单细胞实时荧光定量PCR结合比较阈值法在诊断唐氏综合征中的应用

目的探讨单细胞水平实时荧光定量PCR技术对于诊断唐氏综合征的应用价值。方法22例唐氏综合征患者及胎儿、40名正常对照外周血或脐血经梯度离心、显微操作分离单个淋巴细胞，应用引物延伸预扩增及实时荧光定量PER技术扩增基因组12号染色体上GAPDH基因、21号染色体上S100B基因和DSCR1基因。比较病例组与对照组ACT值有无差异，计算病例组S100B／GAPDH、DSCR1／GAPDH的值。结果两组间ACT值差异有统计学意义（P〈0．01），病例组低于对照组。病例组S100B／GAPDH、DSCR1／GAPDH值分别为1．891（1．563～2．287）、1．840（I．562～2．168）。结论实时荧光定量PCR是一种可信的诊断方法，为唐氏综合征的无创性产前诊断及植入前遗传学诊断等提供了新的思路。     

实时荧光定量PCR快速分子诊断唐氏综合征

目的　探讨快速诊断唐氏综合征的检测方法 .方法　采用实时荧光定量PCR技术 ,检测唐氏患者 2 3例、正常人 33例 ,定量分析比较ΔCt值 .结果　正常组和唐氏组ΔCt值有显著性差异 (p <0 .0 0 1) ,并建立了相应的参考值范围 .结论　实时荧光定量PCR具有简单、快速、特异性高等优点 ,可用于快速诊断唐氏综合征     

实时荧光定量PCR快速分子诊断唐氏综合征

目的探讨快速诊断唐氏综合征的检测方法.方法采用实时荧光定量PCR技术,检测唐氏患者23例、正常人33例,定量分析比较ΔCt值.结果正常组和唐氏组ΔCt值有显著性差异(p<0.001),并建立了相应的参考值范围.结论实时荧光定量PCR具有简单、快速、特异性高等优点,可用于快速诊断唐氏综合征.     

荧光定量PCR产前快速诊断唐氏综合征

目的探索荧光定量PCR方法在产前快速诊断唐氏综合征中的作用。方法收集65例妊娠20~24w,进行羊水穿刺胎儿细胞培养染色体核型分析的胎儿羊水,采用荧光定量PCR技术对标本D21S11位点进行PCR扩增、检测,并与染色体核型分析的结果进行对照分析。结果65例未培养羊水标本经过荧光定量PCR检测,发现2例唐氏综合征,显示1:1:1三条或2:1两条D21S11位点等位基因带,63例显示1:1两条带;与细胞培养染色体核型分析的结果基本一致。结论荧光定量PCR技术具有检测速度快、需要模板量少,检测结果准确等特点,可用于染色体异常的产前快速诊断。     

双色竞争性荧光定量PCR检测唐氏综合征

目的 建立一种快速检测唐氏综合征(Down syndrome,DS)的双色竞争性荧光定量聚合酶链反应(dual-color competitive quantitative fluorescent polymerase chain reaction,DCC-QF-PCR)方法,并探讨其应用于DS产前诊断的可能性.方法 提取30例DS患者和60名正常人的外周血DNA,设计DSCR和USC2两基因的特异共用引物和双色特异性TaqMan探针,同一反应管中进行两基因的DCC-QF-PCR,并与DSCR和GAPDH两基因的QF-PCR实验结果进行比较.提取46份羊水胎儿细胞的DNA进行DSCR和USC2两基因的DCC-QF-PCR,并与染色体核型分析结果对比;克隆出DSCR和USC2的单克隆基因片段,定量后进行定量配比的DCC-QF-PCR,并计算DSCR∶USC2拷贝数的比值.结果 DCC-QF-PCR检测中,DS患者DSCR∶USC2拷贝数比值范围为1.41～1.74,显著高于正常人的0.93～1.15;而QF-PCR检测中,DSCR∶GAPDH拷贝数比值范围较DSCR∶USC2增大.46份羊水检测中,3份DSCR∶USC2拷贝数比值分别为1.61、1.64和1.54,为DS患儿,其余43份正常,与染色体核型分析结果一致;DSCR与USC2基因定量配比的DCC-QF-PCR所得DSCR∶USC2拷贝数比值范围与配比值差异无统计学意义(P＞0.05),检测结果较为稳定.结论 DCC-QF-PCR具有准确、快速、需模板量少和费用低廉等特点,该方法在DS的基因诊断和产前基因诊断中有较为广泛的应用前景.     

