RUNX3小干扰RNA对SH-SY5Y细胞生长和药物敏感性的作用

目的：探讨RUNX3基因对人神经母细胞瘤细胞生长和药物敏感性的调节作用。方法:构建RUNX3基因的小干扰RNA载体并将其转导入SH-SY5Y细胞，G418筛选后获得稳定转染的阳性克隆后，应用RT-PCR和Western blotitng进行鉴定；MTT法和流式细胞仪检测细胞转染前后生长速度和细胞周期的变化；MTT法和流式细胞仪检测细胞转染前后对阿霉素敏感性的变化；Western blotting检测细胞转染前后细胞周期相关蛋白cyclin D1、CDK4、CDK6、p21、 p27和凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax以及耐药相关蛋白P-gp、MRP的表达变化。结果:成功构建了RUNX3的小干扰RNA载体并将其转染SH-SY5Y细胞；筛选到稳定的RUNX3低表达的神经母细胞瘤细胞模型；MTT和流式细胞仪检测结果显示，转染RUNX3小干扰RNA后的细胞的生长速度显著快于对照组（P<0.05），且G1期的细胞比率显著低于对照组（P<0.05）；MTT法和流式细胞仪结果显示, 转染RUNX3小干扰RNA后的细胞对化疗药物的敏感性降低，细胞内的阿霉素蓄积量显著减少（P<0.05）；Western blotting显示，转染RUNX3小干扰RNA后的细胞中Bcl-2、P-gp和cyclin D1的表达明显增高，p21的表达明显降低。结论:下调RUNX3基因能促进神经母细胞瘤细胞生长，降低细胞对化疗药物的敏感性，提示RUNX3在神经母细胞瘤的发生和发展中可能扮演重要角色。     

α7神经型尼古丁受体的神经保护作用及其与阿尔茨海默病发病的关系

目的探讨α7神经型尼古丁受体（nAChR）表达改变与淀粉样蛋白前体蛋白（APP）代谢、细胞存活率及脂质过氧化水平的关系,以了解α7 nAChR的神经保护作用,以及该受体水平与阿尔茨海默病发病的关系。方法设计并合成α7 nAChR基因特异性小分子干扰RNA（siRNA）,转染SH-SY5Y细胞;用20μmol／LDMXB处理细胞;培养48h后收集细胞,分别应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot方法检测转染细胞及DMXB处理后的细胞α7 nAChR mRNA及蛋白表达水平的变化;并用1μmol／L β-淀粉样肽25-35（Aβ25-35处理细胞,测定分泌型APP、总APP蛋白表达的变化;比色法测定脂质过氧化产物含量;MTT方法测定细胞活力。结果转染siRNA后,与对照组相比,α7 nAChR mRNA及蛋白表达量降低（抑制率分别为80％和69％）、脂质过氧化产物丙二醛含量明显增加、分泌型APP表达下降、细胞活力明显低于对照组,且能增强Aβ的细胞毒性作用;用DMXB处理细胞后能使α7 nAChR的表达增加23％、增加分泌型APP的表达、并能对抗Aβ引起的细胞活力下降及脂质过氧化水平的增强。结论α7 nAChR可能通过增强α-分泌酶对APP的切割、增强细胞抗氧化能力及对抗Aβ的神经毒性作用来发挥神经保护作用,其表达减少与阿尔茨海默病的发病机制有密切的关系。     

