MERS-CoV S1蛋白的表达及鉴定

目的真核表达具有天然构象的中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)S1蛋白,并进行免疫反应性鉴定。方法以pcDNA3.1-S重组质粒为模板,PCR扩增S1基因,连接至pFastBac1质粒,构建重组质粒pFB1-S1。将pFB1-S1转化至DH10Bac感受态中,构建重组杆粒BpFB1-S1,然后转染sf9细胞获得重组杆状病毒rpFB1-S1并连续传代。将第四代rpFB1-S1接种sf9细胞后悬浮培养96h,取上清,用PEG8000浓缩并进行免疫亲和层析纯化,采用SDS-PAGE和Western blot鉴定其分子质量及免疫反应性;另取感染rpFB1-S1 48h的sf9细胞进行IFA鉴定。结果 S1基因PCR扩增产物大小为2 212bp,与预期相符。重组质粒pFB1-S1经酶切和测序分析鉴定构建正确。重组杆粒BpFB1-S1经PCR鉴定构建正确。IFA试验可见感染rpFB1-S1的sf9细胞出现特异性绿色荧光,即有目的蛋白表达。SDSPAGE显示纯化的重组S1为单一100×103(Mr)蛋白条带,Western blot检测该蛋白能被鼠抗S-RBD蛋白单克隆抗体识别。结论成功表达了具有免疫反应性的MERS-CoV S1蛋白,为MERS-CoV快速诊断方法的建立及候选疫苗的构建奠定了基础。     

新型冠状病毒Nsp16蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备北大核心CSCD

目的原核表达新型冠状病毒Nsp16重组蛋白并制备兔抗Nsp16多克隆抗体。方法通过琼脂糖凝胶电泳对含有Nsp16基因的重组质粒进行双酶切鉴定,并将鉴定后的重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞;通过IPTG诱导重组蛋白的表达,利用镍柱亲和层析法纯化该重组蛋白并进行Western blot鉴定;将鉴定后的目的蛋白与弗氏佐剂以1:1的体积比混匀,乳化后免疫新西兰大白兔,利用ELISA和Western blot分别进行多克隆抗体效价的测定及其特异性鉴定。结果Nsp16基因重组质粒经双酶切后得到912bp的目的片段,重组质粒转化大肠埃希菌表达出分子质量单位为33.3ku的重组蛋白,且主要存在于上清中。用纯化的重组蛋白免疫大白兔,获得兔抗Nsp16特异性多克隆抗体,且其效价达1:409600以上。结论重组Nsp16蛋白可以在大肠埃希菌中正确表达,免疫大白兔后获得高效价抗Nsp16多克隆抗体,即具有免疫反应性。为SARS-CoV-2Nsp16蛋白在新型冠状病毒肺炎中的进一步研究奠定了基础。     

流感病毒HA球状头部结构域在昆虫杆状病毒表达系统的表达及鉴定

目的通过昆虫杆状病毒表达系统获得具有良好免疫原性的流感病毒蛋白。方法将Hemagglutinin [Influenza A virus (A/California/09/2009(H1N1))进行截短,取57-271球状头部结构域氨基酸序列,在前面加Igκleader信号肽(METDTLLLWVLLLWVPGSTGD),设计H1HAHead基因。将基因序列按照昆虫细胞密码子偏好性进行优化、合成,通过EcoRI和HindIII双酶切克隆至pFastBAC HTA载体上,获得含有目的基因的重组质粒pFastBAC HTA-H1HAHead。利用热激法将重组质粒转化至大肠埃希菌DH10 Bac~(TM)感受态细胞,蓝白斑筛选获得重组杆状质粒rBacmid-H1HAHead。在脂质体的介导下,将重组杆状质粒转染至SF9细胞,对病毒进行拯救,转染后120 h,收取上清病毒液,盲传3代,获得SF9细胞,运用间接免疫荧光法(IFA)和Western blot检测目的蛋白的表达。结果经双酶切鉴定成功插入长度为762 bp的目的基因H1HAHead,通过脂质体介导长度为3 192 bp的重组杆状质粒rBacmid-H1HAHead构建成功。杆状病毒系统可表达目的蛋白,其分子质量单位28.25 ku,与预期一致。Western blot鉴定该蛋白能与特异性标签His-tag发生反应,IFA鉴定感染重组病毒的SF9细胞外源蛋白表达。结论通过昆虫杆状病毒表达系统成功表达目的蛋白,该蛋白有反应性,为流感抗体检测和新型疫苗的开发奠定了基础。     

