正义、反义Id1真核表达载体的构建及其对胃癌细胞的转染

目的构建正义、反义Id1真核表达载体,并转染胃癌SGC7901细胞株,筛选稳定表达的细胞株。方法设计Id1基因两端的引物,RT-PCR扩增Id1全长序列。将目的基因插入pcDNA3.1＋/Hygro构建正义Id1真核表达载体,插入pcDNA3.1-/Hygro构建反义Id1真核表达载体。脂质体转染法转染胃癌SGC7901细胞系,潮霉素筛选稳定表达的细胞株。结果RT-PCR法获得长约530 bp的Id1全长序列,经酶切及测序鉴定正确后转染胃癌SGC7901细胞株。经过潮霉素筛选8周,获得抗性的细胞株。经Western-blot鉴定,转染正义Id1真核表达载体的细胞株Id1蛋白表达水平高于对照组,而转染反义Id1真核表达载体的细胞株Id1蛋白表达水平低于对照组。结论成功构建正义、反义Id1真核表达载体并转染胃癌SGC7901细胞株,为进一步研究打下基础。     

SV40T抗原真核表达载体的构建及表达

目的:构建SV40T抗原的特异性真核表达载体,并导入胃癌细胞株SGC7901进行表达鉴定.方法:扩增小鼠H /K ATPase β亚基启动子,与pMT18-T载体相连,并将其亚克隆至真核表达载体 pcDNA3.1(-),构建pcDNA3.1(-)/HK; 从含有SV40T基因的pLITAg质粒酶切回收SV40T基因,与pcDNA3.1(-)/HK相连,构建胃壁细胞特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV,同时构建非特异性表达载体pcDNA3.1(-)/SV,进行酶切及测序鉴定.用脂质体转染的方法将构建的载体导入胃癌细胞株SGC7901,PCR扩增基因组DNA,RT-PCR检测SV40T mRNA的表达.结果:限制性内切酶分析与测序结果显示,真核表达载体pcDNA3.1/HKSK构建成功;转染该载体的SGC7901细胞可检测到SV40T基因DNA的存在,且有SV40T mRNA的表达.结论:特异性表达SV40T基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV构建成功.     

TSG101 siRNA表达载体的构建及其作用研究

目的构建TSG101（tumor susceptibility gene 101，TSG101）小于扰RNA（TSG101 siRNA）的真核表达载体并鉴定，初步研究其与胃癌多药耐药的相关性。方法根据小于扰RNA的设计原则由计算机软件辅助设计TSG101的靶序列，应用DNA重组技术将目的序列克隆入小干扰RNA的表达载体；将TSG101 siRNA的真核表达载体转染胃癌长春新碱（VCR）耐药细胞SGC7901／VCR，通过Western blot鉴定TSG101 siRNA的抑制效率；以MTT实验检测细胞生长曲线和对VCR、阿霉素（ADM）的药物敏感性。结果所构建的载体经酶切后释放出预期大小的片断并经测序证实；TSG101 siRNA真核表达载体瞬时转染胃癌耐药细胞SGC7901／VCR后，发现TSG101的表达被显著抑制；细胞生长减慢，且对VCR、ADR的敏感性增加。结论成功构建了TSG101 siRNA的真核表达载体，并初步提示其参与了胃癌的多药耐药，为下一步工作奠定了基础。     

Sorcin蛋白质高表达与胃癌细胞多药耐药的关系

目的：应用蛋白质组学技术筛选胃癌耐药相关的蛋白质。方法：以胃癌细胞SGC7901和长春新碱诱导的耐药胃癌细胞SGC7901／VCR为研究对象，应用二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（2-DE）技术分离两种细胞的总蛋白，图像分析识别差异表达的蛋白质点，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）及电喷雾串联质谱（ESI-Q-TOF）对差异表达的蛋白质点进行鉴定。Western blot验证差异蛋白质的表达水平，反义核酸技术分析差异蛋白与胃癌耐药的关系。结果：可溶性耐药相关性钙结合蛋白（sorcin）在SGC7901／VCR细胞中高表达，反义核酸抑制sorcin表达可增强SGC7901／VCR对长春新碱的化疗敏感性。结论：Sorcin蛋白质高表达与胃癌细胞多药耐药密切相关。     

