小鼠骨髓树突状细胞pcDNA3-hCEA转染疫苗的抗瘤作用

目的:将pcDNA3-hCEA转染小鼠骨髓树突状细胞 (DCs),观察其诱导BALB/c小鼠对CT2 6(hCEA⁺)的抗肿瘤免疫效应。方法:采用rmGM-CSF和rmIL-4体外诱导培养小鼠骨髓DCs;构建真核表达质粒pcDNA3-hCEA;并用lipofectamine将其转染DCs,制备DCs(pCDNA3-hCEA)疫苗;同时制备CT2 6(hCEA⁺);采用RT-PCR检测DCs(pCDNA3-hCEA)中CEAmRNA的表达,采用放射免疫法检测DCs(pCDNA3-hCEA)培养上清中CEA的含量;使用DCs(pCDNA3-hCEA)疫苗体外诱导小鼠同种异体T淋巴细胞靶向性杀伤。采用DCs(pcDNA3-hCEA)疫苗预防免疫BALB/c小鼠,观察其对于荷临界致瘤量CT2 6(hCEA⁺)小鼠的抗肿瘤效应。结果:经G₄₁₈筛选,DCs(pCDNA3-hCEA)有14 %的获得率;RT-PCR检测表明DCs(pCDNA3-hCEA)内CEAmRNA呈阳性表达;放射免疫法检测表明DCs(pCDNA3-hCEA)能微量表达人CEA;DCs(pCDNA3-hCEA)能够有效诱导CEA靶向免疫杀伤。DCs(pcDNA3-hCEA)疫苗延长荷CT2 6(hCEA⁺)瘤小鼠生存期1周至 4周。结论:编码肿瘤抗原基因的真核表达质粒转染的树突状细胞,能够诱导较强的特异性抗肿瘤免疫效应.     

中国强毒钩端螺旋体膜蛋白基因的真核表达及基因免疫

目的　检测含有强毒赖型钩体OmpL1外膜蛋白基因的 2个重组质粒pBC OmpL1和pcDNA3 OmpL1在哺乳动物细胞中的表达 ,及其作为DNA疫苗诱导小鼠体液免疫应答的效果。方法　采用脂质体转染法 ,以重组质粒转染COS7细胞 ,通过抗性标志筛选稳定转染入质粒的细胞 ,RT PCR和Westernblot检测被转染细胞OmpL1基因的表达情况。然后 ,将重组质粒以肌注法免疫BALB c小鼠 ,每 2周 1次 ,共 3次 ,ELISA检测小鼠的体液免疫应答水平。结果　RT PCR结果显示 ,重组质粒转染组在约 1kb处出现特异的扩增带 ;Westernblot检测显示 ,重组质粒转染组总蛋白样品在相对分子质量 (Mr)为 33.5× 10 3 处出现特异的蛋白带 ,而空质粒载体转染组均没有此相应的DNA或蛋白质条带。两质粒第 2次免疫小鼠 2周后 ,10 0 μg重组质粒pBC OmpL1和pcDNA3 OmpL1DNA免疫组产生了效价为 1 196 83的高滴度抗体 ,注射 5 0 μgpcDNA3 OmpL1+5 0 μgpcDNA3的小鼠产生滴度为 1 6 5 6 1较高的抗体 ,第 3次免疫 2周后 ,抗体水平下降。结论　两重组质粒者均能在体外培养的哺乳动物细胞中表达钩体OmpL1蛋白质 ,以其免疫小鼠后 ,均诱导产生高滴度的特异性抗体 ,其效价与全钩体疫苗相当。     