重组人干扰素α-2b/免疫球蛋白G4 Fc融合蛋白在杆状病毒昆虫系统中的表达

目的 利用杆状病毒昆虫系统表达人干扰素(IFN) α-2b/免疫球蛋白(Ig)G4Fc融合蛋白(IFN/Fc),为长效干扰素的抗病毒治疗探索新方法.方法 利用分子克隆技术获得人IFN α -2b及IgG4 Fc基因cDNA,构建杆状病毒穿梭载体,在DH10 Bac菌株中转座获重组杆粒,转染昆虫细胞High five,Western blot检测目的蛋白表达,细胞病变抑制法检测生物学活性. 结果 穿梭载体在DH10 Bac中转座成功,获得重组杆粒Bacmid-IFN/Fc ; High Five细胞在病毒感染后72 h蛋白表达较好.病毒感染48 h即有少量目的蛋白表达,72 h表达量较高.Western blot结果显示在45×103处有特异性蛋白条带,体外抗病毒活性为580 IU/ml.结论 利用杆状病毒昆虫系统成功表达重组IFN/Fc融合蛋白,为新型长效干扰素研制及慢性病毒性肝炎治疗提供实验依据.     

人IL-2与EB病毒LMP1融合基因重组BCG的构建与表达

目的构建并鉴定人IL-2与EB病毒LMP1融合基因重组BCG(卡介苗)。方法利用RT-PCR从EB病毒阳性的B95-8细胞中获得去除致癌部分的LMP1基因,与扩增的IL-2通过overlap-PCR扩增获得融合基因。将融合基因连接到穿梭表达质粒pMV261,进行酶切、PCR及测序鉴定。重组质粒经电转导入BCG,通过Western blot鉴定目标抗原在rBCG中的表达。结果 PCR扩增获得453bp IL-2和1 225bp LMP1,利用overlap-PCR获得1 623bp的融合基因,通过电转仪将重组质粒导入BCG感受态细胞,构建的重组质粒能够在BCG中表达相对分子质量为5.7×104的目的蛋白,Western blot显示该蛋白能被兔IL-2单抗及鼠LMP1单抗识别。结论构建的rBCG能稳定表达融合蛋白,为rBCG的抗肿瘤作用和抗肿瘤疫苗的研发奠定了基础。     

SARS-CoV-2结构蛋白S和N的生物信息学比较分析及应用研究

目的 采用生物信息学方法分析新型冠状病毒(SARS-CoV-2)重要结构蛋白S和N。将S基因和N基因融合并构建重组质粒,重组质粒与骨架质粒在293T细胞中包装后获得重组腺病毒,为利用其融合基因进行疫苗研发提供理论和实验依据。方法 从NCBI数据库中获取S、N蛋白的基因组序列和氨基酸序列,采用生物信息学分析工具SOPMA、IEDB、BLAST、Immunomedicine Group、UniProt预测并分析S和N蛋白的理化性质、二级结构和三级结构、B细胞表位和T细胞表位、抗原决定簇以及相互作用蛋白。分别以S-pcDNA和N-pcDNA质粒为模板,以S-F1、S-F2和N-F3、和N-F4为引物PCR扩增目的基因;通过T4 DNA连接酶连接获得S基因和N基因的融合基因,以连接后的融合基因为模板,以S-F1和N-F4为引物采用重叠PCR扩增融合基因S-N。将融合基因S-N与穿梭表达载体pDC316-mCMV-EGFP连接,获得重组质粒,然后与骨架质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293T细胞,获得重组腺病毒。结果 S蛋白由1 269个氨基酸组成,分子式为C_...     

