滇重楼环阿屯醇合酶基因的克隆及序列分析

目的 获取滇重楼甾体皂苷合成途径关键酶环阿屯醇合酶基因（PpCAS）的全长cDNA序列,并进行序列分析。方法 利用同源克隆和RT-PCR技术获得PpCAS基因保守片段,采用RACE技术获得PpCAS基因的3’及5’末端序列,并采用生物信息学方法进行序列分析。结果 PpCAS基因全长cDNA为2 309 bp,其开放阅读框（ORF）为2 283 bp,可编码760个氨基酸的蛋白质;PpCAS推导的蛋白质相对分子质量为8.69×10⁴,等电点（pI）为6.54;其氨基酸序列与GenBank中其他植物CAS的同源性在60%～83% PpCAS蛋白。结论 从滇重楼中首次获得PpCAS基因cDNA全长序列,该基因具有CAS同源基因的典型特征。     

人骨形态发生蛋白-7全长基因cDNA的克隆和序列分析

目的:克隆人骨形态发生蛋白-7(BMP-7)全长基因,并进行测序及序列分析,研究其结构和功能。方法:采用异硫氰酸胍一步法从人胎儿肾中提取总RNA,利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的方法,分段扩增出hBMP-7全长基因cDNA,与PGEM-T easy连接成PGEM-T easy/hBMP-7重组质粒,采用Sanger双脱氧链终止法测定基因序列。结果:以4号特异引物引导的RT-PCR扩增出BMP-7基因3’端540bp片段,以2号特异引物引导的RT-PCR扩增出BMP-7基因5’端750bp片段,重组连接两片段得到BMP-7全长基因cDNA。与Genebank上发表的hBMP-7序列(XM30619)比较有一个碱基不同,第862位核苷酸由T→G,编码的氨基酸由苯丙氨酸变为缬氨酸。结论:首次从中国人胎肾中分段克隆出BMP-7全基因cDNA,该基因在骨关节系统的损伤与修复中具有重要的临床应用价值。     

白桂木凝集素基因的5'RACE与3'RACE扩增及序列分析

[目的]对白桂木凝集素基因进行扩增及序列分析.[方法]采用RT-PCR结合RACE技术,扩增得到白桂木凝集素(AHL)基因的保守区域、5'末端及3'末端.用VectorNTI软件将测序得到的AHL cDNA的保守区域、5'末端、3'末端进行校正、拼接得到完整AHLcDNA序列.[结果]全长含有933个核苷酸.其推导的氨基酸序列NCBI做BLAST比对,相似度高达70％～80％.[结论]对白桂木凝集素基因的cDNA序列进行研究,可为进一步从分子水平探明白桂木凝集素的作用机制提供科学依据.     

显齿蛇葡萄查耳酮合成酶基因cDNA克隆及蛋白质序列分析

目的 对显齿蛇葡萄Ampelopsis grossedentata查耳酮合成酶（CHS）基因进行克隆及序列分析。方法 根据已经克隆的植物基因的保守序列设计一对引物,以显齿蛇葡萄总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增CHS基因序列并连接到pMD18-T Simple载体上,阳性克隆经PCR检测后进行测序。结果 得到一段1 173 bp的序列,序列分析表明,该片段编码390个氨基酸,与其他高等植物CHS基因氨基酸序列同源性在67.9%以上。结论 首次从显齿蛇葡萄中克隆了CHS基因,为有效利用该基因奠定了基础。     

幽门螺杆菌cagA基因全长克隆及序列分析

目的探索扩增cagA基因全长的PCR方法,克隆中国2株胃癌幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)分离株和1株十二指肠溃疡分离株及国际标准株SS1的cagA基因,初步探讨cagA序列和磷酸化位点变异及其临床意义.方法针对已知cagA基因两侧及cag致病岛右侧反转重复序列设计PCR引物,扩增cagA基因并克隆测序,分析已知cagA序列同源性及其酪氨酸磷酸化位点.结果3株中国Hp分离株cagA氨基酸序列的同源性约为94%(93.9%、94%、94.5%),并都有pY117/118/122和EPIYA-A、B、D 4个酪氨酸磷酸化位点.SS1株cagA与西方菌株同源性大于85%,而与中国菌株的同源性小于80%,具有pY117/118/122和EPIYA-A、B、C 4个酪氨酸磷酸化位点.结论建立的PCR方法可扩增cagA基因全长.CagA序列变异和磷酸化位点具有地区聚类特征,但与Hp感染临床结局无特殊关联.     

