DcR3基因克隆、重组质粒构建及表达鉴定分析

目的研究DcR3a基因克隆、重组质粒构建及表达鉴定。方法采用PCR技术克隆DcR3cDNA编码序列，构建真核表达载体，然后检测重组DeR3／pAAV—IRES—hrGFP质粒在真核细胞中的表达。结果DcR3蛋白的表达正确。我们进一步用激光共聚焦显微技术成功检测到重组DeR3／pAAV—IRES—hrGFP质粒在真核细胞中的表达，并证明质粒中GFP与DcR3在真核细胞中的表达具有一致性。结论可以将重组质粒转染的真核细胞中GFP的表达作为DcR3表达的标志。     

PET32a-IL-1RⅠ重组质粒的构建及表达

目的 构建含有编码白细胞介素1 Ⅰ型受体(IL-1R I)胞外区蛋白基因的PET32a-IL-1RⅠ重组质粒,利用原核表达体系表达 IL-1RⅠ的胞外区蛋白.方法 从人白细胞中提取总RNA,采用聚合酶链反应(PCR)从总RNA中扩增出IL-1RⅠ胞外段基因,并将其插入PET32a质粒,构建重组质粒,化学法转化大肠杆菌D...     

MicroRNA-125a质粒表达载体的构建及其表达活性

背景：pSuper是一种非编码RNA的真核表达载体,可在细胞质内表达miRNA前体,经过细胞自身的Dicer酶切后形成miRNA成熟体,其过程能够完全模仿细胞内源性miRNA形成过程。因此,利用pSuper表达载体构建一种肝癌抑制性miRNA：miR-125a的表达载体,为下一步研究其抗癌机制奠定了基础。目的：构建miR-125a的真核表达质粒pSuper-miR-125a,并验证其表达miR-125a的效率和特异性。方法：PCR扩增miR-125a前体（Pre-miR-125a）的目的片段,将其T-A克隆入pMD18-T过渡质粒载体,限制性内切酶切下目的片段,连接入pSuper质粒表达载体得到pSuper-miR-125a重组质粒;将重组质粒转染Hela细胞,miRNA定量PCR检测重组质粒表达miR-125a的效率和特异性。结果与结论：成功将miR-125a前体（Pre-miR-125a）片段克隆入真核表达质粒pSuper H1启动子下游,获得pSuper-miR-125a重组表达质粒,转染该质粒进入Hela细胞后能够在细胞内高效和特异的表达miR-125a,进一步证明pSuper真核表达质粒适合miRNA的表达研究。     

MicroRNA-125a质粒表达载体的构建及其表达活性

背景:pSuper是一种非编码RNA的真核表达载体,可在细胞质内表达miRNA前体,经过细胞自身的Dicer酶切后形成miRNA成熟体,其过程能够完全模仿细胞内源性miRNA形成过程。因此,利用pSuper表达载体构建一种肝癌抑制性miRNA:miR-125a的表达载体,为下一步研究其抗癌机制奠定了基础。目的:构建miR-125a的真核表达质粒pSuper-miR-125a,并验证其表达miR-125a的效率和特异性。方法:PCR扩增miR-125a前体(Pre-miR-125a)的目的片段,将其T-A克隆入pMD18-T过渡质粒载体,限制性内切酶切下目的片段,连接入pSuper质粒表达载体得到pSuper-miR-125a重组质粒;将重组质粒转染Hela细胞,miRNA定量PCR检测重组质粒表达miR-125a的效率和特异性。结果与结论:成功将miR-125a前体(Pre-miR-125a)片段克隆入真核表达质粒pSuper H1启动子下游,获得pSuper-miR-125a重组表达质粒,转染该质粒进入Hela细胞后能够在细胞内高效和特异的表达miR-125a,进一步证明pSuper真核表达质粒适合miRNA的表达研究。     

HCV结构区重组质粒构建,蛋白表达及小鼠对重组质粒抗体 …

为进行ＨＣＶ－ＤＮＡ疫苗实验研究，通过分子克隆技术构建了ＨＣＶ－ＤＮＡ重组质粒（含有ＨＣＶ结构区基因片段１６９３ｂｐ，ＯｋａｍｏｔｏＩＩ型）将其转染到Ｈｅｌａ细胞中，蛋白抽提物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表明，重组质粒能表达约１１０ＫＤ的融合蛋白，经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实该融合蛋白为特异性的ＨＣＶ结构区蛋白。用核酸免疫方法，将构建的重组质粒注射ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，经ＥＬＩＳＡ检测到免疫鼠能产生特异性抗体。     

