体外诱导骨肉瘤特异性细胞毒T淋巴细胞的实验研究

研究诱导骨肉瘤特异性细胞毒Ｔ淋巴细胞,及其体内外的抗肿瘤作用。方法：通过生化方法提取纯化骨肉瘤相关抗原,并与低剂量ＩＬ２、ＣＤ３ＭｃＡｂ协同刺激骨肉瘤致敏的淋巴细胞诱导产生ＯＳＳ－ＣＴＬ。结果：ＯＳＳ－ＣＴＬ表型特征为以ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＴＬ为主的异质细胞群;对ＯＳＡＡ相关的肉瘤细胞显示高亲和杀伤活性。     

应用MAGE-1抗原肽体外诱导特异性细胞毒T淋巴细胞形成

目的：探讨应用MAGE－1抗原肽治疗肝细胞肝癌（HCC）的可行性。方法：接受MAGE－1抗原九肽NYKCRFPEI孵育的外周血单个核细胞（PBMC）经3000rad的射线照射后用作抗原呈递细胞（APC），每隔7d刺激HCC病人自体的PBMC 1次，进行混合淋巴细胞培养（MLCs)，共4次后作为细胞毒T淋巴细胞（CTL），应用乳酸脱氢酶（LDH）释放分析法检测CTL对靶细胞的杀伤效应。结果；从培养的第1周至第4周，淋巴细胞共增加至原细胞数的32倍；在效应细胞；靶细胞（E：T）为10：1时，CTL对MAGE－1抗原九肽NYKCRFPEI孵育的自体淋巴母细胞的杀伤效应为62．5％，对MAGE－1阳性，HLA－A24阳性的HCC细胞株BEL7405的杀伤效应为40．2％，两者均明显高于自体淋巴母细胞的杀伤效应（17．9％）。和对MAGE－1阳性，HLA－A24阴性的HCC细胞株HLE的杀伤效应（19．6％），及对MAGE－1阴性，HLA－A24阴性的HCC细胞株QGY 7701的杀伤效应（1．6％）；在E：T为3．3：1时，CTL对肽孵育的自体淋巴母细胞的杀伤效应为53．6％，明显高于自体淋巴母细胞的杀伤效应（15．6％），对HLE的杀伤效应（13％）和对QGY7701的杀伤效应（1％）。结论：本实验结果表明，应用MAGE－1抗原肽NYKCRFPEI，能在体外从HCC病人的PBMC中有效地诱导出具有特异性杀伤能力的CTL。     

肝癌特异性细胞毒T淋巴细胞的实施及临床研究

诱导肿瘤特异性细胞毒性Ｔ细胞，观察其体外、体内的抗肿瘤作用及其特异性；评价其扩上癌术后复发的临床应用价值。方法用细胞因子体外周期刺激方法提高肝癌细胞的免疫原性，再与肿瘤浸润Ｔ细胞共同培养，辅以ＣＤ２８产市民人刺激，诱导ＴＳ－ＣＴＬｓ，检测其体内外抗肝癌作用及其效应机制；大量扩增后回输患者，观察其免疫学指标的变化随访其术后复发情况。结果，体外研究表明，肝癌细胞经ＩＮＦ－γ、ＴＮＦ－α诱导后ＭＨＣＯＤ     

体外诱导骨肉瘤特异性细胞毒T淋巴细胞 的实验研究△

目的研究诱导骨肉瘤特异性细胞毒T淋巴细胞(OSS-CTL),及其体内外的抗肿瘤作用。方法通过生化方法提取纯化骨肉瘤相关抗原(OSAA),并与低剂量IL     

骨肉瘤特异性细胞毒T淋巴细胞介导HOSJ—8603细胞凋亡

目的：探讨骨肉瘤特异性细胞毒T淋巴细胞（OSS－CTL）对人骨肉瘤细胞系HOS－8603细胞凋亡的诱导作用,以揭示其抗肿瘤机制。方法：OSS－CTL与HOS－8603细胞按不同效靶比共同孵育后,通过电镜观察HOS－8603细胞的超微结构变化,并用流式细胞仪定量检测OSS－CTL与HOS－8603细胞凋亡发生状况。结果：HOS－8603细胞被OSS－CTL攻击后浓缩、深染,致密的染色质沿核膜下凝聚,并有凋亡小体形成。效靶比为1：1、50：1、100：1时,HOS－8603细胞凋亡发生率分别为0．6％、12．4％及21．6％。结论：OSS－CTL可通过诱导人骨肉瘤细胞系HOS－8603发生细胞凋亡起到抗肿瘤作用,且效靶比值增大后靶细胞凋亡的数量有明显增多的趋势。     