RNA干扰抑制MTA1基因对人乳腺癌细胞ERα表达及浸润能力的影响

目的 通过观察pGenesil-1肿瘤转移相关基因1(MTA1)对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231和MCF-7细胞MTA1基因的沉默效应,了解其对ERα表达及浸润能力的影响.方法 设计合成并构建重组质粒pGenesil-1MTA1,将该质粒分别转染MDA-MB-231和MCF-7细胞,荧光显微镜评估转染效率,RT-PCR检测MTA1和基质金属蛋白酶(MMP)-9 mRNA表达,免疫细胞化学检测ERα和MMP-9表达,Western blot检测ERα蛋白表达,用Boyden小室体外侵袭实验检测转染前后两株细胞侵袭力的变化.结果 成功构建重组质粒pGenesil-1MTA1,并成功转染入MDA-MB-231和MCF-7细胞(平均转染效率分别为82.5%和78.2%).两株细胞MTA1 mRNA表达均受到不同程度的抑制(分别为80.2%和58.7%).经干扰MTA1基因后MDA-MB-231细胞ERα蛋白表达得到逆转,呈阳性表达;MMP-9 mRNA表达下降;细胞体外侵袭力减弱(侵袭指数为27.2%±2.1%),与干扰前(76.3%±2.4%)相比差异有统计学意义(P＜0.05).而MCF-7细胞转染重组质粒并干扰MTA1基因后,ERα蛋白、MMP-9 mRNA表达和体外侵袭能力变化均无统计学意义(P＞0.05).结论 重组质粒pGenesil-1MTA1能有效抑制人乳腺癌细胞株MDA-MB-231和MCF-7细胞MTA1基因表达,ERa在MDA-MB-231细胞得到逆转,表达阳性,其高侵袭能力减弱,使干扰肿瘤转移靶基因成为可能.     

AIF靶向短发夹RNA干扰重组载体对神经母细胞瘤细胞SHSY5Y的沉默作用

目的探讨AIF基因短发夹RNA(shRNA)表达质粒对神经母细胞瘤细胞(SHSY5YAIF)基因的干扰作用。方法根据siRNA设计原则,构建靶向AIF基因的短发夹RNA干扰质粒(pGPU6/GFP/AIF),使用脂质体法转染人神经母细胞瘤细胞,通过RT-PCR和Wester blot印迹检测神经母细胞瘤细胞AIF基因mRNA和蛋白表达水平。结果 pGPU6/GFP/AIF重组质粒经限制性内切酶酶切及测序证明基因插入正确。质粒成功转染SHSY5Y细胞后,该细胞的AIFmRNA和蛋白表达明显下降(P0.05)。结论成功构建靶向AIF基因的shRNA表达载体转染神经母细胞瘤细胞,有效抑制AIFmRNA和蛋白表达,为AIF基因靶向治疗提供前期的实验依据。     

TSG101小干扰RNA对SH-SY5Y细胞生长和药物敏感性的作用

目的：探讨TSG101基因对人神经母细胞瘤细胞生长和药物敏感性的调节作用。方法:构建TSG101基因的小干扰RNA载体并将其转导入SH-SY5Y细胞，G418筛选后获得稳定转染的阳性克隆后，应用RT-PCR和Western blotting进行鉴定；MTT法和流式细胞仪检测细胞转染前后生长速度和细胞周期的变化；DNA ladder法和流式细胞仪检测细胞转染前后对顺铂诱导的凋亡的变化；Western blotting检测细胞转染前后凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax，耐药相关蛋白P-gp、MRP的表达变化。结果:成功构建了TSG101的小干扰RNA载体并将其转染SH-SY5Y细胞；筛选到稳定的TSG101低表达的神经母细胞瘤细胞模型；MTT和流式细胞仪检测结果显示，转染TSG101小干扰RNA后的细胞的生长速度显著减慢于对照组（P<0.05），且G1期的细胞比率显著高于对照组（P<0.05）；DNA ladder法和流式细胞仪检测结果显示，用10 mg/L CDDP处理36 h后，转染TSG101小干扰RNA后的细胞的凋亡数显著多于对照组（P<0.05），形成DNA条带；Western blotting显示，转染TSG101小干扰RNA后的细胞中Bcl-2和P-gp的表达明显低于对照组。结论：下调TSG101基因能抑制神经母细胞瘤细胞生长，增加细胞对化疗药物的敏感性，提示TSG101在基因治疗中具有较好的临床应用前景。     