HCV-NS3重组腺病毒转染树突状细胞体内诱导抗原特异性Th1应答的研究

目的:探讨表达丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白(NS3)基因的重组腺病毒转染树突状细胞体内诱导特异性Th1细胞免疫应答。方法:分离培养小鼠骨髓树突状细胞,制备表达HCV-NS3蛋白的重组腺病毒转染树突状细胞(DC-AdNS3)疫苗,采用流式细胞术和免疫印迹法分析鉴定细胞及抗原蛋白表达。采用腹腔注射途径免疫接种BALB/c小鼠两次,每次间隔10天,3×105细胞/次。末次接种10天后,采用ELISPOT法和ELISA法分别测定脾NS3特异性分泌IFN-γ的T细胞反应以及细胞因子水平。结果:重组腺病毒转染DC可刺激DC成熟,同时可在DC内成功表达NS3蛋白。小鼠两次接种DC-AdNS3产生明显升高的分泌IFN-γ的T细胞反应(P<0·01),脾T细胞悬液内可测得高水平的IL-2和IFN-γ(P<0·01)以及显著降低的IL-10(P<0·05)。结论:DC-AdNS3疫苗可在BALB/c小鼠体内激发产生抗原特异性的Th1细胞免疫应答,为抗HCV感染的疫苗研究提供参考依据。     

植烷酸氧化酶真核表达载体的构建及其细胞内定位

目的构建小鼠植烷酸氧化酶（Phyh）真核表达载体,并观察其在NIH3T3细胞中的表达定位情况。方法提取BALB/c小鼠肝脏组织的总RNA,通过RT-PCR扩增得到Phyh编码序列,将其克隆到真核表达载体pcDNA3上;对阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定,利用脂质体转染方法转染NIH3T3细胞;使用细胞免疫化学技术对重组质粒pcDNA3/HA-Phyh在NIH3T3细胞中的表达及蛋白定位进行分析。结果 PCR、双酶切和测序鉴定表明,pcDNA3/HA-Phyh真核表达质粒构建正确;转染实验发现,该质粒能够在NIH3T3细胞中表达,表达产物主要定位在细胞质中。结论成功构建了带HA标签的小鼠Phyh真核表达载体,该载体能够在哺乳动物细胞NIH3T3中表达,为进一步研究Phyh的细胞内生物学功能提供了一个重要的工具。     

布氏杆菌PBP39/pCDNATE重组表达质粒的构建及免疫效果的研究

目的构建pBp39/pCDNATE重组表达质粒,免疫BALB/c小鼠观察诱导的特异性体液免疫、细胞免疫及免疫保护效果.方法克隆PBP39基因,构建PBP39/pCDNATE重组表达质粒.首先转染Cos-7细胞,免疫组化检测其PBP39蛋白抗原的表达.然后用PBP39基因疫苗肌肉注射免疫BALB/c小鼠4次,观察特异性体液免疫和细胞免疫效果.进一步用1.25×104布氏杆菌544A强毒株腹腔攻毒,观察PBP39重组表达质粒的免疫保护效果.结果扩增的PBP39保护性抗原基因片段在牛、羊和猪布氏杆菌株中具有高度保守性,构建的PBP39/pCDNATE重组表达质粒在Cos-7细胞中有目的蛋白的表达.制备的PBP39重组表达质粒肌肉免疫BALB/c小鼠4次,ELISA检测PBP39重组表达质粒产生了较高水平的特异性IgG抗体,并随免疫次数增加抗体的滴度也递增,抗体亚型以IgG2a为主,表明诱导了TH1型的免疫应答.MTT测定PBP39重组表达质粒的淋巴细胞增殖能力与对照组差异有统计学意义.布氏杆菌A544强毒株攻毒后,动物存活及脾组织细菌数与对照组比较差异有统计学意义,说明PBP39重组表达质粒能够产生有效的保护效果.结论研制的PBP39重组表达质粒免疫BALB/c小鼠能产生高水平的特异性抗体和细胞免疫,且以细胞免疫为主,并产生有效的免疫保护效果,为布氏杆菌病新型疫苗的研究奠定了基础.     

