嗅感觉神经细胞的分离与培养

目的 建立哺乳动物嗅感觉神经细胞体外培养的方法。方法 取成年家兔的嗅区粘膜，用胰酶和胶原酶消化法进行嗅感觉神经细胞的分离与原代培养，并应用抗神经微丝蛋白(NFP)抗体、抗嗅觉标记蛋白(OMP)抗体进行免疫细胞化学染色，同时采用甲苯胺蓝神经特异性染色和扫描电镜对其进行鉴定。结果 从嗅粘膜分离以及原代培养得到的嗅感觉神经元，光镜、电镜下为典型的双极神经元，OMP、NFP阳性，神经元特异性染色阳性。分离的嗅感觉神经元可在体外存活数小时，其细胞形态、生存数量和存活时间均能满足体外实验的基本要求。结论 本实验在家兔建立了较稳定、可靠的嗅感觉神经细胞分离和原代培养方法。为深入开展嗅感觉神经细胞的离体研究，提供了较为理想的材料来源和技术保障。     

鼠和人胎儿嗅粘膜与犁鼻器官的免疫组织化学观察

应用免疫组织化学方法观察了神经原特异性烯醇化酶（ＮＳＥ）、神经胶质特异性Ｓ－１００蛋白（Ｓ－１００）和细胞角质素（ＣＫ）三种抗体在豚鼠。大鼠和人胎儿嗅粘膜和犁鼻器官的正常分布情况。结果发现以上三种抗体联合应用可以显示除支持细胞和微绒毛细胞外所有的嗅粘膜结构，是研究正常嗅粘膜和嗅粘膜病理改变的良好方法。豚鼠、大鼠犁鼻器官内侧被覆ＮＳＥ阳性的嗅上皮，具有感觉功能。７个月人胎儿鼻中隔两侧的犁鼻器官对ＮＳＥ染色呈阴性反应，因此，新生儿和成年人的犁鼻器官不可能具有象低等动物那样的辅助嗅觉的功能。     

鼠和人胎儿嗅粘膜与犁鼻器官的免疫组织化学观察

应用免疫组织化学方法观察了神经原特异性烯醇化酶（ＮＳＥ）、神经胶质特异性Ｓ－１００蛋白（Ｓ－１００）和细胞角质素（ＣＫ）三种抗体在豚鼠、大鼠和人胎儿嗅粘膜和犁鼻器官的正常分布情况。结果发现以上三种抗体联合应用可以显示除支持细胞和微绒毛细胞外所有的嗅粘膜结构，是研究正常嗅粘膜和嗅粘膜病理改变的良好方法。豚鼠、大鼠犁鼻器官内侧被覆ＮＳＥ阳性的嗅上皮，具有感觉功能。７个月人胎儿鼻中隔两侧的犁鼻器官对ＮＳ     

人类嗅粘膜免疫屏障特征

鼻粘膜具有特殊的免疫系统,即分泌性免疫系统和粘膜免疫系统。已证实,大鼠、蝾螈嗅粘膜有防御屏障存在,人类嗅粘膜免疫屏障尚未见报道。为此,作者用对嗅感受器神经元具有特异性的嗅标记蛋白(olfactory marker protein,OMP)经免疫组织化学染色,对人类嗅粘膜分泌性免疫系统、体液因子、非免疫性防御因子的组成成分及其分布进行了研究。发现嗅粘膜的分泌性免疫系统包括IgA、IgM、分泌成分和J链,位于嗅腺腺泡、腺泡细胞和粘     

嗅球损伤后嗅粘膜的免疫病理变化

作者用体重50～80g的Wistar大鼠81只,戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,解剖显微镜下去除前额部邻近嗅球的小块骨质,用吸引器吸除一侧嗅球,术腔用明胶海绵充填。手术后1、2、3、4、5、7、8、10、24、28、49及84天分别处死,经心脏灌注Bouin氏液后,头部固定脱钙,石蜡包埋切片。HE染色及兔抗鼠嗅觉标志蛋白(OMP)、兔抗人神经特异性烯醇酶(NSE)行免疫组织化学染色(ABC法),研究嗅球损伤后,嗅粘膜退变与再生的变化。     

外伤性嗅觉障碍的嗅粘膜免疫组织化学变化

对2例因头外伤引起嗅觉障碍者,于伤后1月、4个半月取嗅粘膜行免疫组织化学检查。结果发现,在嗅上皮中嗅细胞神经元特异性烯醇酶的免疫反应活性消失。在嗅粘膜固有层中,一些结构破坏了的Bowman氏腺和神经束中存在神经胶质特异性的S—100蛋白免疫反     

