T细胞抗原表位预测及真核表达北大核心CSCD

目的 在对猪囊尾蚴及其排泄分泌抗原(excretory secretory antigen, ESA)非标定量(label-free quantification, LFQ)蛋白质组学分析的基础上,筛选并验证具有调控T细胞免疫应答功能的硫氧还蛋白过氧化物酶(thioredoxin peroxidase, TPx)蛋白,预测TPx蛋白的亲水性和T细胞抗原表位并进行真核表达。方法 对猪囊尾蚴ESA差异蛋白进行基因本体论(gene ontology, GO)富集和生物学功能注释,筛选TPx蛋白。运用平行反应监测技术(parallel reaction monitoring, PRM)验证TPx蛋白。运用Kyte&Doolittle法预测TPx蛋白的亲水性,运用Propred软件预测TPx蛋白T细胞抗原表位。采用基于PCR准确合成(PCR-based accurate synthesis, PAS)方法,全基因合成TPx抗原编码基因并克隆至pcDNA3.4载体,构建重组质粒pcDNA3.4-TPx,转染至HEK293细胞,表达和纯化TPx蛋白。结果 根据GO富集和生物学功能注释,筛选出差异表达量最大的TPx蛋白。TPx蛋白经PRM验证,LFQ蛋白质组学与靶向蛋白质组学对TPx蛋白表达量的趋势一致。预测该蛋白为亲水性蛋白,且含有多个可能的优势T淋巴细胞抗原表位。重组质粒pcDNA3.4-TPx构建正确,经SDS-PAGE电泳分析和Western blot鉴定,在细胞培养上清获得相对分子质量约为26×10^(3)的TPx蛋白,且纯化后带有His标签的TPx重组蛋白能被抗His单克隆抗体识别。结论 成功实现了对猪囊尾蚴ESA中TPx蛋白的筛选、验证、T细胞抗原表位预测和真核表达,且表达的TPx蛋白具有反应原性,为该蛋白的进一步研究奠定了基础。     

猪囊尾蚴排泄分泌抗原LRRC15蛋白真核表达及抗原表位预测

目的　对猪囊尾蚴排泄分泌抗原中差异表达蛋白富含亮氨酸重复序列结构域15（leucine⁃rich repeat containing 15, LRRC15）进行真核表达，并预测其抗原表位。方法　通过在线软件ExPASy⁃PortParam和Protean软件预测LRRC15蛋白分子质量、稳定性、氨基酸序列组成及等电点和T淋巴细胞抗原表位。采用基于PCR的精确合成（PCR⁃based accurate synthesis, PAS）技术设计全长拼接引物，合成LRRC15基因。构建重组质粒pcDNA3.4⁃LRRC15并转染至人胚胎肾细胞HEK293，表达LRRC15蛋白，并进行十二烷基磺酸钠⁃聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate⁃polyacrylamide gel electrophoresis, SDS⁃PAGE）和免疫印迹试验（Western blotting）鉴定。结果　成功构建了重组质粒pcDNA3.4⁃LRRC15，表达分子质量约70 kDa的LRRC15目的蛋白。经ExPASy⁃PortParam软件预测，LRRC15属于亲水性蛋白，由644个氨基酸组成，分子质量为69.89 kDa，等电点为5.6；蛋白分子式为C3073H4942N846O953S28，不稳定系数为50.3，为一种不稳定蛋白。采用Protean软件预测发现，LRRC15蛋白位于292 ~ 295、353 ~ 361、521 ~ 526、555 ~ 564位氨基酸区段具有T细胞抗原表位优势，具有亲水性高、柔韧性好、表面可及性大、抗原性指数高的表位位于122 ~ 131、216 ~ 233、249 ~ 254、333 ~ 343、358 ~ 361、368 ~ 372、384 ~ 386、407 ~ 412、445 ~ 450、469 ~ 481、553 ~ 564、588 ~ 594、607 ~ 617、624 ~ 639位氨基酸区段。将重组质粒pcDNA3.4⁃LRRC15转染至HEK293细胞后，SDS⁃PAGE和Western blotting分析发现，在细胞分泌培养基、细胞裂解上清和沉淀中检测到LRRC15蛋白。从细胞培养基中纯化出LRRC15⁃His融合蛋白，SDS⁃PAGE显示在分子质量约为70 kDa处出现明显条带，Western blotting能够识别LRRC15重组蛋白条带。结论　成功对猪囊尾蚴排泄分泌抗原中的LRRC15蛋白进行真核表达，并对其抗原表位进行了生物信息学预测，为进一步了解该蛋白的生物学功能奠定了基础。     

