用Ku80 siRNA抑制Ku80基因表达以提高肺癌细胞放射敏感性的实验研究

目的探讨用小RNA干扰抑制Ku80基因表达以提高A549肺癌细胞的放射敏感性。方法设计并化学合成Ku80siRNA,转染体外培养的A549肺癌细胞。利用RT-PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白质水平对转染后的细胞Ku80基因表达情况进行测定,同时上述转染的细胞分别照射2、4、6、8及10Gy,利用克隆形成实验测定放射敏感性的变化。结果 RT-PCR检测显示在A549肺癌细胞转染Ku80siRNA后24、48和72h三个时间点Ku80mRNA含量减少,Western blot分析显示在转染48和72h两个时间点Ku80蛋白含量减少,与对照组比较有统计学差异（P〈0.05）。克隆形成实验提示A549肺癌细胞转染Ku80siRNA后放射敏感性增强。结论 Ku80siRNA转染A549肺癌细胞后能够有效抑制Ku80基因表达,提高其放射敏感性。     

Ku80在人肺癌中的表达水平与放疗前后表达变化的实验研究

目的：基于Ku80在辐射诱导的DNA修复中的作用,研究不同病理类型肺癌中Ku80的表达水平,并以人肺癌A549细胞接种裸鼠模型评估放疗对Ku80表达的影响。方法使用免疫组化及荧光定量PCR分别检测不同病理类型肺癌Ku80蛋白和mRNA的表达水平。将A549细胞接种到裸鼠上再以不同剂量的射线照射,并分别在24、48h后处死,用免疫组化及荧光定量PCR检测Ku80蛋白和mRNA的表达水平。结果肺癌组织表达的Ku80蛋白、mRNA水平高于正常肺组织（均P＜0.01）。在肺癌亚组中,肺腺癌和鳞癌比小细胞肺癌表达更高的Ku80蛋白、mRNA水平（均P＜0.01）。接种在裸鼠的人肺癌A549细胞经过不同剂量射线照射后Ku80 mRNA的表达增加,并具有剂量和时间依赖性。结论 Ku80在放疗引起的DNA破坏过程中起到重要的作用。肺鳞癌和腺癌的Ku80表达高于小细胞肺癌,这可能是肺鳞癌和腺癌放射敏感性逊于小细胞肺癌的原因之一。Ku80表达水平可能在预测肺癌的放射敏感性方面具有重要价值,可以成为肺癌放射增敏治疗的一个新靶点。     

Ku70乙酰化在硒诱导人肺腺癌A549细胞凋亡中的作用

目的探讨Ku70乙酰化在硒诱导人肺腺癌A549细胞凋亡中的作用。方法将体外培养的人肺腺癌A549细胞分为对照组(用含体积分数10%胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基培养)和1、5、10μmol·L~(-1)硒处理组(分别用含1、5、10μmol·L~(-1)硒的达尔伯克改良伊格尔培养基培养),分别培养24、48 h,通过Western blot法检测Ku70表达,免疫沉淀法检测乙酰化Ku70和Ku70-Bax、Bax-Ku70的表达。将Ku70 siRNA转染后的人肺腺癌A549细胞分为对照组和1、5、10μmol·L~(-1)硒处理组,通过Western blot法检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达。结果与同一时间点对照组比较,1μmol·L~(-1)硒处理组Ku70、Bax、Bcl-2、乙酰化Ku70、Ku70-Bax和Bax-Ku70表达差异无统计学意义(P>0.05);与同一时间点对照组、1μmol·L~(-1)硒处理组比较,5、10μmol·L~(-1)硒处理组Ku70、Bcl-2、Ku70-Bax和Bax-Ku70表达均减少(P<0.01),Bax、乙酰化Ku70表达均增加(P<0.01);与同一时间点5μmol·L~(-1)硒处理组比较,10μmol·L~(-1)硒处理组Ku70、Bcl-2、Ku70-Bax和Bax-Ku70表达均减少(P<0.01),Bax、乙酰化Ku70表达均增加(P<0.01)。与本组24 h时比较,48 h时1μmol·L~(-1)硒处理组Ku70、Bax、Bcl-2、乙酰化Ku70、Ku70-Bax和Bax-Ku70表达差异无统计学意义(P>0.05);与本组24 h时比较,48 h时5、10μmol·L~(-1)硒处理组Ku70、Bcl-2、Ku70-Bax和Bax-Ku70表达减少(P<0.05),Bax、乙酰化Ku70表达增加(P<0.05)。结论硒通过促使Ku70乙酰化诱导Bax依赖性人肺腺癌A549细胞凋亡。     