大鼠嗅上皮神经干细胞的分离及培养

目的：从新生及成年大鼠嗅上皮分离培养嗅上皮神经干细胞（NSC）,研究其增殖及分化特性。方法：采用含10％胎牛血清的DMEM／F12（1：1）培养液,分离、培养生后第3天和硫酸锌原位创伤后6d的成年大鼠嗅上皮NSC,应用间接免疫荧光染色鉴定培养的NSC及分化的特异性神经细胞类型,四甲基偶氮唑盐法（MTT）测定嗅上皮NSC的生长曲线及生长因子的影响。结果：从生后第3天和成年大鼠嗅上皮分离、培养出巢蛋白免疫反应阳性而细胞角蛋白免疫反应阴性,并能分化为神经元和星形胶质细胞的NSC。生后第3天和成年大鼠嗅上皮NSC生存能力的差异无统计学意义（P〉O．05）,细胞克隆形成率为0．05％～0．10％。碱性成纤维细胞生长因子可以显著促进嗅上皮NSC的增殖。结论：从生后第3天和成年大鼠嗅上皮可培养出具有自我复制和多向分化潜能的NSC。     

鼻科学

2仪M侧)19神经特异性烯醇化酶及嗅标记蛋白在不同胎龄胎儿嗅私膜中的表达/史丽…//中华耳鼻咽喉科杂志一2(X)3,38(3)一180一282 目的:探讨神经特异性烯醇化酶(NSE)及嗅标记蛋白(OMP)在不同胎龄胎儿嗅勃膜中的表达(方法:以免疫组化方法检测NSE及OMP在12、16、20、24、28和34周6例不同胎龄胎儿嗅豁膜中的表达。结果:NSE免疫阳性反应在孕12一34周的胎儿嗅薪膜中均有表达,各胎龄胎儿嗅勃膜切片中均可见大量阳性着色的双极嗅神经细胞。孕]2周时,阳性细胞数量很多,排列紧密,胞体多位于嗅上皮中下部且阳性嗅神经上皮占据胎儿鼻腔上2/3的茹膜…     

螺旋神经节神经元原代培养及其免疫细胞化学鉴定

目的建立成体哺乳动物耳蜗螺旋神经节神经元（ｓｐｉｒａｌｇａｎｇｌｉｏｎｎｅｕｒｏｎ，ＳＧＮ）体外培养的细胞模型。方法对出生后７ｄ的Ｗｉｓｔａｒ大鼠的螺旋神经节细胞进行解离与分散培养。用荧光显微镜与倒置相差显微镜观察原代培养ＳＧＮ细胞的活力以及生长与分化过程。应用链霉卵白素过氧化物酶（ＳＰ）方法和抗神经丝蛋白单克隆抗体（ＮＦＰＭｃＡｂ）对ＳＧＮ进行免疫细胞化学染色鉴定。结果幼龄Ｗｉｓｔａｒ大鼠的ＳＧＮ在体外条件下，可良好存活并有正常的表型分化，表现出稳定的神经元可塑性。其细胞数量与形态以及存活周期可满足体外实验的基本要求。结论此方法扩大了内耳组织培养的材料来源，有助于外周听觉系统离体研究的开展。     

神经特异性烯醇化酶及嗅标记蛋白在不同胎龄胎儿嗅黏膜中的表达

目的　探讨神经特异性烯醇化酶 (neuron specificenolase ,NSE)及嗅标记蛋白 (olfactorymarkerprotein ,OMP)在不同胎龄胎儿嗅黏膜中的表达。方法　以免疫组化方法检测NSE及OMP在1 2、1 6、2 0、2 4、2 8和 34周 6例不同胎龄胎儿嗅黏膜中的表达。结果　NSE免疫阳性反应在孕 1 2～ 34周的胎儿嗅黏膜中均有表达 ,各胎龄胎儿嗅黏膜切片中均可见大量阳性着色的双极嗅神经细胞。孕1 2周时 ,阳性细胞数量很多 ,排列紧密 ,胞体多位于嗅上皮中下部且阳性嗅神经上皮占据胎儿鼻腔上2 /3的黏膜 ,随着孕龄的增大 ,阳性细胞逐渐成多层次排列 ,所占鼻腔黏膜面积却逐渐减小 ,至孕 34周时 ,仅局限于鼻腔上 1 /3黏膜。OMP免疫反应在孕 1 2周胎儿鼻腔上 2 /3黏膜切片中仅发现少量阳性着色的双极神经细胞 ,明显少于同龄胎儿NSE阳性反应细胞。随着胎龄的增加 ,OMP阳性细胞逐渐增多 ,且胞体多位于嗅上皮中上部 ,但其数量仍相对少于同龄NSE阳性细胞。结论　人胚胎 1 2周时嗅黏膜中已有大量的嗅神经细胞 ,其中少数嗅神经细胞已开始发育成熟。随着胎龄的增大 ,嗅上皮面积逐渐缩小 ,但成熟的嗅神经细胞逐渐增多 ,胚胎发育后期的胎儿嗅化学感受器发育已趋于成熟     

