小鼠PD-L1真核表达载体的构建及其在CHO细胞中的稳定表达

目的构建含有小鼠PD-L1基因的真核表达载体,并通过转染获得稳定表达小鼠PD-L1分子的CHO细胞系。方法从小鼠脾细胞总RNA逆转录的cDNA中扩增出PD-L1基因,通过双酶切（XhoI和EcoRI）装入真核表达载体pIRES2-EGFP中,脂质体法转染CHO细胞,经G418筛选后,建立稳定高表达PD-L1分子的CHO细胞系。结果构建了真核表达载体pIRES2-EGFP／PD-L1,建立了稳定表达PD-L1目的基因的CHO细胞系。结论成功构建了PD-L1真核表达载体并获得了稳定表达该分子的CHO细胞系为后续研究奠定了物质基础。     

S1P1真核表达载体的构建及在HEK293细胞膜上的表达

目的构建含人Ⅰ型1-磷酸鞘氨醇受体(SIPI)-全长cDNA序列及HA和/或EGFP标签的真核表达载体,并观察其在HEK293细胞上的表达。方法合成2条HA寡核苷酸,克隆入S1P1-Myc-EGFP-N1载体。以HA-S1P1-Myc-EGFP-N1为模板,用PCR的方法扩增HA-S1P1并克隆入pcDNA3.1(+)载体。限制性酶切消化、PCR、测序的方法鉴定,载体经Polyfect转染入HEK293细胞。G418筛选出稳定细胞株。用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测S1P1在HEK293细胞上的表达。结果限制性酶切消化、PCR、测序结果证实载体构建成功。S1P1表达在HEK293稳定细胞株的表面。结论成功构建带有HA和/或EGFP标签的S1P1真核表达载体,表面表达S1P1的HEK293稳定细胞株可作为我们进一步研究的细胞模型。     

稳定表达GlyRα1的HEK293细胞系的建立

目的:建立稳定表达甘氨酸受体α1亚基(GlyRα1)真核表达载体的人胚肾细胞(HEK293)细胞系.方法:构建pcDNA3.1-GlyRα1真核表达载体,应用脂质体介导的转染技术将该质粒导入HEK293细胞,再用G418筛选表达稳定的细胞系.真核细胞中GlyRα1的表达分别用RT-PCR与Western blot方法检测.结果:在7株转染并经G418反复筛选的HEK293细胞系中,有4株细胞系明显表达GlyRα1的mRNA及其蛋白质,其余3株细胞表达较弱或者没有表达.结论:用pcDNA3.1-GlyRα1转染的HEK293细胞经G418筛选,可成功建立GlyRα1稳定表达系.     

Survivin干扰RNA载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

目的:探索合成survivin siRNA和RNAi载体的构建,及其在HEK293细胞中的表达?方法:分别采用化学合成的针对survivin的siRNA和shRNA载体(pGCsi载体),转染HEK293细胞后观察HEK293细胞中survivin的RNA及蛋白表达?结果:不同序列的siRNA和shRNA转染入HEK293细胞后,survivin的RNA及蛋白表达出现不同程度的下降?结论:化学合成与shRNA载体均可有效抑制HEK293细胞的survivin基因表达,为利用survivin作为靶点治疗胰腺癌等恶性肿瘤提供了技术基础?     

pEYFP-hApelin-R重组真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的构建与增强型黄色荧光蛋白（EYFP）融合的人Apelin-R（Human Apelin receptor,hApelin-R）真核表达载体,用于Apelin-R介导的细胞内信号转导机制研究。方法以质粒pcDNA3.1-hApelin-R为模板,PCR方法扩增人Apelin-R。扩增的Apelin-R产物与质粒pEYFP-C1按常规方法酶切、连接、转化,并经酶切和测序进行鉴定。将重组质粒用脂质体法转染HEK293细胞,Western blot鉴定人Apelin-R的表达。用Apelin-13诱导后,共聚焦显微镜观察受体在细胞内的位移。结果扩增出了一条1143 bp的基因片段,序列与GenBank（NM_005161）相同。在69 kDa处有一蛋白条带,与预期大小相同。人Apelin-R表达在细胞膜上。诱导30 min后,发生受体向胞浆的位移。结论成功构建了pEYFP-hApelin-R重组表达载体,建立了该质粒转染HEK293的细胞模型。可用于Apelin-R介导的细胞内信号转导机制研究,其结果有助于寻找其作为药物的靶点。     