人肺腺癌细胞A549放射治疗前后Dystrobrevin蛋白表达的变化

目的射线诱导肺腺癌A549细胞凋亡,于凋亡高峰时检测放疗前后dystrobrevin的表达,探讨其与放射剂量及凋亡的关系。方法人肺腺癌A549细胞株培养24 h后用10 Gy X线照射,分别培养6 h、14 h、23 h、40 h,应用Hoechest33258荧光染色在荧光显微镜下观察细胞形态变化——细胞的凋亡,并计算凋亡率。采用Western blot检测0 Gy、6 Gy、10Gy照射A549细胞14 h后dystrobrevin蛋白表达水平的变化。结果 10 Gy X射线照射A549细胞株后14 h凋亡率达到高峰。Western blot检测显示,随着放射剂量的增加,α-dystrobrevin有下降的趋势,而ε-dystrobrevin有升高的趋势。结论人肺腺癌A549细胞株在能量为6-MV,剂量率为300 cGy/分,接受10 Gy X线照射后14 h出现明显的凋亡;并且在此时间点上随着放射剂量的增加α-dystrobrevin和ε-dystrobrevin变化趋势不同。     

肺腺癌A549细胞中Nestin的表达

目的探讨nestin在肺腺癌A549细胞中的表达及意义.方法体外培养肺腺癌A549细胞株,用免疫组化检测肺癌标记物及nestin表达.结果四个肺癌标记物中鼠抗人p63蛋白,鼠抗人细胞角蛋白7,鼠抗人甲状腺转录因子染色阳性,nestin在肺腺癌A549细胞中部分细胞表达.结论肺癌细胞中存在部分神经干细胞的标记物nestin.     

制滴菌素A治疗人肺腺癌细胞A549裸鼠移植瘤的实验研究

目的　探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂制滴菌素A (trichostatinA ,TSA)对人肺腺癌细胞A5 4 9裸鼠移植瘤的治疗作用。方法　建立人肺腺癌细胞A5 4 9裸鼠模型 ,瘤内注射TSA和 0 9%生理盐水 (NS) ,对治疗前后的裸鼠进行瘤重量、瘤体积、细胞形态和凋亡的观察。结果　在实验组和对照组之间 ,瘤重量差异有显著性 (P <0 0 5 ) ;TSA治疗 1周和 2周后瘤体积与治疗前瘤体积相比 ,差异无显著性 (P >0 0 5 )。NS治疗 1周后瘤体积与治疗前相比差异无显著性 ,而治疗 2周后瘤体积与治疗前相比 ,差异有显著性 (P <0 0 5 )。电镜下可见肿瘤细胞的凋亡现象经TSA干预后明显增多。结论　TSA治疗人肺腺癌细胞A5 4 9裸鼠模型有效。     

人肺腺癌A549细胞系干细胞样细胞的培养检测及其抗顺铂能力的研究

目的:从人肺腺癌A549细胞系中培养获得含干细胞样细胞的球细胞(Sphere细胞),检测相关标志物表达及其对顺铂的耐药性.方法:采用含特定生长因子的无血清培养基诱导A549细胞的Sphere细胞形成,用亲脂荧光染料标记技术和免疫荧光法检测Sphere细胞中干细胞的存在,用流式细胞术检测干性标志物CD133,OCT4,C...     