人midkine基因重组逆转录病毒载体构建及鉴定

目的 构建人中期因子(MDK)基因重组逆转录病毒载体,转染人胃癌SGC7901细胞株,为探讨MDK的生物学功能奠定基础.方法 扩增人MDK编码序列基因片段,经限制性内切酶酶切后将目的 片段插入pLXSN逆转录病毒载体.经酶切及测序鉴定后与pVSVG共转染GP293包装细胞,收集病毒上清感染人胃癌SGC7901细胞,G418筛选获得阳性细胞株.,结果酶切及DNA测序证实MDK基因重组逆转录病毒载体构建正确.病毒上清感染SGC7901细胞,G418筛选出阳性克隆,经实时定量PCR及Western blot检测发现SGC7901细胞中MDK mRNA及蛋白表达水平明显上调.结论 成功构建了高表达MDK的SGC7901细胞株,为进一步探讨其生物学功能奠定实验基础.     

人PDX-1基因真核表达载体的构建及表达

目的构建人胰十二指肠同源盒(PDX-1)基因的真核表达载体,观察其在NIH3T3细胞中的表达。方法以人胰岛细胞瘤cDNA为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增PDX-1基因编码区的全部序列,克隆入真核细胞表达载体pcDNA3.1中,经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因。序列正确的重组质粒用脂质体转染NIH3T3细胞,Western blot观察基因表达情况。结果PCR扩增的特异性片段长度为852 bp,以此构建的重组质粒pcDNA3.1-PDX-1,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后显示5.5 kb和850 bp左右的两条片段,测序结果与GenBank中的人PDX-1基因cDNA(GenBank序列号NM_000209)序列一致。证明PDX-1基因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3.1中。Western blot证实pcDNA3.1-PDX-1转染NIH3T3细胞24 h后有PDX-1的表达。结论成功构建了pcDNA3.1-PDX-1重组真核表达载体,并在NIH3T3细胞中表达。     

miR-125b靶向抑制BCL2?MCL1表达对胃癌SGC7901/VCR细胞多药耐药性的影响

目的:研究miR-125b在胃癌SGC7901/VCR细胞多药耐药形成中的作用。方法:运用miRNA实时定量PCR方法检测miR-125b在SGC7901/VCR细胞与母代SGC7901细胞中的表达差异,运用Western blot检测SGC7901/VCR细胞与母代SGC7901细胞抗凋亡蛋白BCL2、MCL1的表达差异,分别构建BCL2、MCL1 3’UTR荧光素酶报告质粒验证miR-125b的靶基因,在耐药细胞株中瞬时转染miR-125b模拟物以检测上调miR-125b对SGC7901/VCR细胞BCL2、MCL1蛋白表达及多药耐药性的影响,并运用流式细胞术检测转染后耐药细胞对长春新碱诱导凋亡的影响。结果:miR-125b在SGC7901/VCR细胞中呈低表达,抗凋亡蛋白BCL2、MCL1在SGC7901/VCR细胞中呈高表达,荧光素酶报告实验证实BCL2、MCL1是直接受miR-125b调控的靶基因,在耐药株中上调miR-125b显著抑制BCL2、MCL1蛋白表达水平,显著增加细胞对长春新碱、顺铂、阿霉素、依托泊苷的敏感性,并显著增加细胞对长春新碱诱导的凋亡。结论:miR-125b靶向抑制BCL2、M...     

BHRF1基因对丝裂霉素诱导胃癌细胞SGC7901凋亡影响

目的探讨EB病毒早期基因BHRF1的表达对丝裂霉素诱发胃癌细胞SGC7901凋亡的影响。方法构建pcDNA3.1-BHRF1表达载体,应用脂质体转染法将BHRF1表达载体转染胃癌细胞系SGC7901,MTT法检测细胞生长情况。实验分为细胞对照组、空载体对照组和目的基因转染组,细胞对照组仅接种SGC7901细胞,空载体对照组将pcDNA3.1空载体转染入SGC7901细胞中,目的基因转染组将重组质粒pcDNA3.1-BHRF1转染入SGC7901细胞中。分别培养24、48和72 h后,用浓度为30 mg/L的丝裂霉素处理,流式细胞术检测细胞凋亡率,Hoechst33258荧光染色方法检测凋亡小体。结果 pcDNA3.1-BHRF1重组质粒构建成功。MTT实验显示目的基因转染能明显拮抗由于丝裂霉素作用导致的细胞生长抑制;BHRF1转染+丝裂霉素处理组凋亡小体明显少于对照组,细胞凋亡率明显低于对照组,差异均有统计学意义(F=6 250.510,q=56.992、51.613,P<0.01)。结论 BHRF1基因具有明显拮抗丝裂霉素诱导胃癌SGC7901细胞凋亡的作用。     