猪囊尾蚴排泄分泌抗原TPx蛋白的表达、纯化及其多克隆抗体制备

目的 原核表达猪囊尾蚴排泄分泌抗原(Excretory secretory antigen, ESA)硫氧还蛋白过氧化物酶(Thioredoxin peroxidase, TPx),并纯化TPx蛋白及制备兔多克隆抗体。方法 通过全基因合成的方法PCR扩增TPx基因。将扩增的TPx基因克隆至原核表达质粒pET30a载体中,构建重组质粒pET30a-TPx并转化至大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,通过异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,12%SDS-PAGE电泳分析蛋白表达情况。用Ni-IDA亲和层析柱进行纯化,Western blot鉴定TPx重组蛋白的纯化效果。用纯化的TPx重组蛋白免疫新西兰兔,制备TPx多克隆抗体,ELISA测定纯化抗体的效价。结果 成功构建重组质粒pET30a-TPx,经IPTG诱导表达,获得以可溶性形式高效表达的TPx重组蛋白,相对分子质量约为22.43×10³,纯化后的带有His标签的TPx重组蛋白能被兔抗血清识别。用纯化的TPx重组蛋白免疫新西兰兔,获得TPx多克隆抗体,其ELISA效价为1∶1 126 400,抗体纯度为85...     

猪带绦虫六钩蚴TSO45-4B抗原FnⅢ结构域线性B细胞表位预测及鉴定

目的预测并鉴定猪带绦虫六钩蚴TSO45-4B抗原FnⅢ结构域线性B细胞表位。方法利用生物信息学在线工具分析TSO45-4B抗原FnⅢ结构域序列并预测其线性B细胞表位;采用SWISS-MODEL软件预测TSO45-4B的蛋白空间结构,并合成两条预测表位肽。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测猪囊尾蚴病人血清与两条预测表位肽的免疫反应性。结果获得2个TSO45-4B抗原FnⅢ结构域线性B细胞预测表位,其中1条预测表位合成肽可为猪囊尾蚴病患者血清识别。结论成功预测并鉴定了猪带绦虫六钩蚴TSO45-4B抗原FnⅢ结构域线性B细胞表位。     

猪囊尾蚴囊液蛋白组学分析

目的利用鸟枪法技术鉴定猪囊尾蚴囊液蛋白组分构成,完善猪囊尾蚴蛋白表达谱,筛选特异性候选诊断标识并分析囊液蛋白组分的功能。方法无菌收集猪囊尾蚴虫体囊液,经处理后采用shotgun液相色谱-串联质谱系统对囊液进行分选与鉴定,通过Mascot 2.2软件进行数据库检索,完成蛋白鉴定。使用Blast2go软件对蛋白序列进行比对和注释,对注释的蛋白组分数据进行Gene Ontology (GO)分析。结果经鸟枪法分析共获得486个蛋白,通过Mascot 2.2软件检索已鉴定蛋白为158种,未知蛋白为328种。初步筛选囊液中含有丰度较高的8 kDa糖蛋白、膜联蛋白、烯醇化酶、胰蛋白酶样蛋白等4个猪囊尾蚴特异性抗原和多种酶类,主要存在于细胞及细胞组分中。其中膜联蛋白主要具有结合功能,主要参与一系列依赖于钙离子的膜型生物活动;烯醇化酶主要具有离子结合功能和水解酶活性,除大量富集在糖酵解途径中,还参与调节DNA结合转录因子过程。GO分析结果显示:蛋白谱分布细胞成分方面, 65个蛋白位于细胞中, 64个蛋白位于细胞组分中, 25个蛋白位于细胞器中,其余位于细胞器、蛋白复合物、细胞外区域和细胞膜中;蛋白谱分子功能方面, 72个蛋白具有催化活性, 74个蛋白具有结合功能,其余蛋白具有转运蛋白活性、分子功能调节剂、结构分子活性等功能;生物进程分类方面, 69个蛋白参与细胞进程,73个蛋白参与代谢进程, 11个蛋白参与生物调节、生物过程的调节、信号、对刺激的应答、定位等过程。结论经鸟枪法技术初步筛选出4个丰度较高可作为猪囊尾蚴病诊断标识的候选抗原,鉴定出的酶类可能在猪囊尾蚴与宿主互作过程中起相关作用。     

