磁共振活体示踪经冠状动脉骨髓间充质干细胞移植：验证其与病理组织学结果的一致性*☆

背景：目前动物实验及临床研究证明经冠状动脉移植骨髓间充质干细胞可改善心肌梗死后的心脏功能,但骨髓间充质干细胞经冠状动脉移植后能否到达心肌梗死部位仍存在争议。 目的：磁共振活体示踪经冠状动脉注射的骨髓间充质干细胞能否到达心肌梗死部位。 方法：全骨髓法分离培养猪骨髓间充质干细胞,超顺磁性氧化铁标记后胰酶消化,调整细胞浓度为1010 L-1。10只猪均建立心肌梗死模型,造模后1周通过OTW球囊导管经冠状动脉将标记好的骨髓间充质干细胞悬液定向移植至梗死区。普鲁士蓝染色评价细胞标记效率,采用快速梯度回波序列完成长轴位四腔心和二腔心扫描,在以长轴位四腔心和二腔心为定位相,垂直于室间隔获得左心室短轴位图像。 结果与结论：超顺磁性氧化铁可安全有效标记骨髓间充质干细胞,经冠状动脉注射的骨髓间充质干细胞能到达心肌梗死区及交界区,磁共振能示踪到超顺磁性氧化铁标记的骨髓间充质干细胞,示踪结果与病理组织学检查一致,且磁共振示踪时间可长达5周。     

以CM-DiI作为骨髓干细胞移植示踪剂的可行性

背景：供体细胞的示踪始终是干细胞移植研究中面临的一个重要问题，以往用于干细胞移植的示踪技术主要有核素、5-溴脱氧尿嘧啶核苷、绿色荧光蛋白、Hoechst和荧光原位杂交等。 目的：探讨CM-DiI作为骨髓干细胞移植示踪剂的可行性和示踪效果。 设计、时间及地点：细胞学体内观察，于2004-10/2007-12在中山大学附属第一医院神经科实验室完成。 材料：四五周龄雄性DL小鼠80只为供体，2月龄遗传性肝功能障碍模型TX小鼠40只为受体，均由澳大利亚Dean教授馈赠。CM-DiI为Molecular Probes公司产品。 方法：全骨髓法体外分离培养供体鼠骨髓干细胞，加入CM-DiI行荧光标记，无菌条件下经尾静脉注入已放疗的受体鼠体内，注射悬液量为0.2 mL/只，细胞数1.2×107个/只，于移植后不同时间取肝脏标本制备切片。 主要观察指标：荧光倒置显微镜下观察CM-DiI标记细胞情况，流式细胞仪测定荧光标记率。供体细胞移植后在受体鼠肝脏的示踪。PCR半定量分析供体细胞在受体鼠肝脏中的比例。 结果：荧光显微镜下CM-DiI标记的骨髓干细胞呈红色荧光，CM-DiI标记率为99.9%。在受体鼠肝脏组织内，CM-DiI的荧光在移植后第1天即可看到，渐增多，第4周达高峰，后渐下降。移植后第7天可检测到Sry基因，随后其变化趋势同CM-DiI荧光。 结论：CM-DiI是良好的骨髓干细胞移植示踪剂，第4周时示踪效果最为显著。     

PKH-26标记骨髓间充质干细胞气管移植的体内示踪

背景：PKH-26已经被成功应用于标记骨髓间充质干细胞并进行体内示踪。 目的：通过气管移植合并静脉移植PKH-26标记的骨髓间充质干细胞评价PKH-26的示踪效果,并检测骨髓间充质干细胞在体内向受损组织的迁移情况。 方法：用贴壁法进行骨髓间充质干细胞的原代细胞培养,以PKH-26标记3~5代骨髓间充质干细胞经鼠尾静脉移植入气管移植的受体大鼠体内,用等量的PBS注射作为实验对照。 结果与结论：用PKH-26进行细胞骨髓间充质干细胞标记后,荧光显微镜下观察可见几乎所有骨髓间充质干细胞均有红色荧光。移植后8周仍可见受体气管和移植气管处有红色荧光标记。远离吻合口的受体气管基本未见红色荧光标记物。结果表明骨髓间充质干细胞经静脉移植后,可向损伤的气管组织迁移并定植,而且可随移植气管的血管化逐渐由受体气管切缘向移植气管迁移,最后可定植于移植段气管。PKH-26的红色荧光标记稳定性高,是可应用于长期观察的无降解的荧光标记物。     

