核酸疫苗的研究现状

核酸疫苗（nucleicacid vaccine）是指将含有编码某种抗原蛋白的外源基（DNA或RNA）序列质粒载体作为疫苗，直接导入到动物细胞内，通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。核酸疫苗又称为基因疫苗或裸DNA疫苗，核酸疫苗包括DNA疫苗和RNA疫苗，其中研究最多的是DNA疫苗。这种免疫称为核酸免疫、基因免疫、DNA介导的免疫以及遗传免疫等。许多研究者将不同病原的保护性抗原基因直接导入动物体内，引起特异性免疫应答，并已在一些疾病如流感、狂犬病、乙肝、艾滋病、牛疱疹病毒感染以及结核病和疟疾等取得初步结果。     

基因免疫

基因免疫窦骏南京铁道医学院微生物学教研室（南京２１０００９）１基因免疫概念及命名基因免疫（ｇｅｎｅｔｉｃｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）是指将含有编码抗原蛋白目的基因的质粒载体直接注入体内，通过宿主细胞的转译系统表达目的抗原，并诱导机体产生免疫应答的一项新...     

亚洲带绦虫膜联蛋白B3基因免疫学特性分析及组织定位

目的对重组表达的亚洲带绦虫膜联蛋白B3(Annexins B3)基因得到的蛋白进行免疫学初步研究及组织定位。方法将构建在原核表达质粒pET-28a(+)中的Annexins B3基因在大肠埃希菌BL21/DE3中进行诱导表达,将纯化后的重组蛋白用蛋白印迹(Western blotting)进行免疫学分析,间接荧光免疫组织化学定位,荧光显微镜下曝光观察结果。结果诱导表达并纯化后的重组蛋白可被亚洲带绦虫、猪带绦虫和牛带绦虫感染的病人血清识别。免疫组化显示,该基因的组织定位在亚洲带绦虫成虫的表膜。结论该重组蛋白具有较好的免疫反应性,组织定位于表膜,说明该基因是维持成虫在宿主消化道厌氧环境中能量代谢平衡的关键分子和介导寄生虫与宿主相互作用的潜在的疫苗候选抗原分子。     

新的人内源性逆转录病毒NP9基因的分子克隆与病毒蛋白表达

目的:研究新近发现的人内源性逆转录病毒NP9基因与自身免疫性疾病的相关性及其可能的作用机制,构建该基因的蛋白表达系统. 方法:提取自身免疫性疾病患者外周血单个核细胞(PBMCs)的总RNA,利用RT-PCR 技术,扩增NP9基因,然后将该片段进行T-A克隆并测序鉴定,纯化回收后亚克隆于原核表达载体pQE30中,然后提取质粒,酶切鉴定;最后经IPTG诱导,原核表达重组子在M15宿主菌进行表达,并进行SDS-PAGE与Western 印迹分析与鉴定.结果:应用RT-PCR 技术,从系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞的总RNA中扩增到一条大小约为250 bp的片段,经T-A克隆与测序鉴定,证实此片段为NP9基因,具有一个完整的开放阅读框架;将pQE 30-NP9重组子转化入宿主菌,用IPTG诱导菌体表达NP9重组蛋白,经SDS-PAGE电泳和Western印迹技术鉴定证实:在相对分子量约9kD处见明显的病毒特异性的高表达条带.结论:已成功克隆了新的人内源性逆转录病毒NP9基因,并经IPTG诱导,在M15宿主菌中表达了相应的病毒蛋白,为进一步研究该逆转录病毒与自身免疫性疾病的相关性奠定基础.     

马尔尼菲青霉致病机制相关研究进展

马尔尼菲青霉是一种条件致病性、双相型真菌，主要通过感染免疫功能低下者引起马尔尼菲青霉病。致病机制与其真菌学特征、流行病学特征、外分泌性酶、宿主免疫状况、双相性转变过程中的基因、蛋白表达差异有关。     

乙型肝炎病毒抑制肝细胞免疫检查点PD-1配体基因表达的研究

目的 在细胞水平上分析乙型肝炎病毒(HBV)复制及其编码的X基因(HBx)表达对细胞基因表达谱的影响,特别是免疫相关基因表达水平的变化.方法 通过慢病毒和pcDNA瞬时转染过表达HBx基因,利用RNA-Seq和RT-qPCR等方法检测免疫相关基因的表达水平,并在HBV复制细胞系中进行验证.结果 HBV复制和HBx表达可以剂量依赖性抑制免疫检查点程序性死亡分子1(PD-1)配体基因(PD-L1/CD274)的表达,而HBx基因的H-box突变体的表达失去该抑制效应.结论 HBV/HBx具有抑制PD-L1/CD274基因表达的能力,在病毒感染的急性期解除抗原特异性T细胞激活的检查点,活化细胞毒性T细胞,这可能导致T细胞对高度复制的细胞进行攻击和清除,帮助病毒进入较低复制状态,达到病毒-宿主的平衡状态并奠定HBV慢性感染的基础.     