PEGFP-C1/U6质粒载体介导的表达MDR1 shRNA的质粒构建

为了构建pEGFP-C1／U6载体介导MDR1短发卡RNA（short hairpin RNA，shRNA）表达的质粒，针对MDR1的19碱基大小的片段．分别设计2对寡核苷酸，形成双链后将其依次连入带有U6启动子的pEGFP-C1载体（命名为pEGFP-C1／U6），两对DNA双链连接后形成中间由9个碱基序列间隔的反向互补序列，构建成能产生MDR1短发卡RNA的质粒。结果表明：经酶切、连接后构建成的质粒（pEGFP-C1／U6／A和pEGFP-C1／U6／B），经酶切与测序证实构建成功，无任何碱基突变。结论：成功构建了能表达MDR1 shRNA的质粒栽体pEGFP-C1／U6／A和pEGFP-C1／U6／B，此项研究结果可能为临床上逆转肿瘤多药耐药提供一种有效的方法。     

TCRγV1/pcDNA3重组质粒的构建

目的：构建含TCRγV1重排基因的真核表达质粒.方法：从人淋巴瘤Jurkat细胞中提取mRNA,用RT-PCR法扩增含BamHⅠ与HindⅢ酶切位点TCRγV1基因序列,对pcDNA3载体及TCRγV1基因PCR产物经双酶切,用连接酶将两者连接并转化到大肠杆菌DH5a,对重组质粒经序列测定,称pcDNA3/TCRγV1.结果：电泳获得333bp的TCRγV1预期条带.结论：该条带测序证实为TCRγV1基因序列.     

心脏转录因子GATA结合蛋白4真核表达质粒的构建

背景:有研究表明心脏转录因子GATA结合蛋白4(GATA4)与先天性心脏病的发生有密切的关系,但其机制不明,而目前尚未查及GATA4真核表达质粒构建类的报道.目的:构建人类心脏特殊转录因子GATA4的真核表达质粒.方法:对重组质粒pUC57-GATA4进行酶切获得GATA4基因编码区序列,将真核表达载体pCMV-Myc和GATA4基因在双酶切后用T4连接酶连接,构建重组质粒pCMV-Myc-GATA4,转化至大肠杆菌,提取质粒后经聚合酶链反应、双酶切及测序鉴定.结果与结论:实验成功酶切重组质粒获得GATA4基因编码区约1.3 kb的目的片段,聚合酶链反应和酶切鉴定以及基因测序结果显示,构建的重组真核表达质粒中含有正确的GATA4基因序列,证实成功构建了含有GATA4基因的真核表达重组质粒.     

结核分枝杆菌三种基因重组质粒的构建及原核表达

目的构建结核分枝杆菌ESAT-6、CFP10、phoS2/pET28a表达重组质粒,并原核表达重组蛋白。方法将目的基因亚克隆到pET-28a表达载体,转化入大肠埃希菌BL21（DE3）plysS,诱导表达重组蛋白ESAT-6、CFP10、phoS2。结果成功构建基因工程菌株ESAT-6、CFP10、phoS2/pET-28a/BL21（DE3）plysS,表达重组蛋白ESAT-6、phoS2,因以包涵体形式存在,无法纯化。结论成功构建结核分枝杆菌ESAT-6、CFP10、phoS2/pET28a重组质粒,分别表达分子量约10×103、31×103的ESAT-6、phoS2重组蛋白,但无法纯化,CFP10不表达。     

MDR1 shRNA表达质粒的构建

目的构建由pSIREN—RetroQ-ZsGreeen载体介导、表达MDR1短发卡RNA（shorthairpinRNA,shRNA）的重组质粒。方法分别针对MDR1基因的两个不同位点,按BamHI＋Sense＋Loop＋Antisense＋终止信号＋EcoRI结构合成编码shRNA的DNA序列及其反义序列,退火连接及磷酸化形成双链后,将其依次导入pSIREN—RetroQ—ZsGreeen载体,构建成能产生MDR1shRNA的质粒,并进行序列分析。结果重组质粒（pSIREN—RetroQ-ZsGreeen—A和pSIREN—RetroQ—ZsGreeen—B）经酶切与测序证实两段寡核苷酸片段成功插入到预计位点,序列完全一致,无任何碱基突变。结论MDR1shRNA的表达载体pSIREN—RetroQ—ZsGreeen—A和pSIREN—Ret—roQ—ZsGreeen-B成功构建,为进一步研究肿瘤多药耐药逆转奠定了实验基础。     