肺腺癌A549细胞株细胞活力变化及GDNF表达

目的探讨GDNF在肺腺癌A549细胞株的表达及细胞活力变化.方法体外培养肺腺癌A549细胞株,观察细胞形态变化.取第1代培养后1 d,5 d两个时间点分别计数细胞;MTT检测两时间点细胞活力变化;用免疫组化检测两时间点GDNF免疫阳性细胞数量变化.并进行统计学分析.结果培养5 d组肺腺癌A549细胞株的细胞数量与1 d组相比,明显增加（P〈0.05）;5 d组的细胞活力较1d组明显下降（P〈0.05）;GDNF的表达百分数比较显示;5 d组亦较1 d组明显下降（P〈0.05）.结论体外培养肺腺癌A549细胞株随细胞增殖过程,活力逐渐下降,同时GDNF表达明显下调,提示细胞增殖和细胞活力不一定完全一致,GDNF减少可能与活力减少有关.     

异钩藤碱脂质体逆转人肺腺癌细胞A549／DDP对顺铂耐药的研究

目的研究异钩藤碱脂质体(Isorhynchophylline Liposomes,IR-L)在体外对人肺腺癌细胞系A549/DDP对顺铂(DDP)的逆转作用。方法采用MTT法检测药物细胞毒性作用及耐药细胞逆转倍数,电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法测定细胞内顺铂浓度。结果IR-L无细胞毒浓度组(2.0μg/mL)使A549/DDP细胞对DDP的IC50由16.81 mg/L降至3.36 mg/L;低细胞毒浓度组(7.0μg/mL)的IC50降至2.34 mg/L;两组均明显提高DDP在A549/DDP细胞内的浓度,从0.92μg/L分别提高到4.62μg/L和6.89μg/L。结论IR能部分逆转A549/DDP细胞的MDR,其作用机制可能与增加细胞内药物浓度有关。     

DNA—PK亚单位Ku70、Ku80在不同分期乳腺癌中的表达情况

目的探讨不同期别乳腺癌组织中DNA依赖蛋白激酶（DNA dependent protein kinase,DNA-PK）的两个调节亚单位Ku70、Ku80的表达变化情况．方法采用免疫组化SP法检测Ⅰ～Ⅳ期乳腺癌组织各30例中的Ku70、Ku80的表达情况．结果Ku70、Ku80在Ⅰ期乳腺癌组织中呈高表达,在Ⅱ期中的表达有降低趋势（与Ⅰ期比较P〈0．01,与Ⅲ期比较P〉0．05,与Ⅳ期比较P〈0．01）,在Ⅲ、Ⅳ期乳腺癌组织中的表达明显低于Ⅰ期乳腺癌（P〈0．01;P〈0．01）．结论Ku70、Ku80在不同阶段乳腺癌中的表达情况是随着乳腺癌的分期变化而变化,从早期、中期到晚期呈逐渐降低趋势,可能与乳腺癌的分期及预后有一定相关性．     

短干扰RNA抑制人宫颈癌HeLa细胞Ku80基因表达

目的 针对内源性Ku80基因序列体外构建短干扰RNA（siRNA）线性DNA转录载体，观察其在细胞内产生的siRNA对该基因表达的影响。方法 构建的线性DNA转录载体经脂质体导入宫颈癌HeLa细胞内，转录产生21bp的短双链siRNA，并用免疫印迹法分析Ku80基因在蛋白水平表达的情况。结果 体外成功构建出siRNA线性DNA转录载体LS1／LAS1和LS2／LAS2；载体分别导入HeLa细胞内生成相应siRNA；与空白对照组比较，实验组均能特异性抑制Ku80基因的表达；其抑制效果和时间点与所选基因靶位相关。结论 由线性DNA载体转录生成的siRNA在细胞内特异性抑制内源性基因表达，为Ku80用于肿瘤靶向基因治疗提供了一个新的实验依据。     