改良小鼠骨髓间充质干细胞培养方法及长效荧光标记的可行性

背景：小鼠骨髓间充质干细胞培养不同于人及大鼠,培养扩展难度高,传代后干细胞活性保持时间短;又鉴于干细胞本身特点,使现有干细胞示踪方法作用时间短,这些因素均影响小鼠骨髓间充质干细胞的实验研究。 目的：观察改良小鼠骨髓间充质干细胞分离培养方法及长效荧光标记干细胞的可行性。 设计、时间及地点：观察性实验,于2008-06/12在解放军军事医学科学院完成。 材料：C57BL/6小鼠4~6周龄,体质量20 g,雌雄不拘。 方法：通过贴壁筛选和Percoll分离法,优化干细胞培养液血清和换液方式,培养扩增小鼠骨髓间充质干细胞。参照以往人和猕猴间充质干细胞培养经验,对小鼠间充质干细胞培养血清选择Hyclone的顶级胎牛血清,控制血清为培养液的10%。用LG-DMEM培养液冲出骨髓细胞后,滤去骨渣和小肌肉碎块。然后加在相对密度1.082的percoll分离液上,以1.5×106/cm2浓度接种75 cm2培养瓶。对第2代骨髓间充质干细胞进行长效CM-DiI标记。 主要观察指标：原代及传代小鼠骨髓间充质干细胞形态变化;对第2代小鼠骨髓间充质干细胞表面抗原,CD105,CD44,CD25,CD34进行流式细胞仪检测,评价改良方法获取干细胞纯度;通过成脂成骨分化,鉴定小鼠骨髓间充质干细胞的活性;观察多次传代后荧光细胞强度。 结果：①小鼠骨髓间充质干细胞原代培养在接种48 h后可见贴壁细胞,培养第7天细胞多数伸展呈梭形,也有三角形、多角形和扁平形。3代后形态趋于统一,融合状态时细胞排列呈束状、漩涡状或放射状。②骨髓间充质干细胞特异性抗原高表达CD105,CD44;造血系抗原低表达CD34和CD45。③骨髓间充质干细胞向成骨分化过程中,纺锤形的突起逐渐消失,胞体增大,培养10 d后,部分细胞呈聚集生长,随细胞生长密度的增长形成多层的结节结构。在脂肪诱导体系中,可见细胞由成纤维样逐渐缩短,9 d后胞浆中出现脂肪滴,油红O染色可见红色的脂肪颗粒。④首次标记,荧光显微镜观察可见长效CM-DiI标记在细胞膜发橙色光,标记率在80%以上。流式细胞仪检测CM-DiI细胞标记率可到47%以上,第4代培养细胞仍可见较多标记细胞。 结论：改良方法早期第2代就可获得高浓度干细胞,同时长效CM-DiI标记方法稳定,标记率高,可作体内细胞示踪。     

食蟹猴脑出血骨髓间充质干细胞移植活体示踪观察

目的将超顺磁性氧化铁(superparamagnetic Iron Oxide,SPIO)标记人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSC)并植入脑出血食蟹猴脑内,利用MRI技术活体示踪移植的hBMSC。方法将自体股动脉血注入食蟹猴右侧基底节区,制备脑出血模型。收集志愿者骨髓,分离培养hBMSC至第3代。脑出血模型制备后第7天,将5×106个SPIO标记的hBMSC通过立体定向手术移植入血肿对侧基底节区。移植后1d、2周、4周、6周、8周采用MRI检查示踪hBMSC。食蟹猴处死后脑组织切片行苏木精-伊红及普鲁士蓝染色。结果SPIO标记hBMSC的效率大于96%,经SPIO标记的hBMSC移植后T2加权像可发现移植区呈明显的低信号区。苏木精-伊红、普鲁士蓝染色可发现移植细胞及新生血管分布于移植区周围,与MRI信号减低区一致。结论SPIO可有效地标记hBMSC,MRI可以活体示踪食蟹猴脑出血脑内移植的经SPIO标记的hBMSC。部分hBMSC可分化为血管,并促进宿主新生血管的形成。     