人乳头瘤病毒16型L1基因真核表达载体的构建及表达

目的从感染人乳头瘤病毒（HPV）的新鲜宫颈癌组织中扩增HPV16型晚期蛋白L1基因全长，构建表达载体，并验证目的蛋白的表达。方法根据基因全长设计一对特异引物，用PCR的方法从宫颈癌组织DNA，中获得L1基因，以pMD18T为克隆载体，构建重组质粒进行亚克隆，再以pcDNA3．1（＋）为载体构建表达质粒，转染至人肝细胞系H7702，提取蛋白，采用Western Blot方法检测HPV16-L1蛋白的表达。结果从长春地区宫颈癌临床标本克隆到的HPV16型L1蛋白编码序列与Genebank报道序列高度同源，其真核表达产物与特异性抗体能够特异性结合。结论成功构建重组表达质粒pcDNA3．1（＋）-HPV16-L1，为进一步研制HPV预防性疫苗创造基础条件。     

重组金属硫蛋白2A质粒的构建与表达

目的构建重组金属硫蛋白2A(MT-2A)原核表达质粒,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,为进一步研究MT-2A奠定基础。方法从人骨骼肌细胞cDNA文库中PCR扩增MT-2A基因DNA序列,构建重组表达质粒MT2A-pET32a,PCR与DNA测序法鉴定插入序列;重组细菌用IPTG诱导表达,His-bind亲和层析柱纯化MT-2A蛋白,Western blotting鉴定蛋白特性。结果扩增获得的MT-2A基因片段长186bp,DNA测序证实MT2A-pET32a重组质粒构建正确;表达的融合蛋白相对分子质量约为29×103,Western blotting证实为目的蛋白。结论成功构建了重组原核表达质粒MT2A-pET32a,在大肠埃希菌内诱导表达并纯化获得MT-2A。     

Deletions of p15 and p16 in schistosomal bladder cancer correlate with transforming growth factor-alpha expression

OBJECTIVES: Cell proliferation is stimulated by growth factors and inhibited by p15 and p16 gene products. We compared cell regulators, TGF-alpha, p15, and p16, in schistosomal and non-schistosomal bladder cancer to explore possible differences in their alterations between the two subtypes and their correlations with proliferation pattern [synthetic phase fraction (SPF)], DNA ploidy, and clinicopathological factors. METHODS: Tumor tissue samples were obtained from 120 patients. Expressions of p15 and p16 genes were investigated by the polymerase chain reaction, while TGF-alpha protein expression was measured by an enzyme immunoassay (EIA) method. RESULTS: Deletion of both p15 and p16 was observed in 62 and 46 bladder tumors, respectively. TGF-alpha was overexpressed in 64 bladder tumors. A highly significant association was observed between the two deleted genes and TGF-alpha positivity. Of the entire group, p15 and p16 alteration and positive TGF-alpha (> or =cutoff value) were significantly expressed in schistosomal bladder cancer (68.1%, 60.9%, and 65.2%), and squamous cell carcinoma type (SCC) (69.1%, 64.7% and 72.1%) compared to those with non-schistosomal bladder cancer (29.4%, 7.8%, and 37.3%) or transitional cell carcinoma (TCC) (28.8%, 3.8%, and 28.8), respectively. A significant association between p15 and p16 deletion and TGF-alpha positivity with high SPF, aneuploid DNA pattern, late stages, and high histological grades was also documented. CONCLUSION: Alteration of p15 and p16 genes and overexpression of TGF-alpha appears to be an event in bladder cancer that occurs more frequently in schistosomal bladder cancer and SCC, and may play an important role in their development. These observations may provide insight into treatment guided by molecular changes.     