下调Notch1信号抑制人神经母细胞瘤SH-SY5Y的增殖能力

 目的 探讨Notch1基因与人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞增殖能力的关系。方法 应用?-分泌酶抑制剂DAPT或表达Notch1-shRNA慢病毒载体阻断SH-SY5Y细胞Notch1信号的活化,RT-PCR和Western blot法行Notch1及Hes1表达水平的检测,MTT法和裸鼠体内种植检测瘤细胞体内外增殖能力的变化。结果 DAPT处理和表达Notch1-shRNA慢病毒载体转染均能减少细胞内NICD和Hes1表达,其细胞体外增殖能力受到明显抑制(P<0.01),Notch1RNAi细胞体内种植瘤重为0.20±0.13g,明显轻于对照组的0.89±0.58g（P<0.01)。结论 Notch1信号的活化与人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的增殖能力密切相关,有望成为神经母细胞瘤基因治疗的潜在靶点。     

突变型APP基因转染对神经细胞尼古丁受体的影响

目的 探讨阿尔茨海默病(AD)发病机制中的重要物质淀粉样蛋白前体蛋白(APP)高表达对神经型尼古丁受体(nAChR)的影响.方法 将含有瑞典家族性AD双突变的APP670/671基因(APP_(SWE))转入神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞和原代培养的大鼠神经细胞,得到体外构建的高表达APP_(SWE)细胞模型;用即时荧光定量PCR和Western blot方法分别测定APP mRNA、可溶性APP和总APP蛋白表达水平以及nAChR mRNA和蛋白表达水平;用放射性配体[~3H]epibatidine进行nAChR-配体结合试验.结果 转染APP_(SWE)质粒的SH-SY5Y细胞和原代培养的神经细胞中APP mRNA和总APP蛋白表达水平显著升高,在SH-SY5Y细胞的培养液中检测到αAPP分泌量下降;SH-SY5Y细胞转染组α7 nAChR蛋白和mRNA表达水平显著升高,而α3 nAChR蛋白和mRNA表达水平明显下降,并且[~3H]epibatidine配体结合位点明显减少;原代培养的神经细胞转染组α4 nAChR蛋白水平明显下降,但其mRNA水平无明显变化.结论 APP蛋白高表达使体外培养神经细胞中nAChR发生改变,其中α7 nAChR表达水平升高,而含α3和α4亚单位的nAChR表达水平降低,表明APP代谢紊乱可对nAChR产生一定的影响,在AD的发病机制中有重要作用.     

RNA干扰抑制乙酰肝素酶对肺腺癌细胞A549增殖、侵袭和凋亡的影响

目的 探讨抑制乙酰肝素酶表达对人肺腺癌细胞A549增殖、侵袭和凋亡的影响.方法 构建靶向人乙酰肝素酶基因短发夹状双链RNA(shRNA)真核表达质粒(pshRNA-Hpa),用脂质体将其转入A549细胞,建立稳定转染细胞株系,经逆转录.PCR和Western blot法检测转染效率后,分别用四甲基偶氮唑蓝(MTT)、Transwell侵袭实验和流式细胞术(AnnexinV-FITC/PI双染法)检测其对A549细胞增殖、侵袭和凋亡的影响.采用Western blot法检测转染后磷酸化蛋白激酶B(PKB/Akt-Ser473)的表达.结果 转染pshRNA-Hpa的A549细胞乙酰肝素酶mRNA及蛋白表达明显低于未处理A549细胞,抑制率分别为54.09%和48.26%,细胞增殖速度减缓,侵袭能力降低,流式细胞术显示早期细胞凋亡率达(12.53±0.34)%,较空白对照组、空载体转染细胞组和阴性对照组明显增加(P＜0.01).同阴性对照质粒相比,转染pshRNA-Hpa的A549细胞Akt-Ser473的磷酸化水平降低52.15%.结论 靶向乙酰肝素酶重组shRNA质粒pshRNA-Hpa能有效抑制A549细胞乙酰肝素酶的表达,并可能通过下调磷酸化蛋白激酶B途径抑制细胞的增殖侵袭、促进细胞的凋亡.     