新型冠状病毒RBD区重组流感病毒的拯救及初步鉴定北大核心CSCD

目的利用流感反向遗传技术,以B型流感病毒B/Yamagata/16/88株作为骨架,表达新型冠状病毒(SARSCoV-2)S蛋白的受体结合域(RBD),构建以B型流感病毒为载体的新型冠状病毒疫苗候选株。方法基因合成新冠病毒参考株S蛋白上的RBD基因片段(318-541aa),对B型流感病毒B/Yamagata/16/88/的NS1片段进行设计改造并插入RBD序列,构建重组质粒NS110-RBD。将NS110-RBD与其余7个骨架株重组质粒共转染293T细胞和MDCK细胞,拯救表达新型冠状病毒RBD区重组流感病毒,对拯救出的毒株进行形态学、分子生物学鉴定及病毒滴度和Western blot检测。结果成功拯救出重组流感病毒株并命名为rIBV-NS110-RBD。PCR鉴定RBD目的基因大小正确,测序表明拯救病毒株的序列正确,在透射电镜下观察到拯救病毒株的病毒粒子具有流感病毒粒子的典型特征。经测定,拯救株rIBV-NS110-RBD在MDCK细胞上的病毒滴度为10^(5.5) TCID_(50)/ml,在鸡胚上的病毒滴度为10^(6.5) EID_(50)/ml,血凝效价最高达2_(5);Western Blot检测到RBD的表达,其分子质量为35ku。结论成功拯救出高表达新型冠状病毒RBD蛋白的高血凝效价的重组流感病毒株,该病毒具有流感病毒粒子的典型特征,为以B型流感病毒为载体作为新型冠状病毒疫苗的研发提供了新思路。     

恶性疟原虫pfK13-F446I基因重组杆状病毒质粒的构建及其在昆虫细胞SF9中的表达

目的构建恶性疟原虫Kelch 13-F446I(pfK13-F446I)基因重组杆状病毒质粒,并在昆虫细胞SF9中表达。方法体外合成恶性疟原虫Kelch 13野生型和F446I蛋白结构域片段碱基,定向克隆至转移载体pFastBac,构建pfK13-WT-Bac和pfK13-F446I-Bac质粒,转化大肠埃希菌DH10Bac感受态细胞后进行基因重组。提取重组病毒,PCR和Western blot验证后转染草地贪夜蛾细胞(SF9)。收集亲代重组病毒反复感染SF9细胞进行病毒扩增,优化可溶性蛋白的纯化条件,采用SDS-PAGE电泳分析重组蛋白表达情况。结果构建了含恶性疟原虫pfK13-F446I基因的重组质粒pfK13-F446I-Bac,大小约3 430 bp。转染SF9细胞后获得有感染力的重组杆状病毒,并在SF9细胞中表达pfK13-F446I蛋白,经梯度洗脱、去标签、透析等获得大小为44 ku的单一电泳条带的pfK13-F446I蛋白。结论成功构建pfK13-F446I基因重组杆状病毒质粒,并在昆虫细胞SF9中进行成功表达。     

人纤维介素蛋白2在昆虫杆状病毒系统中的表达及活性检测

目的:利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞(Sf9细胞)中表达人纤维介素蛋白2(hfgl2)凝血酶原酶并检测其蛋白活性.方法:首先将PCR扩增的目的基因hfgl2和pENTR/D-TOPO载体连接,再将pENTR/D-TOPO-hfgl2质粒与BaculoDirectTM线性DNA进行体外基因重组,采用脂质体转染法将重组DNA转染到生长良好的Sf9细胞中进行病毒包装,经过对重组杆状病毒三轮扩增后,用RT-PCR和Western blotting从基因和蛋白水平检测hfgl2表达情况,一期凝固试验检测其蛋白活性.结果:重组杆状病毒感染后,Sf9细胞停止生长,体积变大,细胞开始悬浮,破裂,呈现颗粒样外观.RT-PCR扩增和Western blotting从基因和蛋白水平证实Sf9细胞能够表达hfgl2,蛋白分子量约为63kDa.同时,在细胞上清液中检测到了可溶性hfgl2的表达,蛋白分子量约为50kDa.一期凝固试验证明表达的跨膜型hfgl2具有凝血活性.结论:hfgl2在昆虫杆状病毒表达系统中成功表达并具有生物学活性,为进一步研究hfgl2跨膜型以及可溶性蛋白功能提供了工具,亦可应用于开发重型肝炎蛋白芯片或ELISA诊断试剂盒.     