重组DKK1及pCMV-HA2/DKK1重组质粒对宫颈癌细胞体外增殖作用的影响

摘要：目的：观察人重组DKK1和pCMV-HA2/DKK1重组质粒对体外培养宫颈癌细胞株Hela细胞增殖的影响。 方法：体外培养Hela细胞,非放射性细胞增殖（MTS）法检测重组DKK1、抗DKK1抗体和人源DKK1真核表达质粒pCMV-HA2/DKK1对Hela细胞增殖作用的影响,western blot及ELISA法检测转染pCMV-HA2/DKK1重组质粒后Hela细胞中DKK1蛋白的表达情况。 结果：与对照组相比,10,50 ng/mL的DKK1对Hela细胞有明显抑制作用（F分别为162.31,184.65,P均<0.01）;抗DKK1抗体对Hela细胞的增殖影响无统计学意义（P均>0.05）;pCMV-HA2/DKK1重组质粒转染Hela细胞后对细胞增殖有明显抑制作用,加入抗DKK1抗体不能完全拮抗pCMV-HA2/DKK1对Hela细胞的抑制作用;pCMV-HA2/DKK1重组质粒转染Hela细胞后可检测到DKK1蛋白表达,经western blot证实为DKK1蛋白（Mr约为38 000）,ELISA法结果表明,DKK1蛋白的分泌量随培养时间的延长而增加,第5天时达峰值(19.82 mg/L)。 结论：重组DKK1和人源DKK1真核表达质粒pCMV-HA2/DKK1可抑制Hela细胞的增殖,抗DKK1抗体可部分抵抗DKK1的抑制作用,提示DKK1在宫颈癌肿瘤发生中对肿瘤细胞具有抑制作用。     

Wnt7b重组反转录病毒载体的构建及其在C3H10T1/2中的表达

背景:诱导骨髓基质干细胞成骨条件的优化与探讨是再生医学研究的热点.前期实验发现Wnt7b在骨发育中的作用,此次实验是前期工作的延续.目的:构建Wnt7b重组反转录病毒载体,观察其在C3H10T1/2中的表达.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-01/2008-08在华盛顿大学医学院和同济大学附属第十人民医院中心实验室完成.材料:pXy-Wnt7b购于ATCC公司,载体pCIG-IRES-EGFP,pLef-Luciferase.pCMV-Rennilla.反转录病毒载体pSFG和包装细胞GP293由华盛顿大学医学院提供.方法:用多步亚克降技术构建目的基因Wnt7b和标记基因加强型绿色荧光蛋白(enhanced greenfluorescentprotein,EGFP)双表达重组反转录病毒载体pSFG-Wnt7b-IRES-EGFP,在条件培养液中经GP293包装,并任常规培养液中释放出假病毒并将其转染C3H10T1/2细胞,检测成骨活性诱导中的作用和荧光素酶报告基因检测信号转导通路.主要观察指标:①Wnt7b重组反转录病毒转染C3H 10T1/2细胞的表达.②wnt7b诱导C3H 10T1/2碱性磷酸酶生成分析.③Wnt7b信号转导分析.结果:构建日的基因的Wnt7b和标记基因EGFP双表达重组反转录病毒载体能够高效地表达,转染C3H10T1/2细胞后能诱导碱性磷酸晦的生成.Wnt7b信号转导分析可见Wnt7b成骨作用通过Noncanonical途径.结论:Wnt7b在C3H10T1/2中能高效表达,能显著诱导骨发育的重要标志--碱性磷酸酶的生成,Noncanonical途径在其中起重要作用.     

青岛地区汉族人群HPA-1—5,15多态性分布研究

目的研究青岛地区汉族人群人类血小板抗原(HPA)1-5,15抗原分布多态性。方法采用PCR-SSP方法对青岛地区918名无血缘关系固定血小板无偿捐献者进行HPA1-5及HPA-15系统的基因分型.结果各被检系统等位基因频率分别是1a=0.9940,1b=0.0060,2a=0.9319,2b=0.0681,3a=0.5822,3b=0.4178,4a=0.9897,4b=0.0104,5a=0.9804,5b=0.0196,15a=0.4913,15b=0.5087;HPA基因频率分布与国内资料比较,HPA-1与北方人群(河南),HPA-2与南方人群(四川)差异有统计学意义;与台湾人群HPA-2,-4,与日本人群HPA-2,-3,-5,与美国黑人HPA-1,-2,-5,与白人HPA-1,-4,-5,-15分别有统计学显著性差异。结论青岛地区汉族人群HPA分布具有本地人群特点。本组HPA数据分布符合Hardy-Weinberg平衡定律,可以作为北方汉族人群HPA基因分布频率数据库和青岛本地化血小板供者HPA资料库。     