多重实时定量PCR快速诊断唐氏及爱德华综合征

目的 建立多重实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RTqPCR)技术,快速分子诊断唐氏及爱德华综合征.方法 应用PCR方法同时扩增位于21号染色体上的淀粉样前蛋白基因(amyloid precursor protein gene,APP)和18号染色体上的胸苷酸合成酶基因(thymidylate synthetase gene,TYMS),以相对定量指标△CT值区分唐氏、爱德华综合征及正常人.用此方法检测4组样本:36名正常人外周血(A组)、15名正常核型的羊水细胞(B组)、21例唐氏综合征(C组)和6例爱德华综合征(D组).结果 A～D 4组样本△CT均值分别为-0.48±0.15、-0.49±0.12、-1.26±0.17和0.25±0.12.B组与A组间差异无统计学意义(P＞0.05);C组与A组、D组与A组间差异有统计学意义(P＜0.01),且无交叉重叠.结论 多重实时荧光定量PCR技术同时快速诊断唐氏及爱德华综合征是可行的.     

实时荧光定量PCR法筛查唐氏综合征的实验研究

目的建立一种无创性、高特异性的快速筛查唐氏综合征（Down’s syndrome,DS）的检测方法。方法采用实时荧光定量PCR技术对正常人和DS患者外周血样本的有核细胞进行检测,根据△Ct值的差异建立检测方法。结果正常组和唐氏组△Ct值有显著性差异（P〈0．001）,初步建立了实时荧光定量PCR筛查唐氏综合征的快速检测方法。结论实时荧光定量PCR具有无创性、特异性高且简单、快速等优点,适用于唐氏综合征产前筛查。     

应用STR-荧光定量PCR行产前唐氏综合征诊断的初步研究

目的建立快速高效的产前诊断唐氏综合征的方法。方法选取21号染色体上唐氏综合征关键区域内的4个串联重复序列（STR）（D21S1413,D21S1414,D21S1446,D21S1437）作为遗传标记,采用荧光定量PCR扩增技术（QF—PCR）及片段分析技术来检测178例羊水标本,并与羊水标本的染色体核型分析结果相比对,评价QF—PCR方法的特异性和灵敏度。结果所有178例羊水标本中经核型分析证实有19例为21三体,另有2例为性染色体数目异常,19例唐氏综合征样本均可由QF—PCR法扩增检出。19例唐氏综合症样本,采用4对STR引物同时检测,阳性诊断率达100％。结论基于STR的QF—PCR技术具有简单、快速及准确等优点,对唐氏综合征大规模的产前基因诊断具有很好的临床价值。     

应用定量PCR方法快速基因诊断Down综合征

目的探讨用定量聚合酶链反应方法对Ｄｏｗｎ综合征进行基因诊断。方法以短串联重复序列（Ｄ２１Ｓ１１）作为遗传标记,合成特异引物,用同位素标记聚合酶链反应扩增后对１１名正常人（６例外周血,５例羊水）及２８例Ｄｏｗｎ综合征患者（外周血）进行定量检测。结果１１名正常人中１０人出现ＤＮＡ含量为１∶１关系的２条电泳带,１人为１条带。２８例患者中２４人出现ＤＮＡ含量２∶１的２条带,３人为ＤＮＡ含量为１∶１∶１的３条带,１人为１条带。结论Ｄ２１Ｓ１１位点短串联重复序列多态是对Ｄｏｗｎ综合征基因诊断很有应用价值的遗传标记,应用定量聚合酶链反应方法可在２４小时内对Ｄｏｗｎ综合征做出快速、准确的产前及临床基因诊断。     