猪附红细胞体ORF5蛋白的空间结构与B细胞抗原表位预测

目的预测猪附红细胞体(Mycoplasma suis,M.suis)ORF5基因编码蛋白的二级结构及其B细胞抗原表位。方法联合应用生物信息学软件DNAstar与在线分析软件IEDB的B Cell Epitope Prediction Tools预测M.suis ORF5蛋白的二级结构及其亲水性区域、柔韧性区域、抗原指数、表面可及性等结构特征,经综合分析后预测其B细胞优势抗原表位。结果经分析可见,M.suis ORF5蛋白具有较为规则的二级结构,潜在的优势B细胞抗原表位为GGVDGGRD、GMRLPEDSR、EGHPDLESAR氨基酸区段。结论预测出M.suis ORF5蛋白二级结构和B细胞抗原表位,为M.suis免疫原性研究提供新手段,为病原微生物免疫原性研究提供新思路。     

猪囊尾蚴排泄分泌抗原TPx对仔猪树突状细胞活化的影响

目的 探讨猪囊尾蚴排泄分泌抗原（ESA）硫氧还蛋白过氧化物酶（TPx）对仔猪树突状细胞（DC）活化的影响。方法 体外诱导培养健康仔猪髓源DC，培养7 d后，加入终浓度为100 ng/ml的脂多糖（LPS）刺激，继续孵育2 d，分别收集培养未成熟DC (imDC)和成熟DC (mDC)，光学显微镜和扫描电镜下观察其培养1～9 d的形态学变化，流式细胞术检测其表面标志物CD1和主要组织相容性复合体Ⅱ（MHC-Ⅱ）的表达情况。另收集培养后7 d的imDC，设阴性对照组、TPx组、排泄分泌抗原（ESA）组、LPS阳性对照组，分别加入RPMI 1640培养基、 TPx (50μg/ml)、 ESA (50μg/ml)、 LPS (100 ng/ml)刺激48 h后，流式细胞术检测DC表面标志物MHC-Ⅱ、CD80、CD86的表达情况；ELISA检测DC细胞培养上清中肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白细胞介素6 (IL-6)、 IL-10、 IL-12的分泌水平。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。结果 光学显微镜下可见，培养第1天，imDC呈卵圆形，形态单一；随着培养...     

细粒棘球绦虫EGR＿09314蛋白的生物信息学分析

目的 利用生物信息学的方法预测、分析细粒棘球绦虫EGR＿09314蛋白的结构、功能和生物学特性等,为包虫病分子肽疫苗的筛选奠定基础。方法 从NCBI数据库中下载EGR＿09314基因的核苷酸序列及其所编码的氨基酸序列,利用ORF Finder在线工具分析该基因的开放阅读框;利用Prot-Param预测蛋白的理化性质,PotScale预测其亲水性和疏水性,NetPhos 3.1 Server预测其磷酸化位点,NetNGlyc预测其糖基化位点,GPS-SUMO 2.0预测其棕榈酰化修饰位点;利用SOPMA预测蛋白的二级结构,SWISS-MODEL预测蛋白的三级结构;利用Euk-mPLoc 2.0分析其亚细胞定位,SignalP 4.1Server分析其信号肽位置,TMHMM分析跨膜区域,SMART预测其结构域位置;应用ABCpred和IEDB预测EGR＿09314蛋白的B细胞抗原表位,应用SYFPEITHI和IEDB预测其T细胞抗原表位。结果 细粒棘球绦虫EGR＿09314蛋白是由491个氨基酸组成的亲水性蛋白,其分子式为C₂₄₄₆H₃₈₉₅N<...     

结核分枝杆菌Rv3407蛋白抗原表位的预测

目的预测结核分枝杆菌Rv3407的抗原表位。方法利用DNAStar软件包中Protean软件对Rv3407氨基酸序列进行分析,采用包括二级结构、亲水性、抗原性、表面可能性、柔韧性等多参数预测其二级结构及T细胞和B细胞抗原表位。结果 Rv3407蛋白具有丰富的二级结构和多处抗原指数较高的区段,潜在的B细胞抗原表位较少,可能位于11-26、28-43、50-61、66-74、76-99位氨基酸残基或其附近,这些区域基本上含有β转角结构,亲水性、表面可能性和柔韧性指数都较高。该蛋白潜在的T细胞抗原表位较多,可能位于2-12、22-26、34-37、40-44、56-60、75-79、86-93位氨基酸残基或其附近。结论结核分枝杆菌Rv3407是一个T细胞抗原表位占优势的蛋白抗原,B细胞抗原表位略少,预测结果为该蛋白抗原表位的进一步研究与应用奠定了基础。     