构建重组大鼠pEGFP-N1-IGF-1基因表达质粒

目的：构建胰岛素样生长因子Ⅰ基因的真核表达质粒（pEGFP—N1—IGF—1），为基因治疗脊髓损伤提供前提。方法：实验于2005-04／06在上海基康生物公司实验室完成。应用反转录-聚合酶链反应方法从大鼠肝脏组织总RNA中提取并扩增胰岛素样生长因子Ⅰ基因的全长cDNA，并将该基因连接克隆到含有增强型绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP—N1上，以构建重组质粒pEGFP—N1—IGF—1。结果：实验从大鼠肝脏组织中提取总RNA，以反转录一聚合酶链反应方法获取编码胰岛素样生长因子Ⅰ基因的全序列cDNA。构建胰岛素样生长因子ⅠcDNA真核表达质粒时将能发出绿色荧光的增强型绿色荧光蛋白报告基因融合在胰岛素样生长因子l基因，并经酶切后DNA电泳鉴定及DNA测序证实。结论：构建重组质粒pEGFP—N1—IGF—1成功，实验中将能发出绿色荧光的增强型绿色荧光蛋白报告基因融合在胰岛素样生长因子Ⅰ基因的3’端，并以编码柔软肽段的核苷酸连接，即保留了胰岛素样生长因子Ⅰ的神经营养活性，又便于基因治疗中可检测到蛋白表达。     

Coordinate expression and trans presentation of interleukin (IL)-15Ralpha and IL-15 supports natural killer cell and memory CD8+ T cell homeostasis

The high affinity interleukin (IL)-15 receptor, IL-15Ralpha, is essential for supporting lymphoid homeostasis. To assess whether IL-15Ralpha's role in vivo is to trans present IL-15, we generated mixed bone marrow chimera from IL-15Ralpha- and IL-2/15Rbeta-deficient mice. We find that IL-15Ralpha-competent, IL-2/15Rbeta-deficient cells are able to support IL-15Ralpha-deficient natural killer (NK) and memory CD8+ T cells, thus ruling out secondary signals on these cells and demonstrating that IL-15Ralpha-mediated presentation of IL-15 in trans is the primary mechanism by which IL-15Ralpha functions in vivo. Surprisingly, using IL-15- and IL-15Ralpha-deficient mixed chimera, we also find that IL-15 and IL-15Ralpha must be expressed by the same cells to present IL-15 in trans, indicating that IL-15Ralpha is required on a cellular level for the elaboration of IL-15. These studies indicate that IL-15Ralpha defines homeostatic niches for NK and memory CD8+ T cells by controlling both the production and the presentation of IL-15 in trans to NK and CD8+ memory T cells.     

变异链球菌表面蛋白SpaP P区真核表达质粒的构建及表达

背景:变异链球菌是龋病的主要致龋菌,针对介导变异链球菌非蔗糖依赖性黏附的重要毒力因子SpaP的基因疫苗在理论上能对抗变异链球菌黏附于牙面和进一步破坏牙体硬组织.目的:构建变异链球菌表面蛋白P区(SpaP/P)真核表达质粒pVAX1-spapiP,并观察其在哺乳动物细胞COS.7中的表达.方法:通过基因重组技术,构建真核表达质粒pVAX1-spap/P,并经酶切分析、测序分析鉴定正确后,采用脂质体转染法,将其转染至COS-7细胞中,然后经免疫组织化学SABC法检测其在细胞中的表达.结果与结论:真核表达质粒pVAX1-spap/P经EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切分析,证实携带1.2 kb的目的基因spapiP片段,经测序分析,目的基因正向插入到预先设计的载体位点处.pVAX1-spap/P转染的细胞胞质呈褐色,pVAX1空载体质粒转染的细胞胞质中无着色.证实实验成功构建真核表达质粒pVAX1-spap/P,所携带的基因序列正确,能够在真核细胞COS-7中正确表达目的蛋白.