PDX1正义表达载体的构建及表达

目的：亚克隆人胰十二指肠同源框-1 (PDX-1)基因,构建PDX1正义表达重组质粒。方法：亚克隆PDX1基因至真核表达载体pcDNA3.1,双酶切及测序鉴定。同时瞬时转染胃癌细胞株,免疫印迹法检测PDX1的过表达。结果：双酶切和测序鉴定结果正确;PDX1正义表达载体转染SGC7901和TMK1细胞24h后,PDX1蛋白表达水平显著升高。结论：成功获得正义表达重组质粒pcDNA-PDX1,顺利在胃癌细胞中过表达PDX1,为进一步研究PDX1在胃癌发生发展中的作用奠定了基础。     

1pcDNA3.1-Ercc6l真核表达载体的构建及在P19细胞内的表达

目的构建Ercc6l的正、反义真核表达载体,并在P19胚胎癌细胞内瞬时表达,在细胞学水平对基因功能进行初步研究。方法KpnⅠ/XhoⅠ双酶切pGEM-T-Ercc6l获得目的基因Ercc6l,将其克隆到同样经过双酶切的真核表达载体pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(-)Myc His6,重组质粒pcDNA3.1(+/-)-Ercc6l经菌落PCR和双酶切鉴定;脂质体介导法体外瞬时转染正义载体至P19细胞,RT-PCR检测基因在细胞内的表达活性情况。结果重组质粒经菌落PCR和KpnⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定,表明真核表达载体构建正确;脂质体介导法瞬时转染正义载体至P19细胞后,检测表明转染细胞能够表达Ercc6l。结论成功构建了Ercc6l正、反义真核表达载体,其正义载体转染真核细胞后能在其中表达。     

HPLC法测定23-羟基白桦酸注射液中23-羟基白桦酸的含量

目的　建立 2 3-羟基白桦酸注射液中 2 3-羟基白桦酸的 HPL C分析方法。方法　采用 HPL C法。色谱柱 :YWG C1 8(2 5 0 mm× 4 .6 mm,10 μm) ;流动相 :乙腈 -水 -冰醋酸 (6 0 0∶ 4 0 0∶ 1) ;体积流量 :1.0 m L/ min;检测波长 :2 0 5 nm;柱温 :2 5℃ ;检测灵敏度 :0 .0 0 5 AU FS。采用外标法测定 2 3-羟基白桦酸的量。结果　 2 3-羟基白桦酸在 10～10 0 μg与峰面积具有良好线性关系 ,平均回收率为 99.5 4 % ,RSD为 1.98% (n=5 )。结论　该方法快速、简便、准确可靠 ,可用于 2 3-羟基白桦酸的定量。     

COX-2和nm23在乳腺癌组织中的表达及其相关性

目的 研究乳腺癌组织中环氧化酶-2和nm23的表达及其相关性。方法 采用免疫组织化学方法检测41例乳腺癌组织中COX-2与nm23的表达情况,分析其相互关系。结果 41例乳腺癌组织中COX-2表达阳性率43.9%（18/41）,nm23表达阳性率75.6%（31/41）。在31例nm23阳性的病例中,COX-2表达阳性10例（32.3%）,阴性21例（67.7%）。在10例nm23表达阴性的病例中,COX-2表达阳性8例（80%）,阴性2例（20%）,经统计学处理两者具有相关性（P〈0.05）。结论 COX-2在乳腺癌组织中表达且与nm23呈负相关,提示COX-2表达与乳腺癌的转移有关,COX-2表达增高和nm23表达的降低可作为临床预测乳腺癌淋巴结转移的重要参考指标。     