靶向Ku70基因siRNA对人肺腺癌细胞顺铂耐药性的逆转作用

目的：研究Ku70与人肺腺癌耐药的相关性,观察调控Ku70表达能否逆转人肺腺癌耐药细胞系（A549/DDP）的耐药性。方法：采用RT-PCR、Western Blotting方法比较Ku70在人肺腺癌亲代细胞（A549）与耐药细胞系（A549/DDP）的表达水平。转染靶向Ku70基因siRNA（si-Ku70）的A549/DDP细胞作为实验组,转染非特异性siRNA（si-Scramble）的A549/DDP细胞作为阴性对照组,同时设空白组(A549/DDP细胞)。加药组在转染后48 h给予顺铂。应用MTT法检测各组细胞在顺铂作用下的生存率,并计算半数抑制浓度（IC₅₀）,采用流式细胞仪定量检测细胞凋亡率;采用分光光度法检测Caspase-3活化程度。结果：Ku70 mRNA和蛋白在A549/DDP细胞表达水平显著高于其亲代A549细胞（P<0.01）;靶向Ku70的siRNA（si-Ku70)明显下调A549/DDP细胞的Ku70 mRNA和蛋白表达水平（P<0.01）;在不同浓度顺铂作用24 h后,实验组细胞的生存率明显低于阴性对照组和空白组（P<0.01）。6 mg/L顺铂作用24 h后,实验组细胞凋亡率及Caspase-3活化程度高于阴性对照组和空白组（P<0.05）。结论：Ku70在人耐药肺腺癌细胞呈现高表达,提示Ku70参与肺腺癌耐药的形成;靶向Ku70siRNA导入人肺腺癌耐药细胞可特异性下调Ku70的表达,促进肺腺癌耐药细胞凋亡,逆转其耐药性,Ku70可能成为逆转肺癌耐药的一个新的分子靶点。     

人体内肺癌细胞Ku80蛋白含量与顺铂化疗敏感性的关系研究

目的探讨患者体内肺癌细胞Ku80蛋白含量与其对顺铂敏感性的相关性。方法收集肺癌患者胸腔积液中的肺癌细胞进行体外原代培养,通过传代进行纯化和扩增后进行实验。体外药敏试验采用CCK-8法测定肺癌细胞对顺铂的敏感性,获得各样本的半数抑制浓度(IC50)。利用Western blot法测定各样本细胞内Ku80蛋白含量。分析Ku80蛋白含量与顺铂敏感性的相关性。结果非小细胞肺癌(NSCLC)组IC50为(4.40±3.39)mg/L,小细胞肺癌(SCLC)组IC50为(1.02±0.54)mg/L,二者比较差异有统计学意义(P0.001)。NSCLC组Ku80蛋白相对含量为0.80±0.45,而SCLC组为0.48±0.25,二组之间比较差异有统计学意义(P0.05)。通过相关性分析得到肺癌患者Ku80含量与IC50呈正相关(r=0.618,P0.001)。结论 NSCLC患者Ku80基因表达高于SCLC患者,可能与NSCLC对化疗敏感性差有关。肺癌细胞Ku80蛋白含量与其对顺铂敏感性呈负相关。Ku80蛋白含量可作为预测肺癌患者以铂类为基础的化疗敏感性的候选指标。     

缺氧微环境下人肺腺癌A549细胞的microRNA基因芯片结果分析

目的  研究缺氧对肺腺癌A549细胞中microRNA（miRNA）表达谱的影响,分析靶基因参与的生物学功能和通路。方法  基于miRNA芯片技术和生物信息学分析方法,分析缺氧条件和正常氧条件下培养的A549细胞中差异表达的miRNA,并预测该miRNA的靶基因,分析靶基因参与的生物学功能和通路。结果  本研究共筛选出14个差异表达miRNA,包括9个在缺氧细胞中上调miRNA和5个下调miRNA。上调和下调miRNA的靶基因都参与DNA转录、核染色质修饰等功能,并且都参与Wnt信号、转化生长因子-β信号和丝裂原活化蛋白激酶信号通路。结论  缺氧的肺腺癌A549细胞中miRNA表达谱发生显著改变,一些差异表达miRNA对某些基因具有调控作用。

     