pB2 R-Venus 重组真核载体的构建及在 HEK293T细胞中的表达

目的：构建带有黄色荧光蛋白突变体 Venus标签的人缓激肽2型受体（bradykinin receptor 2, B2R）真核表达载体,用于B2R与相关受体及蛋白的相互作用、B2R受体介导的信号转导机制的研究等。方法根据人B2R基因序列设计引物,以质粒pcDNA3．1-B2R为模板,PCR扩增目的基因人B2R。EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切扩增产物及质粒pVenus-N1,经回收、连接、转化,获取重组质粒。对重组质粒进行酶切、测序鉴定。转染重组质粒至 HEK293T细胞,荧光显微镜观察受体B2R的细胞定位,蛋白印迹法检测目的蛋白人B2R蛋白的表达。结果 PCR扩增出了1条长度为1176 bp的基因片段,测序结果与GenBank （AY275465）相同。荧光显示B2R表达于质膜。Western blot结果显示,实验组蛋白印迹条带与目的蛋白大小相同,为44kDa。结论成功构建了pB2R-Venus重组真核表达载体,瞬时转染成功,获得了转染有重组质粒的HEK293T细胞。成功构建的重组质粒pB2R-Venus可用于后续BRET、FRET等实验研究,有助于B2R介导的信号转导机制的探讨和药物靶点的寻找。     

pcDNA3-MAGE-1真核表达载体的构建及其在Hepal-6细胞中的稳定表达

目的:构建真核表达载体,并在小鼠肝癌Hepa1-6细胞中稳定表达,观察转染细胞的增殖能力和致瘤能力。方法:用PCR方法扩增SMMC-7721人肝癌细胞株MAGE-1全长序列,连接到真核表达载体pcDNA3中,构建真核表达pcDNA3-MAGE-1,脂质体法转染小鼠Hepa1-6细胞。G418筛选阳性克隆(Hepa1-6- MAGE-1),用RT-PCR和Western blotting检测阳性克隆中mRNA和蛋白质的表达;MTT 法检测Hepa1-6细胞和Hepa1-6- MAGE-1细胞生长和增殖的变化;分别以Hepa1-6细胞和Hepa1-6- MAGE-1细胞接种于C57BL /6j小鼠右侧背部皮下,观察Hepa1-6- MAGE-1细胞的致瘤能力。结果:构建MAGE-1的真核表达载体转染Hepa1-6细胞,PT-PCR与Western boltting检测分别在Hepa1-6- MAGE-1细胞中检测到人MAGE-1基因的mNRA和蛋白质的表达,两组细胞增殖无统计学差异;两组各10只小鼠均皮下成瘤,且肿瘤大小没有明显差异。结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3-MAGE-1,获得了稳定表达人MAGE-1基因的小鼠肝癌Hepa1-6细胞株,并具有很好的增殖和致瘤能力。     

pcDNA3-MAGE-1真核表达载体的构建及其在Hepal-6细胞中的稳定表达

目的:构建真核表达载体,并在小鼠肝癌Hepal-6细胞中稳定表达,观察转染细胞的增殖能力和致瘤能力.方法:用PCR方法扩增SMMC-7721人肝癌细胞株MAGE-1全长序列,连接到真核表达载体pcDNA3中,构建真核表达pcDNA3-MAGE-1,脂质体法转染小鼠Hepal-6细胞.G418筛选阳性克隆(Hepal-6-MAGE-1),用RT-PCR和Western blotting检测阳性克隆中mRNA和蛋白质的表达;MTT法检测Hepal-6细胞和Hepal-6-MAGE-1细胞生长和增殖的变化;分别以Hepal-6细胞和Hepal-6-MAGE-1细胞接种于CA7BL/6j小鼠右侧背部皮下,观察Hepal-6-MAGE-1细胞的致瘤能力.结果:构建MAGE-1的真核表达载体转染Hepal-6细胞,PT-PCR与Western bohting检测分别在Hepal-6-MAGE-1细胞中检测到人MAGE-1基因的mNRA和蛋白质的表达,两组细胞增殖无统计学差异;两组各10只小鼠均皮下成瘤,且肿瘤大小没有明显差异.结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3-MAGE-1,获得了稳定表达人MAGE-1基因的小鼠肝癌Hepal-6细胞株,并具有很好的增殖和致瘤能力.     