小干扰RNA靶向沉默CXCR2基因抑制肝癌细胞的增殖

目的 研究CXCR2-小干扰RNA（siRNA）基因体外抑制肝癌细胞增殖的作用.方法 将CXCR2-siRNA以脂质体转染法转染肝癌细胞hepG2,24h后荧光显微镜观察细胞荧光含量.采用RT-PCR及免疫印迹法分别检测正常肝Chang细胞、未转染肝癌hepG2细胞以及转染CXCR2-siRNA基因后hepG2细胞在转染24、48、72h后的CXCR2 mRNA和蛋白表达水平.以未转染的hepG2细胞为对照,CCK8法检测转染CXCR2-siRNA的hepG-2细胞在转染24、48、72 h后的增殖.以未转染的hepG2细胞为对照,检测转染CXCR2-siRNA 24 h后hepG2细胞与Transwell小室孵育24h时的侵袭能力.结果 CXCR2-siRNA转染hepG2 24 h后镜下可见大量绿色荧光,转染率为80％.hepG2细胞CXCR2mRNA和蛋白表达水平高于Chang细胞（mRNA：1.69±0.22比0.63±0.31,蛋白：1.93±0.25比0.84±0.29,均P＜0.05）.转染CXCR2-siRNA24和48 h后hepG2细胞CXCR2mRNA表达量低于未转染的hepG2细胞（0.75±0.24、0.83±0.21比1.78±0.25,均P＜0.05）,72 h后CXCR2-siRNA虽然仍能抑制hepG2细胞CXCR2mRNA的表达,但与未转染的hepG2细胞相比差异并无统计学意义（1.35±0.18比1.78±0.25,P＞0.05）.转染CXCR2-siRNA24和48 h后的hepG2细胞CXCR2蛋白表达低于未转染的hepG2细胞（0.91±0.25、1.16±0.23比1.98±0.31,均P＜0.05）,转染72 h后蛋白水平有所上升,与对照组相比差异无统计学意义（1.71±0.18比1.98±0.31,P＞0.05）.转染CXCR2-siRNA 24、48、72 h后hepG2细胞mRNA和蛋白表达差异均无统计学意义.与未转染的hepG2细胞相比,转染CXCR2-siRNA 24、48、72 h后hepG2细胞增殖受到抑制（均P＜0.05）.转染CXCR2-siRNA的hepG2细胞对Transwell小室的侵袭能力明显低于未转染的hepG2细胞[（36±5）个腐倍视野（＆#215;200）比（526±9）个府倍视野（＆#215;200）,P＜0.05].结论 siRNA沉默CXCR2基因体外可有效抑制肝癌细胞的增殖.     

白藜芦醇对神经母细胞瘤SH-SY5Y增殖的影响

目的:探讨白藜芦醇(Resveratrol,Res)对人神经母细胞瘤SH-SY5Y增殖变化规律和生长状况的影响。方法:通过不同浓度(0.15～500)μmol/LRes作用于SH-SY5Y,检测药物作用5d后各组细胞增殖率和细胞生长状态,同时通过增殖率曲线获得其半数生长抑制浓度(IC50)和杀伤浓度,并对各组细胞进行Hochest染色,检测其细胞凋亡情况。结果:Res5μmol/L组细胞增殖率为(117.00±15.30)%显著高于空白对照组(P0.05),15μmol/L组细胞增殖率为(31.33±2.89)%,50、150、500μmol/L组,细胞出现负增长。Res对SH-SY5Y的IC50为12.78μmol/L,细胞杀伤浓度(即增殖率为0%)为19.88μmol/L。Res50～500μmol/L各组内,部分细胞皱缩,突起减少或消失,并出现凋亡细胞。结论:Res在0.15～500μmol/L浓度范围内对SH-SY5Y的增殖影响存在浓度依赖性,并依次表现为促进增殖、抑制增殖和杀伤细胞三个方面效应。其中杀伤细胞效应与促进SH-SY5Y的凋亡启动相关。     