鼠疫耶尔森菌CAF-1基因的生物信息学分析及抗原表位预测北大核心CSCD

目的探讨鼠疫耶尔森菌CAF-1基因的组成结构及生物学功能。方法运用ProtScale,TMHMM Server,Signal P 3.0 Server,NetPhos3.0 Server,SOPMA,Swiss-mode和DNAStar等生物信息学软件分析鼠疫耶尔森菌CAF-1基因的氨基酸序列组成、理化性质、亲疏水性、信号肽、磷酸化位点、糖基化位点、二、三级结构和B、T细胞抗原表位等。结果 CAF-1是由170个氨基酸构成的富含苏氨酸的稳定亲水蛋白,相对分子质量为17.7×10~3,理论等电点为4.83,不含跨膜区且磷酸化程度较高。二级结构中β转角和无规则卷曲为主要结构原件,分别占41.18%和32.35%。同源建模显示,GMQE和QMEAN评估分值分别为0.90和0.76。抗原表位预测显示,该蛋白含有多个B细胞优势抗原表位和7个优势CTL表位。结论生物信息学预测CAF-1基因编码蛋白为稳定分泌蛋白和外膜蛋白,含有较多的B、T细胞抗原表位,具有较好的抗原性,可作为新型疫苗的潜在候选基因。     

恶性疟原虫MAL13P1.129基因的抗原表位预测及免疫学分析

目的 对恶性疟原虫MAL13P1.129基因的抗原表位进行预测,表达其重组蛋白并进行免疫学鉴定.方法 利用生物信息学分析方法对MAL13P1.129基因的线性抗原表位进行预测,从亲水性、表面可及性、柔韧性及二级结构等方面对抗原表位进行筛选.人工合成经密码子优化的MAL13P1.129基因,构建至PET32a(+)表达载...     

猪带绦虫重组抗原研究进展

猪囊尾蚴病(Cysticercosis cellulosae)俗称囊虫病(Cysticercosis)是由猪带绦虫(Taenia solium, Ts)中绦期幼虫猪囊尾蚴(cysticercus cellulosae)引起的一种严重的人兽共患寄生虫病。该病呈全球性分布,主要流行于中非、南非、拉丁美洲、东亚和南亚等地区。我国主要流行于黑龙江、吉林、河南、河北、山东、广西、云南、四川和贵州等31个省市自治区。采用分子生物学技术对Ts生活史不同阶段的抗原基因进行克隆、表达及生物学功能研究是当前研究的热点。本文就Ts六钩蚴、囊尾蚴、成虫阶段重要重组抗原的研究进展作一介绍。     

结核分枝杆菌Rv3134c蛋白抗原表位的预测

目的 预测结核分枝杆菌Rv3134c的抗原表位,了解其免疫学特性。方法 利用DNAStar软件包中Protean软件对Rv3134c氨基酸序列进行分析,采用包括二级结构、亲水性、抗原性、表面可能性、柔韧性等多参数预测其二级结构及T细胞和B细胞抗原表位,最后BLAST分析其与人类抗原表位的同源性。结果 Rv3134c蛋白具有丰富的二级结构和多处抗原指数较高的区段,含有较多潜在的B细胞抗原表位,可能位于1-7、30-37、65-81、89-100、111-120、138-148、184-195、209-216、233-238位氨基酸残基或其附近,这些区域基本上含有β转角结构,亲水性、表面可能性和柔韧性指数都较高。该蛋白潜在的T细胞抗原表位较少,可能位于62-76、89-97、185-195、203-213、219-231、248-255位氨基酸残基或其附近。BLAST分析结果显示,其与人类抗原表位的同源性很低。结论 结核分枝杆菌Rv3134c是一个即含有较多B细胞抗原表位又含有较多T细胞抗原表位的蛋白抗原,实验结果为该蛋白抗原表位的进一步研究与合成肽疫苗奠定了基础。     