人TLT-2真核表达载体的构建及其在L929细胞株中的稳定转染

目的构建含有人TLT-2基因的真核表达载体,并通过转染获得稳定表达TLT-2分子的L929转基因细胞株。方法运用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术从健康人外周血单个核细胞（PBMC）的cDNA文库获得全长TLT-2基因,经过双酶切（XhoI和EcoRI）装入逆转录病毒表达载体pIRES2-EGFP中,脂质体法转染L929细胞,经G418抗性筛选,流式细胞术、RT-PCR及Western blot鉴定TLT-2分子的表达。结果构建了真核表达载体pIRES2-EGFP/hTLT-2,建立了稳定转染TLT-2目的基因的L929细胞株。结论成功构建了TLT-2真核表达载体并获得了稳定转染该分子的转基因细胞,为进一步研究人TLT-2分子的生物学功能提供了物质基础。     

人Ism1表达载体的构建及其在293T细胞的表达

目的:构建人Ism1基因真核表达载体,并验证其在真核细胞中的表达,为相关研究奠定基础。方法:采用高保真DNA聚合酶和GC缓冲液从A549细胞扩增获取人Ism1编码序列全长,经酶切、连接、转化后,挑取阳性克隆进行菌液PCR、双酶切,及测序鉴定;用构建成功的Ism1表达载体转染293T细胞,用实时定量RT-PCR检测Ism1表达水平。结果:构建的Ism1载体经菌液PCR,双酶切鉴定后,测序结果完全正确,载体转入293T细胞后,Ism1表达量显著上升。结论:成功构建能在真核细胞中表达的人Ism1基因载体,将为相关研究提供便利。     

稳定高效表达正反义Alu-Sx细胞系的建立

目的建立稳定高效表达正反义Alu-Sx的细胞系.方法根据Alu亚家族Sx序列合成两对两端带有限制性酶切位点的引物,提取HEK293细胞的总DNA后PCR扩增,产物连接到真核表达载体pcDNA3.1/myc-His A中构建成重组体.经酶切及测序鉴定后,阳离子脂质体转染法转染HEK293细胞后G418筛选稳定表达的细胞克隆,Northern杂交检测并挑选出表达最强的亚克隆.结果成功构建Alu亚家族Sx的正反义真核表达载体并获得高效稳定表达的HEK293细胞亚克隆.结论高效稳定表达正反义Alu Sx的HEK293细胞亚克隆可用于下一步研究.     

人MCHR1真核表达载体的构建

目的 构建人MCHR1真核表达载体.方法 采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR1基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),酶切和测序鉴定.结果 酶切和测序鉴定正确,表明pcDNA3.1( )/MCHR1真核表达载体构建成功.结论 pcDNA3.1( )/MCHR1真核表达载体成功构建,为进一步研究MCHR1的功能提供了良好的实验基础.     

人促甲状腺激素受体HEK 293T细胞稳定表达株的构建

目的 构建人促甲状腺激素受体（hTSHR）稳定表达株,用于研究抗甲状腺新药。方法 AgeⅠ/NheⅠ双酶切载体GV266和hTSHR基因,T4连接酶连接构建GV266-hTSHR表达质粒。转染GV266-hTSHR到293T细胞后,Western blot证明hTSHR表达。用Opti-MEM、Lipofectamine 2000、辅助质粒在293T细胞构建GV266包装质粒。qPCR测定包装病毒滴度。用GV266包装质粒、GV266-hTSHR表达质粒共转染293T细胞获得GV266-hTSHR-293T稳定表达株。绿色荧光蛋白(GFP)荧光鉴定稳定表达株。结果 GV266-hTSHR构建物阳性大肠杆菌克隆的DNA测序结果与hTSHR序列比对100%吻合。Western blot显示,过表达hTSHR的 HEK 293T细胞出现相对分子质量为62×103的目的条带。qPCR测定包装质粒滴度达到了2×108 TU/mL。GV266-hTSHR-293T细胞稳定表达株表达GFP荧光。结论 构建了GV266-hTSHR表达质粒,获得了GV266-hTSHR-HEK 293T稳定表达株,为研究抗甲状腺多肽提供了必要的实验材料。     