骨肉瘤特异性细胞毒T淋巴细胞介导HOS-8603细胞凋亡

目的:探讨骨肉瘤特异性细胞毒T淋巴细胞(OSS-CTL)对人骨肉瘤细胞系HOS-8603细胞凋亡的诱导作用,以揭示其抗肿瘤机制.方法:OSS-CTL与HOS-8603细胞按不同效靶比共同孵育后,通过电镜观察HOS-8603细胞的超微结构变化,并用流式细胞仪定量检测OSS-CTL与HOS-8603细胞凋亡发生状况.结果:HOS-8603细胞被OSS-CTL攻击后浓缩、深染,致密的染色质沿核膜下凝聚,并有凋亡小体形成.效靶比为1:1、50:1、100:1时,HOS-8603细胞凋亡发生率分别为0.6%、12.4%及21.6%.结论:OSS-CTL可通过诱导人骨肉瘤细胞系HOS-8603发生细胞凋亡起到抗肿瘤作用,且效靶比值增大后靶细胞凋亡的数量有明显增多的趋势.     

长期混合淋巴细胞培养-细胞毒实验模型的建立

目的：建立一种能较逼真地模拟移植排斥反应的体外实验模型。方法：利用EB病毒转化的BI林巴母样细胞系作为刺激细胞,诱导同种异体或异种外周血单个核细胞增殖,并分化为效应细胞,然后检测效应细胞对刺激细胞源靶细胞的杀伤活性,建立长期混合淋巴细胞培养,细胞毒实验模型。结果：用不同刺激细胞诱导产生的效应细胞能有效杀伤刺激细胞来源的靶细胞,进一步克隆实验证实这种杀伤效应是由CD8^ 细胞毒性T淋巴细胞（CTL）所致,结论：长期混合淋巴细胞培养－细胞毒实验模型能较逼真地模拟器官移植受者体内发生的由CTL介导的急性排斥反应。     

应用MAGE-3抗原肽诱导肝癌患者细胞毒T淋巴细胞反应的研究

目的研究MAGE 3抗原肽对肝细胞癌 (HCC)患者进行免疫治疗的可行性。方法微量细胞毒法检测HCC患者中HLA A2表达情况 ,RT PCR方法检测肝癌组织MAGE 3基因mRNA表达情况。用免疫磁珠从患者外周血单个核细胞 (PBMC)中分离出CD8阳性细胞作为效应细胞 ;将其余自体CD8阴性的PBMC与MAGE 3抗原肽 (FLWGPRALV)短暂孵育 ,经γ射线照射后作为抗原呈递细胞 (APC) ,与CD8阳性效应细胞进行混合淋巴细胞培养 ,作为实验组 ,7d后再加入APC刺激患者效应细胞 1次。每周计数效应细胞数量 ,培养第 15天时作为细胞毒T淋巴细胞 (CTL)检测其杀伤活性。以表达MAGE 3和HLA A2的肝癌细胞系HLE作为靶细胞 ,采用IFN γ细胞因子分泌法 ,通过流式细胞仪检测具有分泌γ 干扰素 (IFN γ)的CD8阳性细胞的频数来反映CTL的杀伤活性。另设不加APC刺激的CD8阳性细胞 ,加IL 2培养作为对照组。结果本组 2 5例HCC患者中 9例HLA A2阳性表达 ;9例中 3例MAGE 3基因mRNA阳性表达 ,6例阴性表达。培养开始时 ,效应细胞为 1 0× 10 6/孔 ,2周后细胞增殖 4～ 6倍。分泌IFN γ的CD8阳性细胞的频数 ,3例MAGE 3阳性患者平均为 2 2 0 % ,6例阴性患者为 0 5 % ,两组间差异有非常显著意义 (P <0 0 1)。结论本实验结果表明 ,应用MAGE 3抗原肽 ,能在体外从HCC患者     