结核分枝杆菌Wag31蛋白的生物信息学分析

目的运用生物信息学方法预测分析结核分枝杆菌Rv2145c基因编码蛋白Wag31的结构与功能。方法由NCBI数据库中获得Rv2145c基因及蛋白Wag31的编码序列,运用ProtParam及ProtScale对Wag31蛋白的基本理化特性及亲疏水性进行预测分析;运用NetPhos、TMHMM及SignalP 4.1分析Wag31的磷酸化位点、跨膜区结构及信号肽;分别运用SOPMA、SWISS-MODEL、ABCpred以及SYFPEITHI等工具预测Wag31蛋白的二级、三级结构以及抗原表位;运用STRING预测Wag31蛋白的相互作用蛋白,并进行富集分析。结果细胞壁合成蛋白Wag31由260个氨基酸组成,分子式为C_(1200)H_(1946)N_(370)O_(410)S_5,相对分子质量28.277 18×10~3,属于不稳定蛋白,具有亲水性;蛋白质二级结构分析显示,无规则卷曲(Cc)占24.23%,α-螺旋(Hh)、β-折叠(Ee)和β-转角(Tt)含量分别占73.08%、1.54%和1.15%。Wag31蛋白无信号肽和跨膜区结构,具有20个磷酸化优势位点,预测该蛋白含有25个B细胞抗原优势表位以及11个CTL细胞抗原优势表位;Wag31蛋白与GarA、PknA、PknB、FtsZ等蛋白相互作用,并参与多种生物过程。结论生物信息学分析Wag31蛋白具有潜在的B、T细胞抗原表位,能够磷酸化并与多种蛋白相互作用,可为研发结核病疫苗的候选蛋白。     

刚地弓形虫主要抗原B细胞表位的筛选及鉴定

目的筛选刚地弓形虫主要抗原B细胞表位并在原核表达载体中表达,对纯化的表位重组蛋白进行免疫反应性鉴定。方法用计算机软件BioSun、DNAstar综合分析6个弓形虫主要抗原的亲水性、可及性、柔韧性、二级结构、极性参数等,每一抗原分子预测2个最佳表位,设计合成24条共12对寡核苷酸,两端分别引入NocI、XhoI酶切位点,退火形成的双链定向克隆至原核表达载体pET-32c中,EcoRI单酶切鉴定重组质粒Epitope/pET-32c。将含有Epitope/pET-32c的BL21单菌落接种至LB肉汤培养基中培养,导入表达。表达产物用Ni2 螯合柱亲和纯化,免疫印迹试验(Westernblot)分析重组表位蛋白与弓形虫抗原免疫血清的免疫反应性。结果成功构建了12个原核表达质粒Epitope/pET-32c,并经测序证实,在E.coliBL21有11个表位基因能有效表达重组融合蛋白;纯化的表位蛋白大小均在20.0kDa左右;Westernblot结果显示表位蛋白SAG2-A、SAG3-B能被弓形虫抗原免疫血清识别,且反应较强,SAG2-B为弱阳性,其余的则不能被识别。结论成功筛选到3个弓形虫B细胞表位基因,为进一步构建弓形虫复合表位抗原诊断弓形虫病奠定了基础。     

恶性疟原虫传播阻断抗原的化学拼接与克隆

采用缺口填补法将恶性疟原虫有性期Pfs230和Pfs48／45抗原中的2个T细胞表位，3个B细胞表位以及人白介素-Ⅰ中的一个T细胞激活位点按预设方案，拼接成复合多价基因PfSI。复合基因全长147bP，编码43肽复合抗原，经分离、纯化后，插入质粒pcDNA3的多克隆位点，构建重组载体pcDNA3／PfSI。再将重组载体转化大肠杆菌JM109，用氨苄青霉素和PCR扩增法筛选阳性克隆，最后用限制性内切酶对阳性克隆进行鉴定。复合基因PfSI拼接、克隆的成功为在体外高效表达恶性疟原虫传播阻断抗原创造了条件。     