乙型肝炎病毒重组多表位抗原诱发的小鼠免疫应答

目的:对乙型肝炎病毒重组多表位抗原基因在大肠杆菌中表达的融合蛋白P/BPT进行免疫原性分析,以期为HBV预防/治疗性疫苗的研制奠定实验基础。方法:构建重组质粒pWR450-1/BPT,在大肠杆菌中诱导表达并纯化蛋白P/BPT,免疫BALB/c小鼠,乳酸脱氢酶释放法检测该融合蛋白诱导小鼠的细胞毒T淋巴细胞(CTL)应答,ELISA法检测小鼠血清抗-P/BPT抗体水平,流式细胞仪检测小鼠CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群比例,用RT-PCR方法半定量检测细胞因子特异性mRNA,MTT法测淋巴细胞增殖效应。结果:P/BPT蛋白免疫后,效靶比为100:1时,可有效诱发特异性CTL应答(P<0.05);ELISA方法测出小鼠血清抗-P/BPTIgG明显升高(P<0.05);P/BPT蛋白免疫后,可显著刺激小鼠脾淋巴细胞增值(P<0.05);CD4+T淋巴细胞和细胞因子IFN-γ的增殖和分泌水平亦有明显升高。结论:该融合蛋白可有效诱导小鼠体液免疫和细胞免疫应答,为进一步研制乙肝预防治疗性疫苗奠定了初步基础。     

BALB/c小鼠I-Adαβ链编码基因真核双顺反子载体的构建及表达

目的：为了获取BALB／c小鼠I-A^d α、β链编码基因，构建真核双顺反子表达载体并在NIH3T3细胞中表达，建立BALB／c小鼠MHC-Ⅱ抗原递呈细胞研究模型。方法：采用Trizol提取BALB／c小鼠脾细胞总RNA，RT-PCR获取I-A^d αβ链cDNA，连接pGEMT载体测序，正确后亚克隆至plRES真核双顺反子表达载体；用Lipofectamine2000转染NIH3T3细胞，G418筛选转染克隆株。RT-PCR鉴定外源基因在mRNA水平的表达；流式细胞术（FCM）鉴定外源基因在蛋白质水平的表达以及在细胞表面展示的水平。结果：建立了BALB／c小鼠I-A^d αβ链编码基因真核双顺反子表达载体plRES-I-A^d αβ；plRES-I-A^d αβ转染NIH3T3细胞，在G418筛选下可获得高达72％的转染细胞；转染细胞总RNA RT-PCR显示外源基因在mRNA水平得到表达；FCM显示外源基因编码的蛋白高水平表达并定位于细胞表面。结论：为进一步研究BALB／c小鼠MHC-Ⅱ抗原递呈的分子机制奠定了基础。     

HCV核心-包膜E2抗原融合基因DNA疫苗的构建及对小鼠的免疫应答试验

目的：观察一种结构新颖的HCV融合抗原DNA疫苗在BALB/c小鼠的免疫效果，探讨其用于防治丙型肝炎的可行性。方法：用重叠延伸PCR拼接编码小鼠IgG kappa链信号肽和通用型辅助性T细胞表位PADRE的DNA片段，PCR分别扩增HCV核心抗原基因和包膜E2抗原基因，将3段基因插入真核表达载体pcDNA3.1，构成重组表达质粒pST-CE2t，转染COS7细胞，免疫组化检测HCV抗原的表达。将pST-CE2t和HCV核心抗DNA疫苗pcDNA3.1core分别肌肉注射接种BALB/c小鼠，检测小鼠的血清抗体、T细胞增殖和CTL反应。结果：pST-CE2t可在COS7细胞内表达HCV核心抗原和E2抗原，接种于BALB/c小鼠能有效诱导体液和细胞免疫应答，其中抗HCV核心抗原免疫应答的强度明显超过pcDNA3.1core，且更趋向于TH1型免疫应答。结论：pST-CE2t对于丙型肝炎的防治有潜在的应用价值。     

复制子荧光素酶表达质粒pSVK-luc的构建与应用

目的 为研究复制子DNA疫苗在生物活体内的表达情况,构建含有荧光素酶报告基因的复制子表达质粒pSVK-luc.方法 PCR扩增荧光素酶报告基因,克隆入DNA复制子载体pSVK,酶切鉴定和测序分析筛选阳性重组质粒pSVK-luc;化学法转染人胚肾293T细胞,流式细胞术和免疫荧光法检测荧光素酶基因在293T细胞中的表达;利用基因电穿孔导入仪递送重组质粒至BALB/c小鼠股四头肌,活体成像仪动态观测荧光素酶基因在小鼠体内的表达.结果 pSVK-luc经相应酶切和测序鉴定,与预期设计完全一致.流式细胞术和免疫荧光检测均可见荧光素酶基因表达;同时活体成像仪也能检测到该基因在小鼠体内的表达.结论 pSVK-luc表达质粒的构建成功将为复制子DNA疫苗体内作用机制研究和体内电穿孔递送条件的优化奠定实验基础.     