肝癌特异性细胞毒 T 淋巴细胞的实验及临床研究

诱导肿瘤特异性细胞毒性Ｔ细胞（ＴＳ－ＣＴＬｓ），观察其体外、体内的抗肿瘤作用及其特异性；评价其抗肝癌术后复发的临床应用价值。方法：用细胞因子体外短期刺激方法提高肝癌细胞的免疫原性，再与肿瘤浸润Ｔ细胞共同培养，辅以ＣＤ２８单抗共刺激，诱导ＴＳ－ＣＴＬｓ，检测其体内外抗肝癌作用及其效应机制；大量扩增后回输患者，观察其免疫学指标的变化并随访其术后复发情况。结果：体外研究表明，肝癌细胞经ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α诱导后ＭＨＣＩ类分子，ＩＣＡＭ－１及Ｂ７分子的表达增高，用此细胞辅以ＣＤ２８单抗刺激诱导产生的ＴＳ－ＣＴＬｓ体现了高度的对自体肝癌的杀伤活性及特异性，其杀伤活性由ＴＣＲ－ＣＤ３复合物、ＣＤ８、ＬＦＡ－１、ＩＣＡＭ－１及ＭＨＣＩ类分子所介导。体内研究的结果表明，ＴＳ－ＣＴＬｓ对ＳＣＩＤ小鼠人肝癌模型具有显著的抑瘤作用。１２例初步临床应用的结果表明，ＴＳ－ＣＴＬ对于提高机体的Ｔ细胞免疫功能，对于预防肝癌术后复发均具有良好作用，值得进一步深入研究和应用。结论：ＴＳ－ＣＴＬｓ作为一种新的肿瘤特异性免疫治疗方法可望进一步提高肝癌和其它实体肿瘤的外科综合治疗水平。     

应用CT抗原肽诱导肝癌患者特异性细胞毒反应的研究

目的 研究应用不同肿瘤睾丸抗原（CTA）多肽诱导肝细胞肝癌（HCC）患者特异性细胞毒反应的情况。方法 RT-PCR方法检测一例HLA-A2阳性表达的HCC患者肝癌组织中三种CT抗原（MAGE-1，MAGE-3和NY-ESO-1）基因mRNA的表达情况，用免疫磁珠从该患者外周血单个核细胞（PBMC）中分离出CD8 T细胞作为效应细胞；将其余自体CD8-PBMC分别与三种CT抗原肽共孵育，经γ-射线照射后作为抗原呈递细胞（APC），分别与CD8 效应细胞进行混合淋巴细胞培养。7天后同法再刺激患者的CD8 T细胞1次，诱导形成细胞毒T淋巴细胞CTL），同时了以相同的CD8 效应细胞，加入IL-2培养作为对照组。培养两周后将三种CT抗原肽刺激的效应细胞，分别与带有相应抗原肽的T2靶细胞共孵育来检测杀伤效应。效应细胞，靶细胞（E：T）为10：1；用IFN-γ细胞因子分泌检测法，通过流式细胞仪检测产生IFN-γ的效应CD8 T细胞的频数来反映杀伤活性。结果 该患者MAGE-3和NY-ESO-1表达阳性，MAGE-1表达阴性，培养第14天，效应细胞共增加至原细胞数的4倍，NY-ESO-1抗原肽刺激的效应细胞对靶细胞（T2细胞 NY-ESO-1抗原肽0杀伤活性为10.0%;MAGE-3抗原肽刺激的效应细胞对靶细胞（T2细胞MAGE-3抗原肽）杀伤活性为8.5%;MAGE-1抗原肽刺激的效应细胞对靶细胞（T2细胞 MAGE-1抗原肽）杀伤活性为3.2%。结论 本实验结果表明，应用HCC患者阳性表达的CT抗原肽，可以诱导出该患者特异的细胞毒性T淋巴细胞，其杀伤活性较之无抗原肽和阴性抗原肽刺激明显增强。     

调节性T细胞和肝细胞癌

调节性T细胞是一类CD4+ CD25high Foxp3+T细胞,它不仅参与自身免疫性疾病、感染性疾病和移植耐受,而且抑制机体抗肿瘤免疫应答。研究表明,肝细胞癌患者血循环和肿瘤组织中Treg数量增加,参与肝细胞癌的发生发展过程,影响患者生存率与预后。消除Treg免疫抑制有望成为HCC免疫治疗的新方法,同时结合手术切除肿...     

调节性T细胞与原发性肝癌的免疫治疗

原发性肝癌的免疫治疗近年来发展迅速,在基础和临床前期研究中取得了令人鼓舞的治疗成果.但和其它恶性肿瘤类似,肝癌存在着严重的肿瘤免疫微环境抑制,大大影响了肝癌免疫治疗的效果.调节性T细胞(Treg)是一类免疫负性调控细胞,在维持人体自身免疫稳定和抗肿瘤免疫过程中起着重要作用,是形成肿瘤免疫微环境抑制的重要机制之一.有关Treg同肝癌的研究表明,Treg有可能成为肝癌免疫治疗的潜在靶点.     