螺旋神经节神经元原代培养及其免疫细胞化学鉴定

目的 建立成体哺乳动物耳蜗螺旋神经节神经元（ＳＧＮ）体外培养的细胞模型。方法 对出生后７ｄ的Ｗｉｓｔａｒ大鼠的螺旋神经节细胞进行解离与分散培养。用荧光显微镜与倒置相差显微镜观察原代培养ＳＧＮ细胞的活力以及生长与分化过程。应用链霉卵白素过氧化物酶（ＳＰ）方法和抗神经丝蛋白单克隆抗体（ＮＦＰ－ＭｃＡｂ）对ＳＧＮ进行免疫细胞化学染色鉴定。结果 幼龄Ｗｉｓｔａｒ大鼠的ＳＧＮ在体外条件下，可良好存活并有正常     

嗅上皮的组织块培养法

目的建立并优化组织块法嗅觉受体神经元（olfactory receptor neurons,ORNs）原代培养体系。方法以鼠尾胶原为培养底物,取新生小鼠鼻中隔和筛甲的嗅上皮进行原代培养。观察包括ORNs在内的各种细胞的形态和分布特点,经免疫组化和扫描电镜证实本原代培养体系内各种细胞的属性以及ORNs的分化程度。结果组织块培养法所得为一混杂的培养体系,除ORNs外还有基底细胞、嗅鞘细胞、纺锤形细胞及成纤维细胞等。其中基底细胞和纺锤形细胞在形态和免疫表型上均具有ORNs前体细胞的特点。优化培养体系后,可得到分化成熟的ORNs并可在体外稳定存活9天以上。结论本培养方法避免了使用消化酶,可以稳定的得到分化成熟的ORNs。     

喉鳞状细胞癌组织体外原代培养的初步研究

目的 应用体外培养技术,对喉鳞状细胞癌组织进行体外培养,探讨喉鳞癌组织原代培养中的各种影响因素,为建立人喉鳞癌组织的细胞系提供实验基础。方法采用体外组织培养技术,对24例人喉鳞状细胞癌组织进行原代培养,观察原代培养中肿瘤细胞的生长与供体的年龄、肿瘤组织的分化程度及不同培养方法的关系,分析在人喉鳞癌细胞的培养中成纤维细胞、微生物污染的影响。结果 24例人喉鳞状细胞癌组织标本,年龄小于60岁组的细胞生长率为31.25％(5/16例),年龄大于60岁组为37.5％(3/8例);高分化组为100％(2/2例),中分化组为30.8％(4/13例),低分化组25％(2/8例);组织块培养法为43.75％(7/16例),酶消化法培养为10％(1/10例);倒置显微镜下观察,在培养的第5～7天,在贴壁组织块周围可见到有上皮样细胞爬出。全部标本中,成纤维细胞的过度生长和微生物的污染是阻碍人喉鳞癌细胞生长的重要因素。结论培养组织的细胞生长率与供体的年龄关系不大;肿瘤组织的分化程度较高者,细胞的生长率较高;与酶消化分离培养法相比,贴壁组织块培养法的细胞生长率较高;成纤维细胞及微生物的污染是阻碍人喉鳞癌细胞系建立的重要因素。     