小鼠MIP-1α真核表达质粒的构建及在HSV-II核酸疫苗中的应用

目的构建小鼠巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)的真核表达质粒,观察其作为分子佐剂对单纯疱疹病毒II型(HSV-II)DNA疫苗免疫效果的影响。方法以LPS刺激RAW264.7细胞提取总RNA。采用RT-PCR扩增出MIP-1α基因的全部编码序列,利用克隆载体pUCm-T,将其亚克隆入pcDNA3中,构建出小鼠MIP-1α的真核表达质粒Pm;将其转染COS-7细胞,并用Boyden趋化小室法检测MIP-1α的生物学活性。然后用其与HSV-IIgD的DNA疫苗一起免疫BALB/c小鼠,检测免疫小鼠的特异性抗体、脾T细胞增殖反应及病毒攻击小鼠后对小鼠的保护率,观察MIP-1α对HSV-IIDNA疫苗免疫效果的影响。结果成功构建了小鼠MIP-1α的重组真核表达质粒;免疫BALB/c小鼠发现,其作为分子佐剂可加强HSV-IIgDDNA疫苗的免疫效果。结论小鼠MIP-1α可作为HSV-IIgDDNA疫苗的分子佐剂,为研制新型有效的HSV-IIDNA疫苗提供一定的依据。     

赖型钩端螺旋体溶血素基因HlyX的真核表达及基因免疫

目的 在哺乳动物细胞中表达含有赖型钩端螺旋体溶血素基因HlyX的重组质粒,并检测其作为DNA疫苗诱导小鼠体液免疫应答的效果.方法 以赖型钩端螺旋体全基因组为模板,PCR扩增出目的基因HlyX,以质粒pcDNA3.1为载体,双酶切构建重组质粒,转化大肠杆菌DH5α,双酶切、PCR及测序鉴定重组质粒.将构建成功的重组质粒转染COS-7细胞,通过RT-PCR、Western blot鉴定目的基因的表达.将重组质粒免疫BALB/c小鼠,每两周1次,共3次,ELISA法检测小鼠的体液免疫应答水平.结果 扩增出全长约1100 bp的HlyX基因,重组质粒经双酶切、PCR及测序鉴定表明重组质粒构建成功.RT-PCR检测显示重组质粒转染组能扩增出约1100 bp的目的基因片段,Western blot分析可见在相对分子质量(Mr)40×103左右出现特异性的目的条带.DNA免疫后诱导小鼠产生了较高的抗体水平(1∶6561～1∶19 683).结论 赖型钩端螺旋体溶血素基因HlyX真核表达质粒能够诱导小鼠产生高滴度的特异性抗体,为其作为钩体DNA疫苗的研究和开发奠定了基础.     

鼠β-防御素2(mBD2)真核表达质粒的构建及稳定表达株的鉴定

目的：对小鼠β防御素-2（mBD2）基因进行克隆,构建其真核表达载体,筛选出稳定表达细胞株,并研究mBD2的生物学特性及其抗肿瘤机制。方法：通过向BALB/c小鼠腹腔注射内毒素（LPS）,建立小鼠急性时相反应,取其肺组织提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增小鼠mBD2基因,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后插入相同酶切的pcDNA3.1（＋）真核表达载体,对其进行酶切和测序鉴定。将构建好的真核表达质粒pcDNA3.1（＋）/mBD2转染SiHa细胞,采用G418进行稳定表达株的筛选,用免疫荧光染色和RT-PCR鉴定细胞内mBD2蛋白表达情况。结果：提取小鼠肺组织总RNA,采用RT-PCR方法扩增了250bp左右的产物,通过EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切,构建了真核表达质粒pcDNA3.1（＋）/mBD2。SiHa被该质粒转染后,在100mg/LG418浓度下筛选20d,得到了稳定表达mBD2的细胞株,用免疫荧光染色显示mBD2蛋白在胞质中有大量表达,RT-PCR反应扩增到了mBD2的mRNA。结论：成功地构建了pcDNA3.1（＋）/mBD2真核表达质粒,mBD2蛋白在SiHa细胞中能稳定表达,这些结果为进一步深入研究mBD2的生物学特性及其抗肿瘤的作用奠定了基础。     