RNA干扰端粒酶活性对HeLa细胞生物学行为的影响

目的 观察RNA干扰(RNAi)体外培养的HeLa细胞端粒酶催化亚单位(hTERT)对HeLa细胞生物学行为的影响,进一步探讨端粒酶活性与肿瘤细胞恶性生物学行为的相关性.方法 体外转录法设计合成4条针对hTERT基因的shRNA,脂质体转染HeLa细胞后经免疫荧光染色和端粒重复序列扩增-酶联免疫法(TRAP-ELISA)测定端粒酶活性,筛选出端粒酶沉默效果最佳片段即B链shRNA.以B链shRNA转染HeLa细胞为实验组,转染无关siRNA的HeLa细胞为对照组,显微镜下观察细胞在纤维黏连蛋白(FN)上的铺展;CCK-8细胞计数试剂盒检测细胞在FN上黏附;划痕实验评价细胞迁移;Boyden小室侵袭实验检测细胞侵袭能力.结果 铺展实验显示细胞接种到FN上30 min时,对照组铺展细胞的比率为(31.3±7.9)%,而实验组铺展细胞的比率仅为(5.6±2.3)%,两组差异有统计学意义(P<0.01);2 h后对照组和实验组铺展细胞的比率分别为(79.4±4.8)%和(26.3±6.1)%,两组差异仍有统计学意义(P<0.01);24 h后两组所有细胞几乎均呈铺展状态.细胞黏附实验显示细胞在FN上黏附30 min时对照组细胞黏附率为(83.7±5.4)%,而实验组的细胞黏附率为(67.2±2.8)%,明显低于对照组(P<0.05).划痕实验检测细胞的迁移能力显示实验组细胞24 h迁移率为(27.1±6.2)%,明显低于对照组(58.7±15.0)%.Boyden小室侵袭实验显示在Matrigel胶上培养4 h后,实验组和对照组侵袭的细胞数分别为75.7±14.5和165.1±11.0,差异有统计学意义(P<0.05).结论 降低体外培养HeLa细胞的端粒酶活性使细胞的生物学特性发生改变,表现为减低了HeLa细胞的恶性生物学行为.     

基因Hath1表达对结肠癌细胞的抑制作用

目的研究Hath1基因对结肠癌细胞体外增殖的抑制作用。方法用trizol试剂提取肿瘤细胞总RNA,定量逆转录PCR法检测Hath1在结肠癌细胞和正常组织细胞中的表达;MTS和流式细胞仪法分别检测Hath1在结肠癌细胞中的增殖率和凋亡百分率;构建IEC-6稳定表达Hath1siRNA细胞系,检测Hath1siRNA对IEC-6细胞生长的影响。结果在正常人的小肠与结肠组织及大鼠小肠上皮细胞IEC-6中有着比较高水平的Hath1的表达,而在4株结肠癌细胞中Hath1的表达都很低。在表达Hath1的4株结肠癌细胞SW480、HT29、LS174T、SW620中,其细胞增殖率分别被抑制了38.5%、23.4%、55%、35.6%。在LS174T细胞中Hath1不能有效地诱导肿瘤细胞发生凋亡,但是可以显著地提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。siRNA干扰试验进一步证明了Hath1起到肿瘤抑制基因的作用。结论 Hath1不能有效地诱导肿瘤细胞发生凋亡,但是可以显著地提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。     

DARPP-32基因对SH-SY5Y细胞药物敏感性的调节作用

目的：探讨DARPP-32基因对人神经母细胞瘤细胞药物敏感性的调节作用。方法：构建DARPP-32基因的真核表达载体和小干扰RNA载体，并将它们转导入人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y，G418筛选后获得稳定转染的阳性克隆后，应用RT-PCR和Western blotting进行鉴定；MTT法检测细胞转染前后药物敏感性的变化；流式细胞仪检测细胞转染前后对阿霉素的蓄积浓度的变化；RT-PCR和Western blotting检测细胞转染前后耐药相关蛋白P-gp、MRP和凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达变化。结果：成功构建了DARPP-32基因的真核表达载体和小干扰RNA载体；筛选到稳定的DARPP-32高/低表达的神经母细胞瘤细胞模型；MTT试验和流式细胞仪检测结果显示，上调DARPP-32的表达能够显著增强神经母细胞瘤细胞对长春新碱、阿霉素、5-氟尿嘧啶和顺铂的敏感性，提高细胞内阿霉素的蓄积（P<0.05），转染DARPP-32小干扰RNA后的细胞对化疗药物的敏感性降低，细胞内的阿霉素蓄积量显著减少（P<0.05）；RT-PCR和Western blotting结果显示，DARPP-32能够下调 P-gp 和Bcl-2的表达。结论：DARPP-32基因能够调节神经母细胞瘤细胞对化疗药物的敏感性，具有较好的临床应用前景。     