结核分枝杆菌PpiA蛋白的生物信息学分析及功能预测

目的应用生物信息学方法对结核分枝杆菌Rv0009基因编码蛋白PpiA的结构与功能进行预测和分析。方法由NCBI数据库中获得Rv0009基因及PpiA蛋白的相关序列信息;运用ProtParam及ProtScale对PpiA蛋白的理化特性和亲疏水性进行分析;运用NetPhos、TMHMM分析PpiA的磷酸化位点及跨膜区结构;分别运用SOPMA、SWISS-MODEL、ABCpred预测PpiA蛋白的二级结构和三级结构;运用SYFPEITHI软件进行抗原表位的预测分析;运用STRING预测PpiA的相互作用蛋白,并对其生物过程进行功能富集分析。结果结核分枝杆菌蛋白PpiA由182个氨基酸组成,分子式为C_(848)H_(1310)N_(238)O_(267)S_4,属于稳定的亲水性蛋白;其二级结构中无规则卷曲(Cc)含量占53.85%,α-螺旋(Hh)含量占18.68%,β-折叠(Ee)占20.88%,β-折角(Tt)含量占6.59%。PpiA蛋白无信号肽和跨膜区结构,具有14个磷酸化优势位点;该蛋白含有18个B细胞抗原优势表位以及3个CTL细胞抗原优势表位,其互作蛋白分别为groEL2、groEs、TB18.6、dnak、tpx和tur等,并参与多种生物学过程。结论生物信息学分析PpiA蛋白具有良好的抗原优势表位和氨基酸磷酸化位点,参与分子伴侣介导的蛋白质折叠、抵抗压力以及应激调节等生物学过程,是探索结核分枝杆菌持久性感染机制的重要研究靶标。     

猪囊尾蚴一种蛋白抗原的cDNA分子克隆

目的从猪囊尾蚴cDNA文库中克隆某种编码蛋白抗原的基因.方法用脑囊尾蚴病人血清筛选猪囊尾蚴cDNA文库,获得阳性克隆后,经PCR技术扩增噬菌体载体中插入的cDNA片段,并将其亚克隆入pUC18质粒载体中,用双脱氧核苷酸末端终止法测定插入片段的核苷酸序列.测序后与GenBank中的核苷酸序列进行同源性分析.结果经3次筛选,从cDNA文库中克隆出一个阳性克隆,测序后其长度为546 bp,含有一个开放读码框,编码158个氨基酸.同源序列分析结果表明此基因片段与编码猪囊尾蚴的一种免疫原性蛋白基因(NC-9)同源性高达99%.结论本研究克隆出一种编码猪囊尾蚴蛋白抗原的基因.     

结核分枝杆菌PPE32蛋白的生物信息学分析北大核心CSCD

目的应用生物学软件预测结核分枝杆菌PPE32基因编码蛋白的结构和功能。方法从NCBI中获得PPE32基因及其编码序列,通过ORF Finder、ProtParam、ProtScaleon Expasy、TMHMM Server v.2.0、SignalP 4.1 Server、TargetP 1.1 Server、NetPhos 3.1 Server、BLAST、SOPMA、SWISS-MODEL、ABCpred、SYFPEITHI、STRING等工具预测分析PPE32蛋白的相关生物学信息。结果 Rv1808基因全长为1 230 bp,有8个开放阅读框架,其编码蛋白为PPE32,由409个氨基酸组成,等电点4.35,为亲水性蛋白,无跨膜区域及信号肽;有31个磷酸化位点,1个保守域;蛋白二级结构中α-螺旋占52.81%,β-折叠占8.31%,β-转角占5.62%,无规则卷曲占33.25%;有38个(得分>0.5)B细胞抗原表位和12个(得分>15)T细胞抗原表位。讨论 PPE32蛋白为亲水性蛋白,具有潜在的T、B细胞抗原表位,可作为研发结核病疫苗的候选蛋白。     

猪囊尾蚴抗原基因GP50的表达及鉴定

目的为了寻找猪囊尾蚴病新的免疫学候选诊断分子,克隆猪囊尾蚴抗原GP50编码基因,并进行表达、鉴定。方法设计合成引物,用PCR法从猪囊尾蚴cDNA文库中扩增出猪囊尾蚴抗原GP50基因编码序列,将其克隆入pGEM-T载体,然后在真核表达载体pBKCMV中亚克隆,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Westernblot观察表达结果。结果RT-PCR法扩增出一条大小约897bp的特异性片段,克隆质粒pGEM-GP50和真核表达质粒pBKCMV作BamHⅠ和XhoⅠ双酶切和以重组质粒为模板进行PCR扩增,均可获得一条与PCR产物一致的DNA片段。诱导表达后,经SDS-PAGE可见一条约36kDa大小的融合蛋白条带,Western blot结果显示其可与猪囊尾蚴病人血清起反应。结论本实验成功地克隆了猪囊尾蚴抗原GP50编码基因,并在原核细胞中进行了表达及鉴定,为进一步的免疫诊断研究奠定了基础。