MAGE-3抗原肽体外诱导肝癌患者免疫应答的研究

目的：利用载有MAGE－3抗原肽的树突状细胞（DC）活化原发性肝细胞癌（HCC）患者T淋巴细胞，探讨是否可以体外诱导特异性细胞毒T细胞细胞（CTL）应答。方法：通过逆转录多聚酶链反应和测序分析MAGE－3多肽表位密集区的核苷酸变异状况，体外培养HLA－A2表型的HCC患者及正常献血员外周血来源DC，并经孵育携带MAGE－3／HLA－A2抗原肽FLWG－PRALV，用以活化T淋巴细胞，利用特异性杀伤实验检测CTL应答。结果：中国HCC患者表达的MAGE－3序列高度保守。用特定细胞因子和无血清培养基可成功培养HCC患者外周血精源的DC。经多肽冲击的DC诱导，3例HCC例者和3例正常献血员可成功培养HCC患者外周血来源的DC。经多肽冲击的DC诱导，3例HCC患者的3例正常献血员中各有2例产生CTL免疫应答。结论：载有MAGE－3抗原肽的DC可以体外诱导特异性的CTL免疫应答。提示HLA－A2限制性的MAGE－3抗原肽经DC递呈可以作为有潜力的肝癌免疫治疗疫苗。     

CD3AK细胞过继治疗对肝癌患者T淋巴细胞亚群及功能活性的影响

目的 探讨CD3AK细胞过继治疗对原发性肝癌（PLC）患者T淋巴细胞亚群及功能活性的影响。方法 58例 PLC患者分为:CD3AK细胞治疗组（n=37）,对照组（n=21）,另取11例献血员为正常对照。治疗组术后第1天开始输注CD3AK细胞,每天1次,每次输注2x109个细胞,输注前30min静脉注射IL-2100u,连续5d为一个疗程;对照组只给予与治疗组相同的保肝治疗。观察两组T淋巴细胞亚群、IL-2R、细胞增殖功能、NK及LAK活性。结果 治疗组CD4/CD8比值、NK活性、LAK活性、IL-2R表达水平及细胞增殖活力与治疗前和对照组比较,差异均有显著性意义。结论 过继输注CD3AK细胞治疗能够补充肝癌患者有效抗肿瘤活性细胞数量的不足,并能够使T淋巴细胞亚群比例失调和功能低下的状况获得不同程度的改善。     

Generation of vaccine-primed lymphocytes for the treatment of head and neck cancer

BACKGROUND: This study was performed to assess the ability of autologous tumor vaccines to induce T-cell reactivity to squamous cell cancers (SCC). METHODS: Irradiated autologous tumor cells admixed with bacillus Calmette-Guérin (BCG) were given intradermally in patients with advanced head and neck cancers. Vaccine-primed lymph node (VPLN) cells were secondarily activated with anti-CD3 mAb and expanded in IL-2 for adoptive immunotherapy. A mean (+/- SEM) of 2 (+/-0.6) x 10(10) anti-CD3-activated cells were administered in conjunction with IL-2 in six patients. RESULTS: Anti-CD3-activated VPLN cells secreted IFN-gamma and GM-CSF in response to autologous tumor cells but not to allogeneic tumor cells in four of five patients analyzed. Both CD4(+) and CD8(+) tumor reactive cells were present in the VPLN. There were no significant tumor responses after transfer of the anti-CD3-activated VPLN. In separate experiments, costimulation of VPLN cells with anti-CD3 and anti-CD28 mAb resulted in enhanced cytokine secretion to autologous tumor compared with anti-CD3 activation alone. CONCLUSIONS: Both CD4(+) and CD8(+) responses can be induced to SCC by autologous tumor vaccination. However, additional approaches need to be identified to enhance the therapeutic efficacy of this approach.     

AAL细胞联合手术及介入治疗原发性肝癌临床观察

目的评估活化自体淋巴细胞(activated autologous lymphocyte,AAL)联合手术及介入治疗对原发性肝癌患者生存期及预后的影响。方法回顾性分析2013年1月至2016年2月期间首都医科大学附属北京佑安医院肝病与肿瘤生物治疗科收治的297例经手术及介入治疗原发性肝癌患者,分为联合AAL治疗的观察组(146例)以及未联合AAL治疗的对照组(151例),收集患者临床资料、实验室数据及随访情况,采用Kaplan-Meier法比较两组患者平均疾病进展时间(time to progression,TTP)和总生存期(overall survival,OS),采用寿命表法比较两组不同时期疾病(无)进展率及病死率,采用Kaplan-Meier单因素分析和Cox比例风险模型多因素分析影响TTP和OS的相关因素。结果观察组和对照组中位TTP和OS分别为(10.0个月vs 5.0个月,P=0.017)、(16.0个月vs 11.0个月,P=0.014),观察组较对照组疾病进展率和病死率降低11.1%(81.5%vs 92.6%,P=0.009)和16.5%(53.2%vs 69.7%,P=0.008)。影响患者TTP和OS的因素包括:接受AAL免疫治疗、年龄≥65岁、巴塞罗那肝癌分期为A~B期、无肝硬化或肝硬化Child-Pugh A级。结论原发性肝癌患者接受AAL联合手术和介入治疗可以延缓疾病进展时间和延长生存期,降低疾病进展率和病死率,改善总体预后。     