自体骨髓间充质干细胞心肌移植后的分化及存活*☆

背景：骨髓间充质干细胞移植入急性心肌梗死组织后是否能迁移、分化及存活,目前尚不清楚。 目的：观察兔骨髓间充质干细胞移植入急性心肌梗死组织后,在体内的迁移、分化及其存活。 方法：分离培养兔骨髓间充质干细胞,体外DAPI标记细胞。结扎兔左前降支制作急性心肌梗死模型,造模成功后30只新西兰大耳兔抽签法分为骨髓间充质干细胞组和对照组,每组15只。骨髓间充质干细胞组于冠状动脉结扎后1 h在梗死周边区用微量注射器分4点注射自体骨髓间充质干细胞。对照组于相同部位注射等量生理盐水。每点注射体积30 μL。分别于移植后10 min,3 d,4周时各组各处死5只动物。取心脏行冰冻切片,荧光显微镜观察DAPI标记骨髓间充质干细胞的分布情况;免疫荧光法检测标记细胞是否表达心肌特异性肌钙蛋白Ⅰ和α-肌动蛋白。 结果与结论：DAPI标记的骨髓间充质干细胞在兔急性心肌梗死模型心脏微环境中,蓝色细胞核分布广泛,呈椭圆形,似心肌细胞核,其排列方向与宿主心肌纤维方向一致,间接免疫荧光法检测胞浆心肌特异性蛋白肌钙蛋白Ⅰ、α-肌动蛋白均为阳性。说明缺血心肌内移植入骨髓间充质干细胞,可在局部微环境的刺激下向心肌细胞定向分化。     

经5-氮胞苷诱导后的骨髓间充质干细胞心肌移植后对心功能的影响

背景：骨髓间充质干细胞具有多分化潜能,但其在体外经5-氮胞苷诱导后移植于急性心肌梗死大鼠中,能否改善近期及远期的心功能,目前尚不明确。 目的：观察兔骨髓间充质干细胞移植入急性心肌梗死组织后对心功能的影响。 方法：分离培养兔骨髓间充质干细胞,5-氮胞苷诱导4周后,体外DAPI标记。新西兰兔随机均分3组,假手术组：打开胸腔1 h后缝合胸腔;骨髓间充质干细胞组：于冠状动脉结扎建立急性心肌梗死模型后1 h在梗死周边区用微量注射器分4点注射诱导后的自体骨髓间充质干细胞;急性心肌梗死组：造模后于相同部位注射等量生理盐水。移植后3 d,4周超声心动图检测各组大鼠左室舒张末期容积,左室收缩末期容积及射血分数变化。 结果与结论：荧光显微镜观察发现,骨髓间充质干细胞组移植后3 d,4周心脏标本中均发现有DAPI标记的阳性细胞,呈散在分布于瘢痕周边区并沿心肌纤维排列方向走行。移植后3 d,骨髓间充质干细胞组与急性心肌梗死组相比,左室舒张末期容积、左室收缩末期容积及射血分数无明显差异,心功能没有明显的改善;移植4周后,骨髓间充质干细胞组与急性心肌梗死组相比,射血分数明显提高,左室舒张末期容积、左室收缩末期容积明显降低。     

兔椎间盘移植人骨髓间充质干细胞的实验观察

背景：国内外动物实验多是研究同种异体骨髓间充质干细胞的移植,但对人骨髓间充质干细胞在活体椎间盘内的存活情况还知之甚少。 目的：观察人骨髓间充质干细胞在兔椎间盘内的存活情况。 方法：选取新西兰大白兔15只,每只兔子的椎间盘被分为3组,即空白组(L1~2)、生理盐水组(L2~3)、绿色荧光蛋白标记的人骨髓间充质干细胞移植组(L3~4,L4~5,L5~6)。空白组不注射,生理盐水组髓核内注射生理盐水25 μL,绿色荧光蛋白标记的人骨髓间充质干细胞移植组注射1×109 L-1绿色荧光蛋白标记的人骨髓间充质干细胞生理盐水混悬液25 μL。移植后1,2,4,6,8周取材,荧光显微镜观察荧光细胞的分布情况及其数量。 结果与结论：绿色荧光蛋白标记的人骨髓间充质干细胞移植组移植后1,2,4,6,8周标本切片,髓核内均可见绿色荧光细胞。移植后6,8周的荧光细胞数量明显少于移植后1,2,4周(P < 0.001)。提示移植后8周以内,人骨髓间充质干细胞可在兔椎间盘内存活。     