非小细胞肺癌组织中caspase23 mRNA的表达及患者生存分析

目的检测人非小细胞肺癌组织中caspase23基因mRNA表达水平,了解对非小细胞肺癌患者术后生存情况及其影响因素。方法运用实时定量PCR技术测定60例非小细胞肺癌患者的癌及配对癌旁组织中caspase23基因mRNA表达水平进行生存分析。结果非小细胞肺癌组织中caspase23mRNA表达水平显著高于其配对的癌旁组织,其中71.67%(43/60)患者caspase23mRNA高表达,28.33%(17/60)患者低表达。caspase23的表达水平、淋巴结转移、家族史、病理分级与患者的生存率显著相关。结论非小细胞肺癌组织中caspase23的高表达可能影响非小细胞肺癌患者术后的生存,其可作为非小细胞肺癌患者预后的一个评价指标,并可能成为基因治疗的一个作用靶点。     

母乳性黄疸患儿体液免疫变化的临床研究

目的探讨母乳性黄疸患儿体液免疫的变化特点。并分析血清胆红素水平与体液免疫各指标的相互关系。方法观察组选择母乳性黄疸患儿38例．按血清胆红索水平分为A组（血清胆红素〈205μmol／L）和B组（血清胆红素≥205μmol／L）；对照组选择健康儿40例为C组，采用流式细胞术检测CD23。免疫比浊法检测免疫球蛋白。结果B组CD23、IgA、IgG、IgM明显低于A组及C组（P〈0．01）．A组CD23、IgA、IgG、IgM明显低于C组（P〈0．01）。结论母乳性黄疸患儿血清胆红素浓度稍增高即可降低患儿的体液免疫功能。     

IL-23在鼻息肉组织中的表达及其与嗜酸性粒细胞浸润的关系

目的 观察IL-23在鼻息肉（NP）组织中的表达及在鼻息肉发病机制中的作用.方法 选择鼻息肉患者手术切除标本30例（观察组）、同期行单纯鼻中隔手术的下鼻甲黏膜10例（对照组）,采用免疫组化法检测IL-23的表达情况,HE染色检测嗜酸性粒细胞数.采用SPSS17.0统计软件分析指标与鼻息肉病理特征之间的关系.结果 观察组IL-23阳性细胞数、嗜酸性粒细胞数均明显高于对照组,差异有显著性（P＜0.05）,且IL-23的表达与嗜酸性粒细胞的浸润一致.结论 IL-23在鼻息肉组织中的离表达及与嗜酸性粒细胞的关系与鼻息肉的发生和发展关系密切.     

下咽癌EGFR、NM23、Bcl 2基因表达与临床意义

目的研究EGFR、NM23和Bcl 2基因在下咽鳞状细胞癌组织中的表达规律及与下咽癌临床病理因素的关系,评价其在临床应用的价值。方法下咽癌29例手术后石蜡包埋组织,制作切片,用免疫组化SP法检测EGFR、NM23和Bcl 2基因的表达,分析它们与下咽癌临床病理因素之间的相关关系。结果EGFR、NM23和Bcl 2的阳性表达率,分别为62%(18/29)、79%(23/29)和86%(25/29)。EGFR在低分化癌组的阳性表达率高于高中分化组（P=0.021）,在淋巴结转移组的阳性表达率明显高于无淋巴结转移组（P=0.018）。NM23和Bcl 2与临床病理因素无关。结论EGFR在下咽癌的高表达与分化及淋巴结转移密切相关,可以作为辅助判断下咽癌临床特性的生物学指标。NM23 和Bcl 2表达的规律,有待进一步研究。     

EB病毒LMP1 CTAR23蛋白特异性结合短肽的筛选

目的 利用噬菌体12肽库筛选能与EB病毒(EBV)LMP1 CTAR23蛋白高效结合的短肽.方法 利用亲和层析柱加酶切的方法 纯化CTAR23蛋白,并用其筛选噬菌体12肽库.通过夹心ELISA法分析噬菌体克隆与CTAR23蛋白的亲和力.通过硝酸纤维膜斑点印迹法进行阳性克隆鉴定,并对阳性克隆进行测序及序列分析.结果 对12肽库进行3轮筛选后,噬菌体克隆具有良好的富集效果.ELISA提示筛选出来的噬菌体克隆能与CTAR23蛋白高效结合.硝酸纤维膜斑点印迹法证实阳性率达到100%,测序结果 显示噬菌体上的短肽有共同序列HVSLHKHYPTAS.结论 噬菌体短肽HVSLHKHYPTAS为研究LMP1致瘤机理、开发拮抗LMP1蛋白的小分子短肽类药物奠定坚实的基础.     