PCR-短串联重复法快速产前筛查唐氏综合征的应用价值

目的 探讨PCR短串联重复(PCR-short tandem repeat,PCR-STR)法快速产前筛查唐氏综合征(Down syndrome,DS)的应用价值及7个STR位点多态性分布特点.方法 选择21号染色体核心区域(21q22.1-21q22.2)及其附近的7个STR位点(D21S11、D21S1411、D21S1412、D21S1413、D21S1414、D21S1432、D21S2039),应用PCR-STR扩增对978例高危孕妇羊水样本和82例疑似DS患者外周血样本进行基因诊断筛查检测,并与细胞培养染色体核型分析结果比较.结果 (1)978例羊水和82例外周血样本PCR-STR检测全部成功,7个STR位点多态信息联合分析,以检出2个位点面积比或强度为1∶1∶1三条带;或1个位点1∶1∶1三条带,同时有2个位点面积比或强度为1∶2或2∶1两条带为DS基因诊断标准,共检出DS阳性40例,其中羊水14例阳性,外周血26例阳性.(2)羊水细胞培养染色体核型分析成功961例(98.3％),17例培养失败(1.7％),检出异常染色体核型44例(4.6％),其中14例为DS核型,包括12例标准DS核型,1例易位DS核型,1例嵌合DS核型.17例培养失败羊水经脐带血染色体分析证实均为正常核型.(3)82例可疑DS患者外周血培养全部成功,检出异常染色体核型30例(36.6％),其中26例为DS核型,包括22例标准DS核型,4例易位DS核型;其它异常核型4例.(4)PCR-STR法对7个STR位点联合分析,单例样本可检出1～4个位点为1∶1∶1三条带,或可见2～4个位点为面积比率或强度比为2∶1或1∶2的两条带.羊水和外周血样本DS基因诊断结果与细胞培养染色体核型分析诊断结果完全一致,PCR-STR法快速产前基因诊断DS筛查的灵敏度为100％,未发现假阳性和假阴性结果.(5)7个STR位点杂合率在0.624～0.812,D21S2039和D21S1412位点杂合度最高(＞0.80),D21S1411和D21S1432位点杂合度较低(＜0.70).D21S11和D21S2039位点检出1∶1∶1三条带比率最高(≥40％),而D21S1411、D21S1432、D21S1413位点检出单一条带(纯合率)比率最高(≥30％).结论 PCR-STR法是产前诊断DS的一种快速、有效的筛查方法,7个STR位点联合分析,提供的诊断信息量大,结果准确、可靠.     

Rapid detection of chromosome aneuploidies by quantitative fluorescence PCR: first application on 247 chorionic villus samples

We report the results of the first major study of applying quantitative fluorescence polymerase chain reaction (QF-PCR) assays for the detection of major chromosome numerical disorders. The QF-PCR tests were performed on a total of 247 chorionic villus samples, which were analysed blind, without any knowledge of the results obtained using conventional cytogenetic analysis. The aims of this investigation were to evaluate the detection power and accuracy of this approach by testing a large number of fetal samples and to assess the diagnostic value of each of the chromosome specific small tandem repeat (STR) markers used. In addition, we introduced three more markers specific for chromosomes 13, 18, and X to allow an accurate analysis of samples homozygous for a particular STR. Fluorescent labelled primers were used to amplify 12 STRs specific for chromosomes 21, 18, 13, X, and the amylogenin-like DNA sequence AMXY, expressed on the X and Y chromosomes. In this blind study of 247 fetal samples, 222 were correctly diagnosed by QF-PCR as normal for each of the five chromosomes investigated; 20 were diagnosed by QF-PCR as trisomic for chromosomes 21, 18, or 13, in agreement with the cytogenetic tests. Only one false negative result was observed, probably owing to the mishandling of the sample, which had been transferred through three laboratories before being analysed by QF-PCR. The 247 samples also included four cases of mosaicism or translocation; one case of mosaic trisomy 21 was detected by QF-PCR and the other cases were not identified by QF-PCR. The results of this investigation provide clear evidence that the QF-PCR assays are powerful adjuncts to conventional cytogenetic techniques and can be applied for the rapid and accurate prenatal diagnosis of the most frequent aneuploidies.     