LyGDI真核表达载体构建及稳定转染A549细胞株的建立

目的构建Rho蛋白鸟苷解离抑制因子（LyGDI）真核表达载体并建立稳定转染A549细胞株。方法PCR扩增LyGDI基因片段,构建pEGFP-C1-LyGDI真核表达载体,经酶切、PCR、测序验证其正确性。脂质体法转染真核细胞A549,G418筛选建立稳定转染的细胞株,RT-PCR、免疫印迹检测稳定转染的细胞株。结果构建了真核表达载体并建立了稳定转染的A549细胞株,成功表达LyGDI蛋白。结论LyGDI真核表达载体成功构建及稳定转染A549细胞株的建立,为研究LyGDI过度表达对肿瘤侵袭性和转移的影响奠定了实验基础。     

先天性长QT综合征KCNQ1基因真核表达载体的构建及表达

目的　在原核表达载体pSP6 4 KCNQ1的基础上 ,构建KCNQ1的真核表达载体。方法　先将pSP6 4 KC NQ1通过限制性酶切得到KCNQ1cDNA ,将后者克隆入 pEGFP N1中 ,构建中间过渡载体 pEGFP KCNQ1;将pEGFP KCNQ1和 pIRES EGFP分别用NheⅠ和EcoRⅠ双酶切 ,把KCNQ1cDNA克隆到 pIRES EGFP ,即构建了pIRES EGFP KCNQ1。然后利用Effectene转染试剂介导将pIRES EGFP KCNQ1转染HEK2 93细胞。 结果　在原核表达载体 pSP6 4 KCNQ1的基础上 ,获得了KCNQ1的真核表达载体 pIRES EGFP KCNQ1,并使其在HEK 2 93细胞中成功表达。结论　该法可成功构建、表达KCNQ1的真核表达载体 ,为进一步的功能研究奠定了基础。     

稳定表达肌肉型乙酰胆碱受体的细胞株建立和鉴定

目的:建立稳定表达骨骼肌细胞乙酰胆碱受体(AChR)的人胚肾(HEK293)细胞系,进行各种药理学研究.方法:将编码小鼠m-nAChR的α、β、γ、δ和ε亚基的cDNA分别重组于真核细胞表达质粒pcDNA3.1,用脂质体转染技术将重组质粒导入HEK293细胞,使其细胞膜上分别表达胚胎型乙酰胆碱受体(γ-nAChR)和成年型乙酰胆碱受体(ε-nAChR).用G418和免疫荧光技术筛选出稳定表达两种受体亚型的细胞株. 结果:在G418反复筛选后的HEK293细胞系中,有14株明显表达ε-nAchR;4株明显表达γ-nAchR,受体大部分表达于细胞膜上. 结论:用重组后的pcDNA3.1转染HEK293细胞,经筛选后可以稳定表达m-nAChR.     

G418抗性HEK293细胞的培育

目的　培育具有G418抗性的HEK2 93细胞 ,用于建立猪内源性反转录病毒感染人HEK2 93细胞的模型。方法　通过脂质体转染的方法 ,将含有neo基因的质粒pIRESneo导入HEK2 93细胞中 ,利用G418的选择特性 ,对转染细胞进行压力筛选 ,并对其进行了PCR鉴定。结果　经 6 0 0 μg ml的G418压力筛选后 ,获得了抗性细胞克隆。抗性细胞的形态和生长速度与筛选前细胞没有差异 ,特异性核苷酸引物检测抗性细胞基因组DNA ,可以扩增出对应的核苷酸片段。结论　成功地培育了G418抗性HEK2 93细胞 ,为建立猪内源性反转录病毒感染人HEK2 93细胞的模型奠定了基础。     

GST pulldown技术检测HEK293T细胞Daam1的活性

目的:运用GST pulldown技术建立真核细胞中Daam1活性检测的可靠方法?方法:构建GST-RhoA的原核表达载体,并使其在大肠杆菌BL21菌株中大量表达?用GST pulldown和Western blot技术分别检测HEK293T细胞中活化的Daam1及Daam1蛋白的表达?结果:在成功构建了GST-RhoA的原核表达载体,并使其在原核细胞中大量表达融合蛋白GST-RhoA后,用GST pulldown和Western blot技术证实HEK293T细胞中有活化的Daam1和Daam1总蛋白的表达?结论:本工作所建立的GST pulldown技术可以检测HEK293T细胞中Daam1的活性,从而为进一步深入研究Daam1在真核细胞中的功能提供了技术保障?