肝细胞癌组织中PCNA和nm23的表达与转移的关系

目的 :探讨PCNA和nm2 3的表达与肝细胞癌 (HCC)转移的关系。方法 :采用免疫组织化学技术检测 5 6例HCC中PCNA和nm2 3蛋白的表达。结果 :5 6例HCC中 ,PCNA和nm2 3的表达强度均与HCC分化程度呈明显相关 ,分化愈差 ,PCNA表达愈强 ,而 nm2 3表达愈弱 ;PCNA和 nm2 3的表达强度呈明显负相关 (P <0 .0 1) ;有转移组PCNA的表达强度明显高于无转移组 (P <0 .0 1) ,而nm2 3则相反 (P <0 .0 1)。结论 :PCNA和nm2 3蛋白的表达水平能反映HCC的分化程度和发生转移的潜能 ,可作为判断HCC预后的参考指标之一     

肝细胞癌中乙酰肝素酶与NM23的表达及其临床意义

目的：探讨乙酰肝素酶（HPA）和NM23在肝细胞癌（HCC）中的表达及临床意义。方法：应用免疫组织化学方法检测72例HCC,62例肝硬化及23例正常肝组织HPA和NM23的表达水平,并分析其与HCC临床病理特征的关系。结果：HPA阳性率在HCC中明显高于肝硬化组（P=0．000）及正常肝组（P=0．001）;在临床TNM分期中Ⅰ、Ⅱ期明显低于Ⅲ、Ⅳ期（P=0．001）;无转移组明显低于转移组（P=0．000）;在AFP≥400μg／L组、有门脉癌栓组和多个肿瘤结节组分别明显高于AFP〈400ptg／L组（P=0．01）、无门脉癌栓组（P=0．000）和单个肿瘤结节组（P=0．000）。NM23阳性率在HCC中明显低于肝硬化组（P=0．009）及正常肝组（P=0．000）;在TNM分期Ⅰ、Ⅱ期明显高于Ⅲ、Ⅳ期（P=0．001）;在无转移组明显高于转移组（P=0．000）;在AFP≥400μg／L组和有门脉癌栓组分别明显低于AFP〈400μg／L组（P=0．02）和无门脉癌栓组（P=0．005）。HPA与NM23表达呈负相关（r=-0．271,P=0．001）。结论：HPA高表达与NM23低表达在HCC的发生发展及转移中起重要作用,联合检测HPA与NM23蛋白指标有助于HCC诊断和判断患者预后。     

MMP-9、ERK2及nm23与乳腺癌发生发展的关系

目的探讨MMP-9、ERK2及nm23与乳腺癌发生发展的联系。方法采用免疫组化法检测乳腺腺病、乳腺纤维腺瘤和乳腺癌组织MMP-9、ERK2及nm23基因蛋白的表达。结果 MMP-9和ERK2表达在乳腺癌组织明显高于乳腺纤维腺瘤和乳腺腺病组织,且三组比较有统计学意义（P〈0.05）,MMP-9、nm23表达与乳腺癌患者TNM分期、肿瘤直径、术后生存时间、淋巴结转移个数均呈显著正相关（P〈0.05）,ERK2表达与TNM分期成正相关（P〈0.05）。乳腺癌组织nm23基因蛋白的表达明显低于乳腺纤维腺瘤和乳腺腺病组织,且三组比较有统计学意义（P〈0.05）;乳腺癌组织中,ERK2与MMP-9表达呈显著正相关,nm23与MMP-9、ERK2表达呈显著负相关。结论 MMP-9可能通过降解细胞外基质促进乳腺癌的浸润转移,影响患者临床分期;nm23参与抑制乳腺癌的浸润转移,通过抑制ERK信号转导系统的活性减少乳腺癌细胞增殖能力,可能是抑制乳腺癌转移的机制之一。