乙型肝炎DNA疫苗研究进展

DNA疫苗也有基因疫苗、核酸疫苗、DNA免疫、基因免疫等各种名称和相关概念.有人将DNA疫苗称为第三代疫苗.第一代疫苗以Jenner用牛痘预防天花为代表,人类从此开始摆脱许多疾病的困扰.第二代疫苗是运用基因重组技术,以特定的基因表达产生的抗原作为疫苗,重组乙型肝炎疫苗就是典型例子.DNA疫苗则是将编码目的抗原的基因与载体重组以后,经不同途径将基因直接转入机体细胞内,利用宿主细胞内的表达加工机构合成抗原,从而激发体液免疫和细胞免疫.近年来,DNA疫苗在打破HBV慢性感染的免疫耐受方面取得了一定的进展,对乙型肝炎及HBV无症状携带状态的临床治疗提供了值得探索的新途径.     

新城疫病毒抗恶性肿瘤研究进展

溶瘤病毒疗法是临床治疗恶性肿瘤的新突破,其通过感染肿瘤细胞,引起病毒性细胞病变反应并诱发宿主抗肿瘤免疫,从而选择性杀死肿瘤细胞。新城疫病毒(NDV)是一种禽副黏病毒,对小鼠和人的抗肿瘤和免疫刺激作用已在临床前及临床研究中被证实,是最具潜力的溶瘤病毒之一。随着反向遗传学技术的不断成熟,使用该技术构建的以NDV为载体的插入外源基因重组NDV在免疫活性肿瘤模型中的研究成为热点。重组NDV不但可以稳定表达外源治疗基因,还可以增强病毒杀伤肿瘤和诱导宿主抗肿瘤免疫应答的能力。但其治疗恶性肿瘤的效果未来需大量临床试验验证。     

免疫抑制宿主和健康宿主在鼠肺部烟曲霉感染时基因表达的差异

目的 观察免疫抑制宿主和健康宿主在遭遇条件致病真菌初期时基因表达的差异,筛选新的真菌免疫相关基因,以便对条件致病真菌导致系统性真菌病的发病机制有更新的认识。方法 免疫抑制和健康小鼠各6只,经鼻内接种烟曲霉孢子3d后处死,取肺组织,抽提总RNA,进行基因表达谱芯片研究。结果 在4096条基因中共筛选出66条差异表达基因。其中,免疫抑制组编码CD22、CD53、24p3以及与单核巨噬细胞吞噬消化有关的基因表达上调。编码免疫球蛋白入链、肺泡表面蛋白C以及与肺组织代谢有关的基因表达下调。编码IL18、CD8、CD28等的基因无差异表达。结论 免疫抑制组CD22基因上调可能是宿主受到免疫抑制的途径之一,而CD8则未发现差异。CD53可能间接参与对单核巨噬细胞的调控。24p3蛋白作为应激蛋白,可能保护宿主免受过度炎症反应。     

旋毛虫组织蛋白酶基因CathepsinX的克隆表达及免疫学特性初步分析

目的克隆表达一个新的旋毛虫组织蛋白酶基因CathepsinX,初步探讨其免疫学特性,为研究新的防治方法奠定科学基础。方法从GenBank旋毛虫核酸数据库中筛选出功能未知的CathepsinX基因部分EST序列,使用RACE-PCR方法得到其全长编码基因序列。半定量RT-PCR分析该基因的转录。构建该基因的原核表达载体pET30a-TsCPX,大肠杆菌中IPTG诱导表达,His-tag亲和层析纯化获重组蛋白TsCPX;将纯化的重组蛋白40μg/只免疫BALB/c小鼠,免疫前1周及每次免疫后2周收集免疫血清,间接ELISA检测血清总IgG、亚类IgG1、IgG2a抗体浓度。结果 RACE-PCR克隆出TsCPX全长基因序列,共1227bp;RT-PCR揭示TsCPX在旋毛虫三个发育时期均有380bp扩增条带,条带光密度分析显示最高转录水平出现在新生幼虫期。E.coli原核表达体系中成功克隆表达出重组蛋白TsCPX;重组蛋白免疫小鼠二次后,免疫血清总IgG迅速上升,三次免疫后达到峰值(P<0.001);IgG亚类IgG1抗体浓度随着免疫次数的增加迅速上升,亚类IgG2a无明显上升,两者间差异有统计学意义(P<0.001)。结论成功克隆的TsCPX基因在旋毛虫的三个生长发育时期均有转录表达,TsCPX重组蛋白具有较强免疫原性,能引起宿主(小鼠)Th2型为主的免疫应答,具有作为旋毛虫病免疫预防研究靶分子的潜在价值。     