肝螺杆菌TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测方法的建立及应用研究

目的 建立特异、敏感、快速检测肝螺杆菌的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法.方法 针对肝螺杆菌flaB 基因的保守区设计特异性引物和探针,建立肝螺杆菌TaqMan MGB探针实时荧光定最PCR方检测方法,验证方法的特异性、敏感性和稳定性.对2008-2011年期间采集的1081份临床样本中的肝螺杆菌进行检测,同时进行分离培养和常规PCR检测.结果 建立的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法对肝螺杆菌的检测具有高度的特异性,对幽门螺杆菌、空肠弯曲菌、泰泽氏菌、侵肺巴斯德氏菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌均无交叉反应,检测的灵敏度达8.3拷贝.标准曲线显示各浓度范围内具有良好的线性关系,相关系数为0.999,斜率为-3.227,TaqManMGB探针实时荧光定量PCR效率为100％.对1081份临床样本进行检测,TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR和常规PCR均能检出86份肝螺杆菌阳性样本,而细菌分离培养则仅检出4份阳性.结果显示,建立的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法比细菌分离培养方法更敏感,能够直接从临床样本中检出肝螺杆菌DNA,检测时间仅为2h.结论 研究建立的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法具有可靠、特异、敏感的特点,适用于肝螺杆菌的快速检测.     

荧光定量PCR快速诊断21三体综合征

目的　建立荧光定量PCR技术检测 2 1三体综合征。方法　采用PCR方法同时扩增位于 2 1号染色体上的人肝型磷酸果糖激酶基因 (humanliver typephosphofructokinasegene ,PFKL CH 2 1)和位于 1号染色体上的人肌型磷酸果糖激酶基因 (humanmuscle typephosphofructokinasegene ,PFKM CH1) ,使用SYBRGreenⅠ荧光染料处理产物、琼脂糖电泳后在凝胶成像系统进行分析 ,得出扩增产物的荧光强度对比值。用此方法检测 2 6例 2 1三体综合征患儿及 2 0名正常人。结果　 2 6例 2 1三体综合征患儿PFKL CH2 1/PFKM CH 1扩增产物的荧光强度对比值为 1.5 8± 0 .17,而正常人为 1 0 0± 0 .0 5 ,两者差异有显著性。结论　SYBRGreenⅠ荧光定量PCR技术检测 2 1三体综合征具有准确、快速、安全、实用等特点 ,有较高的临床使用价值。     

同源基因定量PCR方法快速产前诊断Down综合征

目的　探讨同源基因定量PCR方法在预防Down综合征患儿出生及无创性产前诊断中的应用价值。方法　对178名正常对照和38例Down综合征患者同时扩增位于2 1号染色体Down综合征致病关键区域的人肝型磷酸果糖激酶基因(PFKL- CH2 1)和位于1号染色体的人肌型磷酸果糖激酶基因(PFKM- CH1) ,计算机软件(Fluor Chem V2 .0 Stand- Alone)分析PFKM- CH1及PFKL- CH2 1产物的相对比。结果　正常人比值为1.4 0±0 .36 7,Down综合征患者比值为0 .4 6±0 .2 1,经t检验差异有统计学意义。结论　这种定量PCR方法不但能检测2 1三体型,也可检测易位型Down综合征。     

非损伤性PCR-ELISA定量法产前诊断唐氏综合征

目的 探讨非损伤性PCR-ELISA定量法产前诊断在预防唐氏综合征患儿出生中的应用价值。方法 对200例孕14～17w来我院进行孕期保健的孕妇，利用快速一步法半定量金标法进行产前筛查。富集阳性孕妇外周血中胎儿有核红细胞，并提取其：DNA进行Down’s PFKL、PFKM特异性引物扩增、PCR-ELISA定量诊断。结果 筛查出1例阳性孕妇，非损伤性PCR-ELISA定量法进一步诊断此孕妇为阳性。结论 非损伤性PCR—ELISA定量法，将使唐氏综合征的防治成为可能。     