全骨髓法体外培养分离大鼠骨髓间充质干细胞及PKH26标记

背景：要获得动物实验需要的标记大鼠骨髓间充质干细胞,体外培养、扩增和示踪已成为实验的关键环节。 目的：采用全骨髓培养分离大鼠骨髓间充质干细胞,以及PKH26对其体外标记,建立一种方便、实用的分离培养并示踪骨髓间充质干细胞的方法。 方法：通过全骨髓培养分离法纯化大鼠骨髓间充质干细胞。经传代扩增,细胞进一步纯化。取第3代大鼠骨髓间充质干细胞按PKH26标记程序进行标记后培养,荧光显微镜下观察标记后细胞生长状态、萤光强度变化和传代培养效果。利用四唑盐比色法测定标记后骨髓间充质干细胞的生长曲线。 结果与结论：全骨髓培养分离法能成功获得纯度高的骨髓间充质干细胞,用PKH26标记后的骨髓间充质干细胞呈红色荧光,体外连续传代培养3代后,细胞荧光强度逐渐减弱。PKH26标记骨髓间充质干细胞的生长形态、生长活力不发生改变。结果证实全骨髓培养分离法简便易行,能获取较高纯度的生长增殖状态良好的骨髓间充质干细胞,PKH26荧光标记大鼠骨髓间充质干细胞是一种有效、实用的方法。     

骨髓间充质干细胞在心肌梗死犬心肌内分化及对心肌细胞凋亡的影响

背景：体内移植骨髓间充质干细胞对实验动物的心肌梗死和心力衰竭有较好的改善作用，但具体机制尚不清楚。 目的：观察骨髓间充质干细胞在心肌梗死犬梗死区的分化以及对心肌细胞凋亡的影响。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2005-03/2007-12在美国Texas Heart Institute干细胞研究室进行骨髓间充质干细胞移植，在第三军医大学完成免疫组织化学染色。 材料：成年杂种犬，平均体质量25~35 kg。 方法：采用密度梯度离心法提取犬骨髓间充质干细胞，移植前以BrdU标记骨髓间充质干细胞。采用外科手术于近端冠状动脉左前降支植入布洛芬缩肌装置并结扎相连分支的方法制作犬心肌梗死模型。造模后分为实验组与对照组，实验组于损伤缺血部位注射同种异体骨髓间充质干细胞。对照组注射等量生理盐水。 主要观察指标：对移植BrdU标记的骨髓间充质干细胞的心肌梗死犬心肌梗死区组织细胞进行免疫组织化学染色，同时采用DeadEndTM Colorimetric TUNEL System对心梗标本进行凋亡细胞的染色观察。 结果： 注射骨髓间充质干细胞的心脏组织切片BrdU免疫组织化学染色可见大量细胞核呈现深褐色或黑色的阳性反应，在心脏组织的不同区域表现出不同的形态特征，其中大多数植入心肌细胞间的骨髓间充质干细胞，形态上与心肌细胞无异，而其他区域的骨髓间充质干细胞则与间质细胞较相似，无特定的形状。骨髓间充质干细胞移植组心肌梗死区凋亡的心肌细胞数少于未移植组。 结论：骨髓间充质干细胞心肌内移植后可在心肌梗死区分化成心肌细胞，并减轻犬心肌梗死后的细胞凋亡。     

纳米铁粒子标记人骨髓基质细胞及移植后MRI示踪的临床研究

目的探讨应用超顺磁性氧化铁（SPIO）纳米粒子标记骨髓基质细胞的方法、SPIO对骨髓基质细胞活性的影响及自体移植后用MRI进行体内示踪的可行性。方法从患者体内分离出骨髓基质细胞并进行培养、传代，移植前用SPIO标记，普鲁蓝染色法检测细胞内的纳米铁粒子，并测定SPIO对骨髓基质细胞活性的影响，通过手术将标记细胞和非标记细胞自体移植入患者颈髓的不同部位并进行MRI检查。结果普鲁蓝染色表明纳米铁粒子在细胞内呈现蓝色颗粒，标记细胞组和非标记组活性无明显差异。移植后2W行颈髓MRI检查显示，在移植标记磁性细胞的一端，可见到明显的低信号改变，移植未标记细胞的部位没有信号改变。结论SPIO可以标记骨髓基质细胞且对细胞活性无影响，标记细胞移植后在体内能观察到明显的MRI信号改变，可对骨髓基质细胞移植后在活体内的迁徙情况提供影像学证据。     

Short‐, middle‐ and long‐term safety of superparamagnetic iron oxide‐labeled allogeneic bone marrow stromal cell transplantation in rat model of lacunar infarction