hTERT启动表达VacA基因的重组杆状病毒载体的构建

目的构建人端粒酶逆转录酶启动子(hTERT)调控的、携带幽门螺杆菌细胞空泡毒素A(Vacuolatingcytotoxin A,VacA)基因的选择性表达重组杆状病毒。方法应用酶切、连接方法将hTERT连接于杆状病毒穿梭质粒pFastBac~(TM)DUAL载体P10启动子序列之后,和SV40分别调控目的基因VacA的表达和终止;将重组穿梭质粒电转入DH10Bac~(TM)E.coli感受态细胞,经转座重组获得重组杆粒Bacmid-VacA。利用脂质体Cellfectin~将重组杆粒转染Sf9昆虫细胞,包装重组杆状病毒。结果应用PCR验证、双酶切分析、序列测定等方法验证重组质粒基因片段连接正确无突变,通过转座重组获得携带有VacA基因片段的重组杆粒。结论携带VacA基因的选择性复制重组杆粒成功构建。     

猴B病毒gB基因在昆虫细胞中的表达

为了研发猴B病毒ELISA检测试剂盒中替代全病毒的抗原。根据已报道的猴B病毒E2490株gB蛋白基因序列（genbank登录号：AF533768）人工合成gB基因,通过XbaⅠ和EcoRⅠ特异性酶切,将gB基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTA,经PCR、酶切、测序鉴定后,成功构建了携带gB基因的重组质粒pFastBacHTA-gB。该重组质粒转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10BAC感受态细胞,经抗生素、PCR筛选,获得转座的杆粒Bacmid-gB。在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,细胞变大变圆细胞核扩大,收获重组杆状病毒,再感染细胞,收获目的蛋白。通过SDS-PAGE和Western bloting及间接免疫荧光检测,结果表明该蛋白得到表达,且具有良好的生物活性,大小约为98kDa。实验结果表明已成功构建了携带目的基因的重组质粒pFastBacHTA-gB和转座的杆粒Bacmid-gB,转染后在sf9昆虫细胞上得到表达。此研究结果为下一步以表达的gB蛋白为诊断抗原,替代现阶段以病毒作为抗原的猴B病毒ELISA检测试剂盒的研制奠定了基础。     

狂犬病毒核蛋白基因的克隆表达及其免疫原性

目的构建狂犬病毒核蛋白(NP)基因的重组杆状病毒表达载体,在昆虫细胞中表达出具有免疫原性的抗原,用于狂犬病的检测及诊断。方法应用RT-PCR方法扩增ERA株狂犬病毒NP基因后克隆到PCR2.1TA载体,转化OneShortTMTOP10感受态细胞构建TA克隆载体,并与pFastBacTM1转座质粒载体分别用KpnΙ和NotΙ双酶切,用T4连接酶连接,构建pFast ERA-NP重组转座质粒,经双酶切、PCR扩增及插入序列方向鉴定后,转化到DH10BacTME.coli感受态细胞,经三抗培养基筛选和PCR扩增鉴定后获得重组Bacmid质粒,将重组Bacmid质粒转染Sf9昆虫细胞制备重组杆状病毒毒液,并继续扩增重组杆状病毒,以第三代毒液感染Sf9昆虫细胞,96h收获细胞,用直接免疫荧光(DFA)、SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行检测和分析。结果构建了含有ERA NP基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中获得表达。结论本研究成功表达出了具有免疫原性的狂犬病毒核蛋白。     

淡色库蚊抗性转录因子FTZ-F1蛋白原核表达与鉴定

目的 对淡色库蚊抗性转录因子FTZ-F1蛋白进行原核表达并鉴定。方法 对转录因子FTZ-F1蛋白进行生物信息学分析,包括蛋白的理化性质,二级结构及三维同源模型。采用PCR技术扩增FTZ-F1基因,比对分析后选取FTZ-F1基因保守区和功能区片段,片段长度为1122bp,然后将其连接至pET-32a(+)载体,构建重组质粒pET-32a(+)-FTZ-F1,再转化入感受态细胞BL21(DE3)后用IPTG诱导重组质粒pET-32a(+)-FTZ-F1的表达,运用SDS-PAGE和Western blot初步鉴定重组蛋白FTZ-F1的表达,采用His标签镍离子蛋白纯化柱对表达产物进行纯化和增加蛋白的量,用SDS-PAGE和Western blot鉴定重组蛋白FTZ-F1的表达。结果 FTZ-F1蛋白有744个氨基酸,相对分子质量为79.57×10³。1%琼脂凝胶鉴定PCR扩增为单一条带,大约为2 240 bp,测序结果表明重组质粒pET-32a(+)-FTZ-F1构建正确。采用SDS-PAGE检测重组蛋白FTZ-F1,结果表明蛋白FTZ-F1在原核表达系统中主要以可溶...     