原发性肝细胞肝癌组织分化程度与超声造影的关系

目的探讨原发性肝细胞肝癌（HCC）超声造影与组织学分化程度的关系。方法回顾术前应用SonoVue超声造影剂的47例HCC患者超声造影表现,将所获得曲线形态和灌注参数与术后标本的组织分化程度进行对照分析。结果9例高分化HCC均为快上慢下型;24例中分化HCC,15例呈快上慢下型（20.80%）,19例（79.20%）呈快上快下型;14例低分化HCC,8例（57.10%）呈快上慢下型、6例（42.90%）呈快上快下型;不同分化程度HCC病灶始增时间、增强时间、峰值强度组间差异无统计学意义（P〉0.05）,始消时间差异有统计学意义（P〈0.05）。结论不同分化程度HCC超声造影TIC形态和声学定量参数变化特征不同,有助于术前无创性了解肿瘤分化程度。     

nm23-H1基因mRNA在人肝细胞癌中的表达

目的　研究人肝细胞癌中肿瘤转移抑制基因ｎｍ２３Ｈ１ 的ｍＲＮＡ表达状况,并探讨其表达水平与肿瘤各项临床病理指标间的相关性。方法　应用半定量ＲＴＰＣＲ 方法检测分析人肝细胞癌组织、相应癌旁肝组织中ｎｍ２３Ｈ１ 的ｍＲＮＡ表达。结果　１５ 例肝癌及癌旁肝组织ＲＴＰＣＲ结果均为阳性,未见ｎｍ２３Ｈ１ 基因表达缺失或较大变异;肝癌组织中ｎｍ２３Ｈ１ ｍＲＮＡ表达水平明显高于相应癌旁组织（ Ｐ＝ ０－０３５）;ＡＦＰ阳性组ｎｍ２３Ｈ１ ｍＲＮＡ表达水平明显高于ＡＦＰ阴性组（ Ｐ＝０－００５） 。结论　人肝细胞癌中ｎｍ２３Ｈ１ 基因ｍＲＮＡ的异常表达可能与肿瘤的恶性生物学特征密切相关。     

干细胞表面标志物CD90及端粒酶逆转录酶在原发性肝癌中的表达及临床意义

目的 检测CD90及端粒酶逆转录酶(hTERT)在原发性肝癌中的表达,研究其蛋白产物在原发性肝癌发生、发展过程中的表达特点及相互关系.方法 应用免疫组化S-P法检测36例原发性肝癌中CD90、hTERT的表达,并以同期20例正常肝组织作对照.结果 肝癌组织中CD90、hTERT基因蛋白产物阳性表达率(分别为63.9％和47.2％)显著高于良性对照组(CD90、hTERT均阴性);CD90、hTERT蛋白在UICC临床分期Ⅲ～Ⅳ期肝癌患者(分别为79.1％和62.5％)明显高于Ⅰ～Ⅱ期患者(分别为33.3％和16.6％);CD90、hTERT两者呈正相关;CD90、hTERT阳性患者生存率(术后中位生存时间分别为85 d和76 d)明显低于CD90、hTERT阴性患者(术后中位生存时间分别为505 d和463 d),log秩检验显示生存率差异均有统计学意义.结论 CD90可能与肝癌的发生、发展相关,有望成为判断患者预后的指标之一.     

Dkk3在肝细胞肝癌中的表达及其临床意义

目的探讨dkk3在肝细胞肝癌中的表达及临床意义。方法 40例肝癌及其癌旁组织,10例正常肝组织采用Real time PCR检测DKK3mNA水平表达情况和228例肝癌组织及癌旁组织石蜡切片采用免疫组织化学方法对DKK3蛋白水平表达情况进行检测;并对228例肝癌患者预后生存率进行分析。结果 DKK3mRNA水平中在肝癌组织中低表达,在正常组织中高表达(P0.05),DKK3蛋白水平在肝癌组织中低表达(P0.05),DKK3蛋白高表达肝癌患者预后生存时间长于低表达(P0.05),差异有统计学意义。结论 DKK3在肝细胞肝癌组织中低表达,说明DKK3是一种抑癌基因,并且预后结果分析提示DKK3有可能在抑制肿瘤增长,分化,转移中发挥作用。