RNA干扰技术抑制上皮性钙黏附分子表达对HO-8910细胞的影响

目的 探讨通过RNA干扰(RNAi)技术下调上皮性钙黏附分子(E-cad)表达后,对人卵巢浆液性囊腺癌HO-8910细胞的侵袭、迁移能力的影响.方法 将针对E-cad的双链小干扰RNA(siRNA)转染入HO-8910细胞中,抑制E-cad基因表达;采用免疫荧光法及Western blotting检测RNAi效果;用Transwell小室法检测RNAi后细胞侵袭、迁移能力的改变.结果 RNAi后HO-8910细胞E-cad表达显著下降,由63.7%降低为11.9%(P＜0.01),RNAi有效;细胞对细胞外基质的侵袭能力明显提高,穿过滤膜的细胞数由13.4±3.93增至42.0±4.15(P＜0.01);细胞迁移能力也明显提高,穿过滤膜的细胞数由23.24±3.71增至82.0±5.51(P＜0.01).结论 人卵巢浆液性囊腺癌的侵袭、转移等恶性行为可能与E-cad基因表达下降有关.     

组织因子siRNA表达载体的构建及其抑制人神经母细胞瘤细胞组织因子表达的研究

目的:构建组织因子(TF)特异性小干扰RNA(siRNA)表达载体,观察其对人神经母细胞瘤细胞TF表达的影响。方法:分子生物学方法构建TFsiRNA-pSUPER表达载体,限制酶切予以初步筛选,基因测序进行证实。以脂质体Lipo-fectamine2000介导转染人神经母细胞瘤细胞系SK-N-MC。以WesternBlotting检测TF表达。结果:所构建TFsiRNA-pSUPER表达载体经基因测序证实。SK-N-MC细胞高表达TF,TFsiRNA-pSUPER表达载体转染48h后,TF表达水平与转染pSUPER质粒的对照细胞相比显著降低,呈剂量依赖性。结论:人神经母细胞瘤SK-N-MC中TF异常高表达,本研究构建的TFsiRNA表达载体可在SK-N-MC中特异性下调TF表达,可作为干预TF表达、研究其非凝血功能的有效手段。     

RNA干扰同源盒A10表达对K562细胞增殖及凋亡的影响

目的 通过构建靶向同源盒A10(HOXA10)的真核表达载体,探讨利用RNA干扰沉默HOXA10基因对人慢性髓系白血病细胞株K562增殖和凋亡的影响.方法 根据筛选的针对HOXA10的特异性有效小干扰RNA(siRNA)序列设计合成短发夹RNA(shRNA)寡核苷酸链,构建pGPHI-GFP-Neo-HOXA10真核表达载体并测序,应用阳离子脂质体转染K562细胞.实验分为细胞对照组(仅加等量细胞及培养基),阴性对照组(脂质体转染阴性对照质粒)、实验组(脂质体转染pGPHI-GFP-Neo-HOXA10).转染载体24 h后利用RT-PCR检测各组HOXA10 mRNA表达;转染载体24、48、72 h后应用MTT法检测各组细胞增殖并计算细胞抑制率;转染载体48 h后应用流式细胞术检测各组细胞凋亡.结果 成功构建pGPHI-GFP-Neo-HOXA10载体并转染K562细胞.与细胞对照组和阴性对照组比较,实验组转染载体能有效降低HOXA10 mRNA的表达水平[(38.86±4.49)％比(88.52±9.24)％、(86.75±7.38)％,P＜0.05],而阴性对照组与细胞对照组比较差异则无统计学意义(P＞0.05).与阴性对照组比较,实验组载体作用于K562细胞24、48、72 h后,细胞增殖能力均明显下降,细胞抑制率明显升高[(39.92±0.74)％比(7.98±5.52)％;(55.62±1.18)％比(8.27±3.45)％;(66.30±1.26)％比(8.63±3.58)％;均P＜0.05].实验组细胞凋亡率较细胞对照组、阴性对照组也显著升高[(22.29±1.67)％比(9.82±0.69)％、(10.14±0.96)％,P＜0.05],而阴性对照组与细胞对照组比较差异则没有统计学意义(P＞0.05).结论 构建的真核表达载体pGPHI-GFP-Neo-HOXA10可有效沉默K562细胞中HOXA10基因的表达,能明显抑制K562细胞增殖并诱导其凋亡.     