杜氏利什曼原虫amastin基因重组真核表达质粒的构建与表达

目的：构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白（alllastin）编码基因的真核表达重组质粒pcDNA3．1-amastin，并研究其在NIH3T3细胞中的表达。方法：提取杜氏利什曼原虫基因组DNA进行PCR扩增。将扩增的无鞭毛体蛋白基因片段导入质粒pcDNA3．1（＋）中，构建真核表达重组质粒pcDNA3．1-amastin。以pcDNA3．1-amastin转染NIH3T3细胞，采用免疫荧光染色法和RT-PCR分别鉴定pcDNA3．1-amastin的瞬时表达和稳定表达。结果：在细胞膜和细胞内均观察到较强的绿色荧光，表明pcDNA3．1-amastin成功地转入NIH3T3细胞，并在细胞膜和细胞内获得短暂表达。稳定转染的NIH3T3细胞的总RNA经反转录后，用PCR扩增出无鞭毛体蛋白基因，表明获得了稳定表达。结论：成功地构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因的真核表达重组质粒，并且该基因在NIH3T3细胞中获得了稳定表达。     

人β防御素-2与前列腺癌特异性膜抗原嵌合蛋白真核表达质粒构建及其诱导的小鼠特异性免疫应答

探索人β防御素2 (h BD- 2 )和前列腺特异性膜抗原(PSMA)共表达重组核酸疫苗针对前列腺癌的免疫治疗。研究以pc DNA3.1为载体,构建重组质粒pc DNA3.1/PSMA和pc DNA3.1/h BD- 2 - PSMA,通过RT- PCR和免疫组化检测其表达。免疫小鼠后,进行血清中抗体检测,CD4 、CD8 T淋巴细胞数目测定及CTL 特异性杀伤作用检测。结果显示构建的质粒转染COS- 7细胞后能表达目的基因,免疫小鼠后能在体内持久表达,可以诱导产生特异性抗体,能有效的刺激T细胞增生,诱导特异性CTL 反应。当以h BD- 2作为免疫佐剂时,CTL 活性更强。本研究成功的构建了含PSMA的表达质粒,免疫小鼠可以诱导出有效的体液和细胞免疫,为前列腺癌的免疫治疗奠定了一定的实验基础     

甲型流感病毒M2e与CtB基因融合表达及其免疫特性初步研究

目的: 构建真核表达重组质粒pcDNA3.1a( )-M2e/CtB, 并初步研究其在NIH3T3细胞中的表达特性及免疫特性.方法: 重叠PCR法扩增甲型流感病毒M2e基因和霍乱毒素CtB基因, 将扩增得到的融合基因片段M2e-CtB定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1a( )中, 再转化E.coli JM109.将酶切鉴定、 PCR扩增及序列鉴定正确的重组质粒命名为pcDNA3.1a( )-M2e/CtB.用KEGEN TRANS Ⅲ阳离子聚合物将重组质粒pcDNA3.1a( )-M2e/CtB转染NIH3T3细胞, 经免疫荧光、 RT-PCR产物序列分析、 Western blot检测其稳定表达产物.结果: 重组质粒pcDNA3.1a( )-M2e/CtB含完整的M2e和CtB基因, 与相对应基因的序列同源性分别为100%.重组质粒转染NIH3T3细胞后获得了有效表达, 并且稳筛株细胞裂解物和上清均能用抗霍乱毒素抗体和抗流感病毒抗体检测到Mr约18 000的蛋白条带.结论: 成功构建了真核表达重组质粒pcDNA3.1a( )-M2e/CtB, 初步证明其在体外表达的重组蛋白可分泌至胞外, 且有M2e和CTB的双特异反应原性和免疫原性, 为流感病毒核酸疫苗的进一步研究奠定了坚实基础.     