Recently, both basic and clinical studies demonstrated that bone marrow stromal cell (BMSC) transplantation therapy can promote functional recovery of patients with CNS disorders. A non‐invasive method for cell tracking using MRI and superparamagnetic iron oxide (SPIO)‐based labeling agents has been applied to elucidate the behavior of transplanted cells. However, the long‐term safety of SPIO‐labeled BMSCs still remains unclear. The aim of this study was to investigate the short‐, middle‐ and long‐term safety of the SPIO‐labeled allogeneic BMSC transplantation. For this purpose, BMSCs were isolated from transgenic rats expressing green fluorescent protein (GFP) and were labeled with SPIO. The Na/K ATPase pump inhibitor ouabain or vehicle was stereotactically injected into the right striatum of wild‐type rats to induce a lacunar lesion (n = 22). Seven days after the insult, either BMSCs or SPIO solution were stereotactically injected into the left striatum. A 7.0‐Tesla MRI was performed to serially monitor the behavior of BMSCs in the host brain. The animals were sacrificed after 7 days (n = 7), 6 weeks (n = 6) or 10 months (n = 9) after the transplantation. MRI demonstrated that BMSCs migrated to the damage area through the corpus callosum. Histological analysis showed that activated microglia were present around the bolus of donor cells 7 days after the allogeneic cell transplantation, although an immunosuppressive drug was administered. The SPIO‐labeled BMSCs resided and started to proliferate around the route of the cell transplantation. Within 6 weeks, large numbers of SPIO‐labeled BMSCs reached the lacunar infarction area from the transplantation region through the corpus callosum. Some SPIO nanoparticles were phagocytized by microglia. After 10 months, the number of SPIO‐positive cells was lower compared with the 7‐day and 6‐week groups. There was no tumorigenesis or severe injury observed in any of the animals. These findings suggest that BMSCs are safe after cell transplantation for the treatment of stroke.     

菲立磁标记骨髓基质细胞动脉移植治疗帕金森病的实验研究

目的:探讨应用骨髓基质细胞(BMSCs)经颈动脉移植治疗帕金森病(PD)大鼠的机制及疗效,以及菲立磁(Feridex)标记的BMSCs移植入PD大鼠体内后,MRI示踪观察的可行性。方法:建立PD大鼠模型,体外分离培养扩增SD大鼠BMSCs,从右侧颈动脉移植治疗10只PD大鼠,移植后进行行为学观察和MRI示踪观察。结果:移植治疗的PD大鼠阿扑吗啡诱发旋转实验较对照组明显减少;组织学和MRI示踪发现移植的BMSCs在PD大鼠脑内存活、迁移,并向神经细胞方向分化。结论:BMSCs移植能显著改善PD大鼠的生物学行为,利用MRI技术可以对菲立磁标记的BMSCs进行活体追踪。     

SPIO标记脂肪干细胞移植退变椎间盘内的MRI活体示踪*◆

背景：国内外动物实验多是荧光标记骨髓间充质干细胞的移植,以SPIO标记脂肪干细胞移植后活体示踪对退变椎间盘修复作用的研究较少。 目的：活体监测SPIO标记的脂肪干细胞在退变椎间盘内的存活、迁移和转归,以及脂肪干细胞对退变椎间盘的修复及延缓退变作用。 方法：新西兰大白兔20只,兔椎间盘被分为4组,即正常对照组(L1/2),脂肪干细胞组(L2/3),PBS组(L3/4),SPIO-脂肪干细胞组(L4/5)。透视引导下用18G穿刺制作退变模型后2周行SPIO标记的脂肪干细胞移植。 结果与结论：SPIO-脂肪干细胞移植后即刻T2WI/FFE序列上可见椎间盘内明显低信号,8周后仍可检测到低信号。脂肪干细胞移植组与同时间点PBS组比较,椎间盘退变程度轻。提示SPIO-脂肪干细胞移植至椎间盘后,可通过MRI进行监测;脂肪干细胞椎间盘内移植有助于修复退变椎间盘和延缓椎间盘退变。     