八宝丹处理肺腺癌细胞A549和SPCA-1对顺铂化疗敏感性的影响

目的：探讨八宝丹处理人肺腺癌A549和SPCA‐1细胞系对顺铂（DDP）抗肿瘤化疗敏感性影响。方法收集人肺腺癌A549和SPCA‐1细胞系进行不同处理,随机分为对照组（空白）、DDP组（4 uM ）、（八宝丹＋DDP）组（0.75 mg／kg＋4 uM ）,处理3周,采用MTT法检测细胞增殖能力;末端脱氧核苷酸转移酶介导的d UTP缺口末端标记测定（TUNEL）法检测细胞凋亡率,采用transwell检测细胞迁移能力。结果与对照组比较,DDP组和（八宝丹＋DDP）组的 A549和SPCA‐1细胞增殖能力明显降低（P＜0.01）;与DDP组比较,（八宝丹＋DDP）组的A549和SPCA‐1细胞增殖能力无明显差异（P＞0.05）。与对照组比较,DDP组和（八宝丹＋DDP）组的A549和SPCA‐1细胞凋亡明显增加（P＜0．01）;与DDP组比较,（八宝丹＋DDP）组的A549和SPCA‐1细胞凋亡明显增加（P＜0.05）。与对照组比较,DDP组和（八宝丹＋DDP）组的A549和SPCA‐1细胞迁移数目明显降低（P＜0.01）;与DDP组比较,（八宝丹＋DDP）组的A549和SPCA‐1细胞迁移数目明显降低（P＜0.001）。结论（八宝丹＋DDP）可以增加肿瘤细胞的凋亡,降低肿瘤细胞的增殖,减少 A549和SPCA‐1细胞迁移数目,增加肿瘤细胞的DDP抗肿瘤敏感性。     

人野生型survivin-1基因重组载体的构建及其在A549中的表达

目的克隆细胞凋亡抑制蛋白Survivin异构体之一Survivin-1（SVV-1）基因的编码序列，构建含SVV-1基因的真核细胞表达载体并在肺腺癌细胞系A549中高表达，为进一步研究该基因在肺腺癌发病中的作用奠定基础。方法根据已发表的SVV-1基因的核苷酸序列自行设计一对分别合有BamHⅠ和XhoⅠ双酶切住点的survivin-1基因上下游引物，以A549细胞系抽提的R．NA为模板进行逆转录聚合酶链反应（RT—PCR），扩增产物用BarnHⅠ和XhoⅠ双酶酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3．0中，用限制性内切酶酶切重组质粒pcDNA30-SVV-1和DNA序列测定进行鉴定。用脂质体法将pcDNA3.0—SVV-1导入肺腺癌细胞系A549中，嘌呤霉素选择培养，经免疫组化法和western blot鉴定其表达。结果RT—PCR扩增出长448bp的特异性片段，经克隆至pcDNA3．0后酶切鉴定证实，并测序表明序列与Gen—Bank报道完全一致。pcDNA3．0—SVV-1在A549细胞中有稳定表达。结论成功克隆了SVV-1的编码序列，构建了其真核细胞表达载体pcDNA3．0-SVV-1，有助于对SVV-1基因在腺癌发生中的致瘤机制做进一步研究。     

DNA pol β,Ku80与鼻咽癌放射敏感性的关系

目的:研究人鼻咽癌细胞系CNE-2Z亚克隆株F1、S1放射后DNA修复相关基因DNA pol β和Ku80的表达,探讨CNE-2Z存在放射敏感性异质性的可能机理。方法:裸鼠体内移植瘤实验观察F1、S1放射后的体内增殖能力,采用Western blot、免疫细胞化学和免疫组织化学方法检测放射后F1和S1 DNA修复相关蛋白(DNA pol β、Ku80)的表达,Feulgen染色法和图像分析方法检测放射后F1、S1裸鼠体内移植瘤的DNA倍体及细胞周期分布情况。结果:未照射前F1细胞DNA pol β和Ku80的表达高于S1;放射后S1细胞DNA pol β及Ku80表达上调的时间较F1早,上调辐度大于F1。鼻咽癌细胞系CNE-2Z确实存在放射敏感性的异质性,放射后S1体内增殖能力大于F1,较多细胞处于有利于DNA修复的G2/M期(P<0.01)。放射后F1、S1裸鼠移植瘤细胞和组织中,DNA pol β和Ku80蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论:本实验进一步证实了鼻咽癌细胞系CNE-2Z确实存在放射敏感性的异质性,F1、S1放射敏感性的差异与两株细胞的DNA修复相关基因(DNA pol β、Ku80)的表达差异所致的DNA SSB、DSB修复的速度和忠实性有关。