重组原核表达载体pGEX6P1-Osx的构建与表达

目的构建原核表达载体pGEX6P1-Osx,并在大肠杆菌中诱导表达谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合蛋白。方法提取新生小鼠牙髓总RNA,RT-PCR扩增Osx目的基因片段,并将该片段克隆至PCR-TopoII载体中;经鉴定正确后目的基因定向连接至表达载体pGEX6P1;将重组质粒pGEX6P1-Osx转化至大肠杆菌BL21,以异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE电泳鉴定;免疫印迹法检测纯化的GST融合蛋白。结果IPTG诱导宿主菌BL21有效表达融合蛋白;免疫印迹法鉴定该融合蛋白为GST-Osx。结论成功构建原核表达载体pGEX6P1-Osx,且GST-Osx融合蛋白可在大肠杆菌中诱导表达。     

丙型肝炎病毒E2基因激发小鼠细胞免疫的实验研究

目的 :研究丙型肝炎病毒E2基因接种能否诱导机体产生细胞免疫以及乙型肝炎病毒preS基因对其诱导细胞免疫能力的影响。方法 :以BALB/c小鼠的骨髓瘤细胞株 (SP2 /O)为宿主细胞 ,建立表达丙肝病毒E2蛋白的靶细胞 ,将其注射于E2基因或 preS与E2融合蛋白基因免疫的小鼠腹腔 ,记录小鼠接种瘤细胞后的存活期 ,以小鼠存活期的长短作为反映基因免疫小鼠对HCVE2蛋白细胞免疫的有无或强弱的指标。结果 :靶细胞表达了相对分子质量约为 70 0 0 0的E2蛋白 ,E2基因接种小鼠的存活期长于对照组 ,单独E2基因接种组的存活期显著长于对照组 ,也长于 preS与E2融合蛋白基因免疫组。 结论 :E2基因接种能诱导细胞免疫 ,但与 preS融合后 ,其诱导细胞免疫的能力会降低。     

小鼠暴发型病毒性肝炎肝组织基因表达谱的分析

目的 分析小鼠暴发型病毒性肝炎肝组织基因表达谱,初步确定参与暴发型病毒性肝炎发病分子机制的相关基因.方法 100 PFU 3型鼠肝炎病毒(MHV-3)感染Balb/cJ小鼠,建立了暴发型病毒性肝炎模型,同等量病毒感染A/J小鼠后24 h取肝组织作为对比分析标本.应用含有16 463条Oligo DNA的小鼠基因表达芯片,检测两组小鼠间的基因差异表达谱.荧光定量逆转录聚合酶链反应法检测目标基因H2-EA的表达变化,验证芯片分析的初步结果.结果 MHV-3感染Balb/cJ小鼠和A/J小鼠后其肝组织差异表达基因共140条,包括细胞代谢、细胞信号、细胞运输,转录调控以及免疫相关类等基因.其中2倍以上差异表达基因中与免疫功能密切相关的基因22条.结论 暴发型肝炎过程中宿主基因表达谱发生了变化,共同参与了免疫致病机制,其中主要为细胞代谢和免疫相关类基因.     

CD4^＋CD25^＋调节性T细胞与肿瘤免疫

机体的免疫功能与肿瘤的发生发展有密切关系,当宿主免疫功能低下或受抑制时,肿瘤发病率增高,而在肿瘤进行性生长时,肿瘤患者的免疫功能受抑制,两者互为因果。现已明确,机体免疫系统能产生抗肿瘤免疫应答,但是许多肿瘤仍能在机体进行性生长,甚至使宿主死亡。其核心问题是肿瘤细胞是如何逃避宿主免疫系统的攻击,     

EBV逃避宿主免疫的机制

EB病毒（EBV）在感染宿主的过程中需要克服宿主免疫系统的防御,因此衍生了一系列干扰人体免疫的策略。 EBV感染后会长期潜伏在宿主B细胞中,并对宿主MHC分子的表达进行干扰,影响宿主的抗病毒免疫。 EBV表达的BCRF1蛋白可刺激Th2细胞的产生,BARF1蛋白可诱发α型干扰素等细胞因子的分泌,多种病毒蛋白均可干扰细胞因子网络。同时 EBV 编码的 BHRF1等蛋白可发挥抗凋亡作用。该文就EBV免疫逃避的最新研究进展进行了归纳总结,以期为EBV防控、新型疫苗设计等提供参考。     