Survivin特异小干扰RNA表达载体构建及对肺腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的测定Survivin特异小干扰RNA(siRNA)表达载体对肺腺癌细胞A549 Survivin基因表达的抑制及对增殖和凋亡的影响。方法构建Survivin特异性小干扰RNA表达载体,转染A549细胞,筛选出稳定表达的细胞株。用荧光实时定量反转录聚合酶链反应法、Western blot和免疫组化法检测Survivin基因mRNA和蛋白的表达水平,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞活性,流式细胞仪测定细胞凋亡率。结果经测序鉴定证实成功构建Survivin-siRNA表达载体。Survivin基因mRNA表达量下降76.4%,Western blot显示蛋白表达下降84.5%,免疫组化法也显示Survivin蛋白表达下降。MTT法测定细胞增殖较对照组减慢(P<0.01),细胞凋亡率较对照组增加8.95%(P<0.01)。结论Survivin特异siRNA表达载体下调Survivin基因表达,抑制A549细胞的增殖,促进凋亡。     

同源无启动子DNA片段抑制人胰腺癌细胞株整合基因的表达

目的观察仅转染无启动子绿色荧光蛋白（GFP）的cDNA全长片段能否使整合有GFP基因的胰腺癌细胞内GFP表达降低。方法用pEGFP—C1质粒转染人胰腺癌细胞株PANC-1,G418筛选及流式细胞术分选建立GFP蛋白高表达的稳定细胞株。用PCR方法从pEGFP—C1扩增出GFP基因全长cDNA并将其克隆至无启动子的复制型质粒PUC19,得到重组质粒即PUC—GFP。实验分为4组：空白对照组、空质粒组（PUC组）、GFP重组质粒干扰组（PUC—GFP组）、GFP小RNA干扰组（siGFP组）。分别用稳定表达GFP和未经处理PANC-1细胞进行实验。用Western印迹、流式细胞术与倒置荧光显微镜检测重组质粒对细胞内稳定表达的GFP的影响及对GFP阴性细胞pEGFPC1质粒瞬时转染后绿色荧光表达强度的影响。结果PUC—GFP可使稳定细胞株内的GFP表达下降,并且呈剂量依赖性。PUC—GFP组绿色荧光强度减弱程度和空白对照及空质粒组差异有统计学意义（P〈0．05）和siGFP组差异无统计学意义（P〉0．05）。转染后第4天GFP表达降低并可持续至第6天,第4天后PUC—GFP组和siGFP组对GFP的抑制差异无统计学意义（P〉0．05）。PUC—GFP与pEGFP—C1共转染GFP阴性PANC-1细胞株可使pEGPC1的瞬时转染效率降低。这两种情况下,荧光降低程度均和转染PUC—GFP的量呈正相关。结论仅转染无启动子的某个特定基因的全长cDNA能使哺乳细胞内相应同源性基因的表达降低。DNA干扰可用于哺乳动物细胞。     

RNA干扰技术抑制JEG-3细胞中HLA-G的表达

目的:以人类白细胞抗原G基因(HLA-G)为靶基因,采用RNA干扰(RNAi)技术特异性地抑制JEG-3细胞中HLA-G的表达。方法:针对HLA-G基因设计一段小干扰RNA(siRNA),由Ambion公司化学合成,用脂质体lipofectamine2000将该siRNA转染JEG-3细胞,采用RT-PCR、流式细胞术和Westernblot分别从mRNA和蛋白质水平检测该siRNA对HLA-G表达的影响。结果:针对HLA-G的siRNA能够明显下调JEG-3细胞中HLA-G的表达水平,并具有良好的特异性。结论:在JEG-3细胞系中采用RNAi技术特异性下调了HLA-G基因的表达,为进一步研究HLA-G在人类的母胎免疫耐受、正常妊娠的维持及助孕技术应用等方面的作用奠定了实验基础。