Culture and characterization of rat middle-ear epithelium

This study was performed to design a method for the culture of rat middle-ear epithelium and to apply the method to investigate the characteristics of this epithelium. Culture of explants of middle-ear epithelium in the presence of the epidermal growth factor was successful, whereas serial cultivation required 3T3 feeder cells in addition to the epidermal growth factor. Cultured middle-ear epithelium was studied by phase-contrast microscopy, transmission and scanning electron microscopy, and combined light and scanning electron microscopy (LM/SEM). These techniques showed similarity between the cultured and the natural middle-ear epithelium. Explants and outgrowths showed both flat polygonal and ciliated epithelial cells. In serial cultivation, however, only the first of these cell types was observed. Frequently, a single primary cilium was found on the cell surface. Transmission electron microscopy showed cross-linked envelopes whose formation was promoted by ionophore X537A. Cytokeratin was demonstrated by immunoblotting, immunofluorescence, and immunoperoxidase methods, using an anti-cytokeratin monoclonal antibody. The model described here permits study of the differentiation of middle-ear epithelium in vitro and may be of future value for the study of chronic middle-ear diseases.     

人眼眶脂肪基质细胞的分离培养、鉴定及成脂诱导分化的研究

目的 探讨人眼眶脂肪基质细胞(hOADSC)体外分离培养、鉴定方法及其向脂肪细胞诱导分化的能力。方法 采用组织块培养法分离人眼眶脂肪基质细胞并在体外进行原代培养及传代扩增。取第二代hOADSC细胞, 用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD29、CD31、CD44、CD45的表达情况;采用成脂诱导培养液体外诱导hOADSC细胞向成熟脂肪细胞分化并用油红O染色。倒置相差显微镜下观察hOADSC形态、测定细胞贴壁率、细胞倍增时间、CCK-8检测细胞增殖情况并绘制细胞生长曲线。结果 组织块培养法分离得到hOADSC, 细胞呈梭形或纺锤形生长, 传代后细胞增殖迅速。细胞表面标志物CD29、CD31、CD44、CD45的表达率分别为99.0%、1.5%、99.1%、1.2%。hOADSC在体外成脂诱导培养液的作用下可分化为成熟的脂肪细胞, 细胞内的脂肪滴被油红O染为红色。传代培养hOADSC细胞贴壁率为92.6%, 细胞倍增时间为1.98 d, 细胞可在体外生长传代扩增10余代。结论 采用组织块培养法成功地分离培养了hOADSC, 其在体外成脂诱导培养液的作用下可分化为成熟的脂肪细胞。     

The Superior Turbinate as a Source of Functional Human Olfactory Receptor Neurons

Objectives The function of human olfactory receptor neurons (ORNs) remains incompletely understood, in part because of the difficulty of obtaining viable olfactory tissue for study. During endoscopic sphenoidotomy, a portion of the superior turbinate is often removed to achieve wide and safe access to the sphenoid sinus. The purpose of this study was to determine whether functional olfactory mucosa could be obtained from such superior turbinate tissue. Study Design/Methods Superior turbinate tissue was resected from 4 patients undergoing transnasal endoscopic approaches to the sphenoid sinus. The gross appearance of the turbinate mucosa was normal at the time of surgery. The specimens were placed directly into cold cell culture media and transferred to the laboratory. A portion of the mucosa was fixed and embedded for histology and immunohistochemistry. The remaining tissue was enzymatically dissociated, and the resulting cell suspension was either prepared for immediate calcium imaging or placed into cell culture. Cultured ORNs underwent calcium imaging after several weeks to assess their ability to respond to odorants. Results Histologic analysis of superior turbinate tissue revealed the presence of patchy olfactory neuroepithelium staining positive for olfactory marker protein. Acutely dissociated ORNs were capable of generating calcium responses to odorant mixtures. ORNs could be maintained in mixed culture and retained their ability to respond to odorants. Conclusions Superior turbinate tissue removed during endoscopic sphenoidotomy can provide a valuable source of human olfactory neuroepithelium for functional or histologic study. Superior turbinate tissue yields stem cells and immature neurons capable of differentiating into ORNs that retain many of their functional characteristics even after growth in culture.     

聚焦超声扫描对兔气管黏膜的影响

目的观察聚焦超声扫描对兔气管黏膜的影响。方法对离体兔气管进行聚焦超声扫描,即刻行组织病理学观察黏膜形态学改变,同时另部分兔气管行组织块法,采用高速数字化视频成像技术,测量纤毛摆动频率,比较使用聚焦超声扫描后的兔气管上皮纤毛摆动频率与正常兔气管纤毛摆动频率是否有差异。结果聚焦超声扫描后的兔气管黏膜纤毛柱状上皮结构正常,黏膜下层出现水肿,散在凝固坏死,血管内皮细胞变性,腺体细胞部分坏死。聚焦超声扫描后的兔气管上皮纤毛摆动频率与正常兔气管纤毛摆动频率无显著性差异。结论聚焦超声扫描对黏膜表层功能有维护作用,而对黏膜下层组织有破坏作用。     

The potency of culture-expanded nasal septum chondrocytes for tissue engineering of cartilage.