小鼠肿瘤/睾丸抗原Biot2对NIH3T3细胞增殖的影响

目的:研究新发现的小鼠肿瘤/睾丸抗原Biot2对小鼠NIH3T3细胞生物学行为的影响,探讨基因的生物学功能。方法:构建真核表达质粒pcDNA3.1( )-Biot2,由脂质体包裹稳定转染NIH3T3细胞,用Realtime RT-PCR、Western blot等方法筛选和鉴定Biot2表达阳性细胞克隆,研究其与细胞增殖相关的生物学特征的变化。结果:成功构建真核表达重组质粒pcDNA3.1( )-Biot2,并稳定转染于NIH3T3细胞。与对照组相比,转染了Biot2cDNA的NIH3T3细胞生长速率明显增快。结论:成功地建立稳定转染小鼠新基因Biot2的NIH3T3细胞克隆;Biot2基因能影响细胞增殖的调节,促进NIH3T3细胞的增殖,为进一步研究基因生物学功能奠定了基础。     

杜氏利什曼原虫LACK基因真核表达重组质粒及其在真核细胞中的表达

利什曼原虫的 L ACK抗原是利什曼原虫活性蛋白激酶 C受体同源物 ,是一种新发现的抗原蛋白。我们以本实验室的重组质粒 T- L ACK为模板 ,PCR扩增获得 L ACK基因 ,与真核表达载体 pc DNA3.1( )定向重组 ,重组质粒经酶切和 PCR分析 ,含有约 95 0 bp的 L ACK基因 ,成功构建含有 L ACK基因的真核表达重组质粒 pc D-NA3- L ACK。将此重组质粒转染 COS- 7细胞 ,通过 RT- PCR及免疫荧光检测 L ACK基因在真核细胞中的表达。实验结果显示转染了重组质粒的 COS- 7细胞 ,其 RT- PCR及免疫荧光检测均呈阳性反应 ,证实重组质粒 pc DNA3-L ACK能在 COS- 7细胞中有效表达 L ACK蛋白。     

pcDNA3.1/hIL-18真核表达载体的构建及表达

目的 :构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/IL 18,并在哺乳动物细胞COS 7和Rlc310中进行瞬时和稳定性表达。方法 :从含hIL 18基因的中介载体 pGEM TEasy( pGEM T/hIL 18)中 ,以限制性内切酶酶切方法获得目的片段 ,克隆入真核表达质粒 pcDNA3.1( )中。以脂质体法转染COS 7和Rlc310细胞 ,用RT PCR检测IL 18mRNA的水平 ,免疫组化染色法检测蛋白表达。结果 :构建了hIL 18基因的重组真核表达质粒pcDNA3.1/IL 18,并可在哺乳动物细胞中瞬时、稳定表达 ,获得了可稳定表达hIL 18基因的Rlc310细胞株。结论 :pcDNA3.1/IL 18的构建及表达 ,为IL 18抗肿瘤作用的研究奠定了基础     

Preliminary study on mouse interleukin-21 application in tumor gene therapy

lnterleukin-21(IL-21)is a recently characterized T cell-derived cytokine with a significant homology to IL-2,IL-4 and IL-15.To determine whether IL-21 has broad immunoregulatory activity and can stimulate durableantitumour responses,we constructed mouse IL-21(mIL-21) recombinant plasmid and evaluated its antitumorefficacy.Mouse IL-21 cDNA was amplified from Con A-activated mouse T cells by RT-PCR.RecombinantpcDNA3.1/mIL-21 was constructed and transfected into Sp2/0 cells.Mouse IL-21 expression was analyzed byWestern blotting and its activities were detected by ~3H-TdR incorporation and MTT assay.The recombinantpcDNA3.1/mIL-21 was injected s.c.into tumor lump.Tumor size,weight,the activities of CTLs,NK cells andLAK cells and serum IFN-γ,level were measured for evaluating mIL-21 mediated antitumor responses.Theresults indicated that mIL-21 was correctly expressed in Sp2/0 cells and it can improve the proliferation of Tcells and B cells,and enhance NK cytotoxic activity in vitro.The activities of CTL and NK cells,and serumIFN-γlevel were significantly improved,furthermore the tumor growth was obviously suppressed inpcDNA3.1/mIL-21 treated mice.However,the LAK activity did not alter significantly.Taken together,thisstudy suggests that the injection with recombinant plasmid containing mIL-21 is a potential approach fortumor gene therapy.Cellular & Molecular Immunology.2004;1(6):461-466.