Detection of hemizygosity in Hermansky-Pudlak syndrome by quantitative real-time PCR

Hermansky-Pudlak syndrome (HPS) is an autosomal recessive disorder characterized by oculocutaneous albinism, a bleeding diathesis and, in some patients, pulmonary fibrosis or granulomatous colitis. HPS is associated with biosynthesis defects of melanosomes, platelet-dense bodies, and lysosomes. There are seven genetic HPS subtypes; HPS-1 is the most common. We used a real-time quantitative PCR (qPCR) approach to investigate six HPS-1 patients, previously assigned as having homozygous mutations in the HPS1 gene. HPS1 gene copy numbers, calculated by use of a comparative Ct method, revealed that one patient was in fact hemizygous for her c.1189delC (S396delC) HPS1 mutation. The causative deletion/insertion was 13,966 bp in size, with defined breakpoints, and involved an adjacent gene (C10orf33). A mechanism of formation is proposed for the deletion/insertion, and both multiplex and qPCR indicated that the deletion/insertion was present in the patient, her brother, and her father. qPCR amplification is valuable for detecting deletions too small to be identified by fluorescence in situ hybridization. This demonstration of hemizygosity, performed using genomic DNA, can eliminate concerns about non-paternity and can verify the diagnosis of an autosomal recessive disorder when a DNA alteration appears to be homozygous by standard PCR and sequencing methods, and its pathogenicity is in doubt.     

用实时荧光定量PCR方法检测母血中的胎儿SRY基因

目的　从孕妇外周血浆中分离出胎儿DNA ,并加以鉴定 ,预防X连锁遗传病患儿的出生。方法　从孕早期、中期共 3 0 0名孕妇外周血浆中分离胎儿DNA ,用实时荧光定量聚合酶链反应 (fluorescencequantitativepolymerasechainreaction ,FQ PCR)的方法检测其中的Y性别决定区 (sex determiningregionY ,SRY)基因。结果　孕早期怀男胎的孕妇 82名 ,70名SRY基因阳性 ,其平均浓度为 ( 5 8.82± 2 0 .90 )拷贝 /ml,中位数为 5 8.5 0拷贝 /ml。孕中期怀男胎的孕妇 90名 ,SRY基因均为阳性 ,平均为 ( 15 2 .0 8± 62 61)拷贝 /ml,中位数为 14 9.3 5拷贝 /ml。怀女胎的孕妇均为阴性。结论　用实时荧光定量PCR的方法最早在孕42天的孕妇外周血浆中就可以检测到胎儿SRY基因 ,随孕周的增加 ,母血中胎儿DNA的量也在逐渐增加。实时荧光定量PCR技术在进行无创伤性产前性别诊断中有重要的价值。     

rpoB作为蜡样芽胞杆菌群快速检测的标志基因的实验研究

目的探讨常规PCR和实时荧光定量PCR（Q-PCR）方法检测蜡样芽胞杆菌群rpoB基因的特异性和敏感性。方法提取蜡样芽胞杆菌群和其他各种对照细菌的基因组DNA,合成蜡样芽胞杆菌群rpoB基因扩增引物,采用常规PCR和SYBRgreen实时定量PCR两种方法扩增rpoB基因片段,并将PCR产物克隆到pMD18-T载体后进行DNA测序。结果常规PCR和Q-PCR均能扩增出蜡样芽胞杆菌群rpoB基因的174bpDNA片段,而各种对照菌株均未见扩增。序列比对发现蜡样芽胞杆菌群细菌在该片段中存在5处核苷酸的不同,差异率为2.88%。以炭疽芽胞杆菌基因组DNA系列稀释作为扩增模板显示常规PCR最小检出量为3.42pg,Q-PCR的敏感性达到171fg,3次重复实验显示Q-PCR检测rpoB基因的灵敏度为（3.32×101±7.45×100）拷贝。结论以rpoB基因为检测靶基因的Q-PCR方法具有高度的特异性和良好的敏感性,能实现对蜡样芽胞杆菌群快速而准确的检测。