嗜肺军团菌ip基因的克隆及其原核表达

目的克隆嗜肺军团菌主要免疫原蛋白ip基因,构建重组质粒pET-ip,并在原核系统中表达。方法采用聚合酶链反应(PCR),从嗜肺军团菌基因组DNA中扩增军团菌主要免疫原蛋白ip基因,并将其定向克隆至原核表达载体pET-32a( ),构建原核表达重组质粒pET-ip,经限制性内切酶鉴定、PCR及测序分析后,转化宿主菌大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析鉴定。结果扩增出了792 bp完整的ip基因,构建的原核表达重组质粒pET-ip表达出49 kDa Trx-IP的融合蛋白质,Western-blot证实获得蛋白为所需要的目的蛋白。结论成功构建了军团菌ip基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中得到了高效表达。     

基因芯片技术对赖型钩端螺旋体溶血素基因体内诱导差异表达的研究

目的探讨经宿主体内环境诱导前后赖型钩端螺旋体溶血素致病基因表达的差异。方法以赖型钩端螺旋体56601株的染色体DNA为模板,PCR扩增出溶血素基因片段为探针,并通过VersArray Chipwriter系统构建基因芯片。提取感染宿主前后钩端螺旋体RNA,逆转录为cDNA,用随机引物PCR扩增,以HEX和CY5双色荧光标记并与基因芯片进行杂交,使用Genepix 4000B扫描仪扫描芯片,通过检测芯片上的荧光信号比值来研究钩端螺旋体溶血素基因在宿主体内的表达情况。结果成功构建赖型钩端螺旋体56601株溶血素基因芯片,芯片检测发现在宿主感染后钩体溶血素基因LA1029(Ratio=0.65)、LA1027(Ratio=0.53)具有明显上调表达(Ratio<0.67);LA3540(Ratio=1.88)、LA3937(Ratio=5.58)、LA1029(Ratio=3.00)在宿主肝脏中的表达比在血液中有明显增高(Ratio>1.5),而LA4004的表达在宿主肝脏中要明显低于血液中(Ratio=0.67);LA3937(Ratio=2.28)和LA1029(Ratio=2.20)在宿主肾脏中的表达要明显高于血液中(Ratio>1.5)。结论钩体溶血素基因的体内外表达和不同器官间的表达存在差异,这些差异表达的溶血素基因及产物在钩体病的致病中可能起重要的作用。     

EB病毒逃避宿主免疫的机制

EB病毒(EBV)在感染宿主的过程中需要克服宿主免疫系统的防御,因此衍生了一系列干扰人体免疫的策略。EBV感染后会长期潜伏在宿主B细胞中,并对宿主主要组织相容性复合体分子的表达进行干扰,影响宿主的抗病毒免疫。EBV表达的BCRF1蛋白可刺激Th2细胞的产生,BARF1蛋白可诱发α型干扰素等细胞因子的分泌,多种病毒蛋白均可干扰细胞因子网络。同时EBV编码的BHRF1等蛋白可发挥抗凋亡作用。该文就EBV免疫逃避的最新研究进展进行了归纳总结,以期为EBV防控、新型疫苗设计等提供参考。     

异体骨移植近交系小鼠动物模型的建立

选用二组主要组织相容性复合体不相同的近交系小鼠C57BL／6和DBA／2，进行异体新鲜骨和同基因新鲜骨移植，通过检测宿主抗体一补体介导的细胞杀伤反应、细胞介导的细胞杀伤反应和宿主淋巴细胞IL-2R的表达率，其结果显示，异体骨移植后产生明显的免疫排斥反应，而同基因新鲜骨移植后来检测到明显的细胞杀伤反应和淋巴细胞IL-2R的表达。因此认为，近交系小鼠C57BL／6和DBA／2可以作为异体骨移植研究的动物模型。     

Dectin-1在宿主抗隐球菌感染的机制与研究进展

固有免疫在隐球菌感染中发挥着至关重要的作用，宿主建立对隐球菌有效免疫应答的第一步是通过固有免疫应答细胞表达的模式识别受体（PRR）识别隐球菌病原体相关分子模式（PAMP），进一步触发涉及许多蛋白质（脾酪氨酸激酶和胱天蛋白酶募集域蛋白9等）的细胞内信号级联反应。本篇综述中笔者总结了固有免疫应答细胞模式识别受体Dectin-1与隐球菌病原体相关分子模式的相互识别机制，并讨论了Dectin-1信号通路在宿主抗隐球菌感染免疫中的作用及其在隐球菌病药物和疫苗佐剂研发中的潜在应用。