大鼠髓样细胞表达激发受体-1／人IgG融合蛋白真核表达载体的构建表达与鉴定

目的 构建大鼠髓样细胞表达激发受体-1（TREM-1）/人IgG融合蛋白的真核表达载体,并在家蚕Bm细胞中实现稳定表达。方法 克隆大鼠TREM-1胞外段与人IgGFe段,片段连接后PCR扩增,再与病毒穿梭载体BAC1连接,基因克隆,构建重组质粒。利用杆状病毒表达系统（Bar-to-Bar）筛选重组杆状病毒,在Bm细胞中进行融合表达,并用Western blot法行蛋白鉴定。结果 重组质粒酶切测序正确,确认克隆载体构建成功。Western blot结果说明该蛋白样品可被抗大鼠TREM-1抗体特异性识别,证明该蛋白为TREM-1/IgG融合蛋白。结论 成功构建了大鼠TREM-1/IgG融合蛋白真核表达载体,并在Bm细胞中稳定表达。     

猪流感H1N1亚型NP基因杆状病毒表达载体构建及其在昆虫细胞中的表达

目的获得研发A型猪流感病毒ELISA检测试剂盒和制备NP蛋白单克隆抗体的抗原物质。方法根据已报道的猪流感病毒H1N1亚型NP基因序列(GenBank登录号:GQ422386)人工合成NP基因,通过XbaⅠ和EcoRⅠ特异性酶切,将NP基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTB,经PCR、酶切、测序鉴定后,获得携带NP基因的重组质粒pFast-BacHTB-NP。该重组质粒转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态细胞,经抗生素、PCR筛选,获得转座的杆粒Bac-mid-NP。在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒,再感染细胞,收获目的蛋白。结果通过SDS-PAGE和Westernblotting分析表明该蛋白得到表达,且具有良好的生物活性,大小约为57KD。结论实验结果表明已成功构建了携带NP基因的重组质粒pFastBacHTB-NP和转座的杆粒Bacmid-NP,转染后在sf9昆虫细胞上成功的表达。     

尘螨变应原Der f 2编码基因重组pCold TF体系构建及可溶性表达

目的建立尘螨变应原Der f 2编码基因重组pCold TF体系并诱导表达。方法以质粒pMD19-T-Der f 2为模板扩增目的基因Der f 2,克隆至pCold TF DNA载体,转化BL21细菌,用IPTG诱导表达,用SDS-PAGE和West-ern blot鉴定表达产物。结果 PCR扩增获得Der f 2编码基因,成功构建表达质粒pCold TF-Der f 2。SDS-PAGE检测表明该质粒在大肠埃希菌中正常表达,且基本为可溶性表达,表达产物分子质量单位为69ku,Western blot检测该蛋白能被鼠抗Penta-His抗体识别。结论成功建立尘螨变应原Der f 2编码基因重组pCold TF体系,并实现其可溶性原核表达。     

利用杆状病毒系统表达重组HBV聚合酶RT区段

目的利用杆状病毒表达载体系统制备重组HBV聚合酶RT区段蛋白。方法构建含有HBVP基因RT区段的杆状病毒转移载体pFastBac HT-RT，转化大肠埃希菌DH10B-ac进行重组，提取重组BacmidDNA质粒，转染昆虫细胞SD获得含有HBVP基因RT区段的重组杆状病毒。重组的杆状病毒再感染SO细胞进行HBVP基因RT区段蛋白表达，通过Western blot检测表达情况。结果成功构建了含HBVP基因RT区段的重组杆状病毒，昆虫细胞Sf9中能检测到HBVP基因RT区段蛋白的表达。结论利用杆状病毒表达系统能成功地表达HBVP基因RT区段蛋白。     