不同种类超顺磁性氧化铁标记猪骨髓间充质干细胞的体外MR成像

背景：干细胞磁性标记是新近开展的一项干细胞体外标记技术,结合MR成像设备可以活体监控移植入体内的干细胞。 目的：明确超顺磁性氧化铁粒子体外标记猪骨髓间充质干细胞的方法、不同种类超顺磁性氧化铁标记细胞经MR成像的特征及可成像的最低标记细胞量。 设计、时间及地点：对比观察,于2006-09/ 2007-03在苏州大学医学部心血管外科实验室及苏州大学附属第一医院影像中心完成。 材料：猪髂骨骨髓由太湖梅山猪新鲜采集;超顺磁性氧化铁纳米颗粒为德国Schering公司产品;超微型超顺磁性氧化铁纳米颗粒由苏州大学化学与化工学院提供：铁颗粒晶核表面包被葡聚糖,3种超微型超顺磁性氧化铁包被葡聚糖后根据颗粒大小(12,15,20 nm)分别依次简称为1#,2#,3#。 方法：分离、纯化、培养猪骨髓间充质干细胞,体外进行不同种类超顺磁性氧化铁标记,染色及荧光显微镜观察;测量并绘制未标记细胞和标记细胞的MTT生长曲线;选取不同的细胞量组(Feridex标记细胞分别选取1×106、5×105及1×105 L-1量组,未标记细胞选取5×105 L-1量组,1#、2#及3#超微型超顺磁性氧化铁标记细胞均选取 5×105 L-1量组)进行标记后MR成像,测量不同扫描序列标记细胞管的信号强度改变,并进行统计学分析。 主要观察指标：超顺磁性氧化铁标记干细胞的普鲁士蓝染色检测标记率;标记干细胞的MTT生长曲线;双染色法检测细胞凋亡;不同Ependoff管内细胞团T1WI、T2WI和FFE图像的信号强度。 结果：应用多聚赖氨酸介导干细胞磁标记方法标记骨髓间充质干细胞有效率为100%,普鲁士蓝染色见细胞浆内有多少不等的蓝染铁颗粒;超顺磁性氧化铁标记的间充质干细胞在T2WI尤其是FFE(T2*WI)序列信号明显降低;在25 mg/L Fe培养液标记浓度下,MR成像的最低细胞量为1×105;在不同种类超顺磁性氧化铁标记下,2#、3#USPIO与Feridex在T2WI及T2*WI上有显著性差异 (P < 0.01);而1#USPIO与Feridex在T2WI及T2*WI上差异无显著性意义(P > 0.05);Feridex标记间充质干细胞在T2WI及T2*WI上与T1WI相比,差异均有显著性意义(P < 0.01)。 结论：超顺磁性氧化铁可以简便标记间充质干细胞并且在适当浓度下对间充质干细胞的生物学活性没有影响,MR T2WI和T2*WI序列可敏感显像磁性标记的干细胞。     

骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤的MRI活体示踪

Non-invasive tracing in vivo can be used to observe the migration and distribution of grafted stem cells,and can provide experimental evidence for treatment.This study utilized adenovirus-carrying enhanced green fluorescent protein(AD5/F35-eGFP) and superparamagnetic iron oxide(SPIO)-labeled bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs).BMSCs,double-labeled by AD5/F35-eGFP and SPIO,were transplanted into rats with spinal cord injury via the subarachnoid space.MRI tracing results demonstrated that BMSCs migrated to the injured spinal cord over time(T2 hypointensity signals).This result was verified by immunofluorescence.These results indicate that MRI can be utilized to trace in vivo the SPIO-labeled BMSCs after grafting.     

超顺磁性氧化铁和DAPI双标记骨髓间充质干细胞*

背景：骨髓间充质干细胞目前已经成为重要的组织工程种子细胞,而若想深入研究其在体内外增殖、分化的规律,首先需要解决如何能高效、安全地标记骨髓间充质干细胞。 目的：观察超顺磁性氧化铁及DAPI对大鼠骨髓间充质干细胞的双标记效果及其对细胞存活、增殖以及凋亡的影响。 方法：分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,用超顺磁性氧化铁及DAPI双标记后分别用普鲁士蓝染色法和激光共聚焦显微镜观察其铁标记率及荧光标记率。用锥虫蓝检测细胞活力;MTT法检测标记干细胞增殖力;Calcein-AM/PI以及AO/PI双染细胞,检测细胞存活率以及凋亡率。 结果与结论：超顺磁性氧化铁及DAPI在体外双标记大鼠骨髓间充质干细胞效率高,可达100%;锥虫蓝染色显示标记细胞的存活率为97%;MTT法检测发现双标记干细胞组的活力以及增殖力与未标记干细胞组相比差异均无显著性意义(P > 0.05);Calcein-AM/PI染色,未标记细胞及双标记细胞的存活率分别为96%和95%;AO/PI染色,未标记及双标记细胞的凋亡率均为1%。提示超顺磁性氧化铁和DAPI双标记大鼠骨髓间充质干细胞后,对于干细胞的存活、增殖以及凋亡无影响。