Tissue engineering techniques to create extra autologous cartilage for reconstructive surgery receive more and more scientific and industrial attention. The objective of this experimental study was to assess the use of in vitro multiplied chondrocytes of the nasal septum for generation of cartilage grafts using tissue engineering techniques. Cells isolated from a biopsy of septal cartilage of rabbits and humans were expanded in culture to get a sufficient number of cells to engineer a cartilage graft. The drawback of the expansion procedure is that the cells lose their cartilaginous phenotype (dedifferentiation). We studied a method to reverse the dedifferentiation of expanded cells to stimulate them to produce cartilage matrix of good quality. Rabbit chondrocytes showed reversion of dedifferentiation (redifferentiation) when fetal calf serum was replaced by the growth factors IGF1 and TGFbeta2. This was expressed by increased glycosaminoglycan synthesis and increased numbers of collagen type II-producing cells. The redifferentiation capacity of septal cartilage cells of young rabbits was higher than that of adult rabbits. In human chondrocytes from the nasal septum redifferentiation could also be induced by replacement of serum with IGF1 and TGFbeta2. This method, however, was less efficient than in rabbits. Chondrocytes of older patients (>40 years old) were no longer sensitive to the growth factor treatment. In conclusion, our study demonstrates a method to regain cartilage phenotype in multiplied cells of nasal septum cartilage needed for tissue engineering of new cartilage. These results are promising for this technique to generate cartilage grafts for facial plastic surgery of the nasal septum.     

成年大鼠耳蜗血管纹缘细胞的体外培养

目的:建立成年大鼠耳蜗血管纹缘细胞(MC)的体外培养体系。方法:采用活体组织分离及培养技术,获取培养的大鼠耳蜗MC,透射电镜观察细胞超微结构,免疫组织化学法检测上皮细胞标志性中间丝角蛋白的表达及纯度,RT-PCR检测MC特征性的中间丝角蛋白mRNA的表达。结果:体外培养的MC呈不规则多角形,细胞增殖相互连接,紧密排列呈现培养上皮细胞典型的"铺路石"样外观,并可见由数百个MC密集生长组成的折光性强的球形结构(dome);透射电镜观察可见细胞周围有微绒毛样结构;免疫细胞化学检查,纯化后95%以上的MC细胞质呈桔黄色,而对照组无此着色。RT-PCR扩增出标志中间丝角蛋白基因表达的PCR产物,条带位于300~400 bp,与目的条带(368 bp)相符。结论:采用组织块培养技术成功建立成年大鼠耳蜗血管纹MC的体外培养体系,为进一步研究成熟期MC的功能提供合适的细胞模型。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与初步鉴定

目的探讨体外分离、传代培养大鼠骨髓问充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）的方法,并对培养细胞进行初步鉴定,为利用大鼠骨髓MSCs进行感音神经性聋细胞移植治疗的研究奠定基础。方法用贴壁培养法分离大鼠骨髓细胞,第1组于24小时全量换液,第2组于24小时半量换液,第3组于3天全量换液,传代扩增。相差显微镜进行形态学观察;RT—PCR检测培养细胞表面分子表达;定向诱导培养细胞向成脂细胞、成骨细胞方向分化。结果24小时首次全量换液组培养7天后观察见少量细胞集落,细胞形态不规则;24小时首次半量换液组培养7天后观察见较多细胞集落,细胞规则,呈梭形、椭圆形;3天首次全量换液组培养7天后观察见较多悬浮细胞．与贴壁细胞混杂在一起。培养细胞表面分子SH2、CD31、CD44呈阳性表达,但不表达CD34。第2组培养细胞传代后加入不同诱导剂定向诱导分化一定阶段,分别经油红O及VOFIKossa法染色鉴定证实MSCs可分别向脂肪细胞及成骨方向分化。结论本实验分离培养的大鼠骨髓原代细胞24小时首次半量换液培养利于大鼠骨髓MSCs的分离和纯化,可稳定表达SH2、CD31、CD44。MSCs具有多项分化潜能。