新型冠状病毒3C样蛋白酶的原核表达及其多克隆抗体的制备北大核心CSCD

目的表达及纯化新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)3C样蛋白酶(3-chymotrypsin-like protease,3CL^(pro))并制备3CL^(pro)多克隆抗体。方法将重组质粒pET28a-Proteinase_3CL-pro转化大肠埃希菌BL21(DE3),利用IPTG诱导重组蛋白表达,超声破碎后用SDS-PAGE凝胶分析蛋白表达情况,利用Ni-NTA进行重组蛋白的纯化。用重组蛋白免疫4~8周龄健康小鼠,制备多克隆抗体,通过Western blot和ELISA对抗体进行定性和定量检测。结果重组蛋白His-3CL^(pro)在重组菌培养上清中高表达,分子质量单位为33.8 ku。制备的多克隆抗体可特异结合重组蛋白3CL^(pro),ELISA检测血清抗体效价可达1∶204800。结论在大肠埃希菌中成功表达3CL^(pro),免疫小鼠并制备高效价的鼠抗3CL^(pro)多克隆抗体,为研究3CL^(pro)功能进而开发新型冠状病毒检测试剂盒及治疗药物奠定了基础。     

单纯疱疹病毒1型糖蛋白gD的表达纯化及多克隆抗体的制备

目的表达及纯化单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus type 1,HSV-1)糖蛋白D(glycoprotein D,gD)并制备多克隆抗体。方法双酶切pcDNA 3.1-HSV1-gD和pFastBacTM I质粒,gD基因克隆到pFastBacTM I载体,连接产物转化E.coli DH10Bac感受态细胞并鉴定重组杆状病毒质粒Bacmid-gD。将构建正确的重组杆粒转染Sf9细胞包装杆状病毒。杆状病毒经传代扩增后,诱导重组gD蛋白的表达,使用Ni-NTA亲和层析及凝胶过滤层析纯化重组gD蛋白,进行15%SDS-PAGE电泳鉴定并采用肽指纹图谱分析纯化的gD蛋白。将纯化的gD蛋白进行热稳定性试验检测其在不同缓冲液条件下的稳定性。用重组gD蛋白免疫小鼠,利用ELISA法检测血清抗体滴度。结果成功构建重组质粒pFastBacTM I-gD,转化E.coli DH10Bac感受态细胞后,经蓝白斑筛选鉴定重组杆状病毒质粒Bacmid-gD,鉴定正确的重组质粒感染Sf9细胞,包装出重组杆状病毒,获得滴度为8×108 pfu/ml的P3代杆状病毒。重组杆状病毒再次感染Sf9细胞能够表达高纯度可溶性的重组gD蛋白。不同缓冲液条件下重组gD蛋白稳定性良好。用gD蛋白免疫小鼠,获得ELISA效价为1×105的多克隆抗体。结论成功构建重组杆状病毒质粒Bacmid-gD,表达的HSV-1 gD蛋白稳定及免疫原性良好,制备的抗gD蛋白多克隆抗体滴度高,为HSV-1的亚单位疫苗的制备鉴定了基础。     

昆虫杆状病毒系统表达人流感多表位基因盒的研究

目的 通过昆虫-杆状病毒表达系统表达人流感病毒多表位基因盒,为进一步研发通用型流感疫苗提供实验依据。方法 将甲型流感病毒H1N1颈部区(345aa-566aa)和H1/H3/B亚型HA2片段经4GS Linker串联M2e及ferritin蛋白构成的HA2-M2e-ferritin(简称HMf),参照A/Jilin/JYT-01/2018(H1N1)毒株的全基因组序列,将其HA2基因和HMf基因序列按照昆虫细胞密码子偏好性进行优化合成,经两次双酶切后分别克隆至pFastBacTM双载体中。热激法将重组质粒转化入DH10BacTM大肠埃希菌感受态,含目的基因的pFastBacDual-HA2-HMf转移载体与DH10Bac的Bacmid质粒重组,构建重组转移质粒rBacmid-HA2-HMf。在脂质体介导下,用rB-HA2-HMf转染Sf9细胞进行重组杆状病毒的拯救。通过限制性酶双酶切、测序、重组Bacmid PCR、Western blot和间接免疫荧光法(IFA)鉴定目的蛋白的表达。用重组杆状病毒感染悬浮sf9细胞,收取细胞悬液,经超速离心、蔗糖密度梯度离心获得重组蛋白,利用透射电镜...