当归肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析

目的 对当归肌动蛋白（Actin）基因进行克隆及序列分析。方法 根据已经克隆的植物Actin基因的保守序列设计一对简并性引物,以当归根部总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增Actin基因片段并连接到pMD19-T载体上,阳性克隆经PCR检测后进行测序。结果 得到一段598 bp的序列,序列分析表明,该片段编码198个氨基酸,与高等植物Actin基因核苷酸序列同源性在83%以上,与其他肌动蛋白氨基酸序列同源性达94%以上。结论 首次从当归中克隆出了Actin基因,为有效利用该基因奠定了基础。     

桑黄肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析

目的 对桑黄肌动蛋白（Actin）基因进行克隆及序列分析。方法 搜索网上已知数据库中Actin基因,与本实验室测得的桑黄转录组数据进行生物信息学比对,找到转录组数据中与Actin相似性最高的片段,并根据其设计引物,提取桑黄菌丝体总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增Actin基因片段并对PCR产物进行测序。结果 得到一段839 bp的序列,序列分析表明,该片段编码279个氨基酸,与其他物种Actin基因核苷酸序列同源性在87%以上。结论 首次从桑黄中克隆出了Actin基因,为有效利用该基因奠定了基础。     

党参肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析

目的 对党参肌动蛋白（actin）基因进行克隆及序列分析。方法 根据已经克隆的植物actin基因的保守序列设计一对简并性引物,以党参根部总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增actin 基因片段并连接到pMD19-T Simple载体上,阳性克隆经PCR检测后进行测序。结果 得到一段603 bp的序列,序列分析表明,该片段编码200个氨基酸,与高等植物actin基因核苷酸序列同源性在78%以上,与其他肌动蛋白氨基酸序列同源性达90%以上。结论 首次从党参中克隆出了actin基因,为有效利用该基因奠定了基础。     

人卵泡抑素基因全长cDNA的克隆

目的克隆人卵泡抑素(FS)全长cDNA基因.方法采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)从人肝组织中扩增FS cDNA,构建PMD18-T载体,采用BamH Ⅰ、HindⅢ双酶切以及DNA测序进行鉴定.结果RT-PCR扩增长度为968 bp的基因片段,BamH Ⅰ、HindⅢ双酶切结果显示重组T载体中含有目的基因片段,测序结果显示编码区无基因突变.结论人FS全长cDNA基因克隆成功,并构建了重组PMD18-T载体.     

刺五加GAPDH基因的克隆及序列分析

目的 对刺五加Eleutherococcus senticosus GAPDH基因进行克隆及序列分析,使其成为可用的内参照基因。方法 采用改良的异硫氰酸胍法提取刺五加总RNA,运用RT-PCR法克隆GAPDH基因的部分序列,并以其为内参照基因进行半定量PCR。结果 克隆了长度为627 bp的刺五加GAPDH基因,推测其编码209个氨基酸,与三七、人参、拟南芥的GAPDH氨基酸序列同源性分别为97%、93%、93%,核苷酸同源性分别为94%、86%、84%。其作为内参照基因的半定量PCR具有良好的扩增效果和重现性。结论 首次分离并克隆了刺五加GAPDH cDNA,证实该序列可以作为基因表达分析的内参照基因,为刺五加苷生物合成中关键酶的表达分析及调控机制研究奠定基础。     

罗汉果法呢基焦磷酸合成酶基因的克隆及其序列分析

目的 对罗汉果甜苷V生物合成途径的关键酶法呢基焦磷酸合成酶（Farnesyl pyrophosphate synthase,FPPS）基因的全长cDNA序列进行克隆,为研究罗汉果甜苷V生物合成与基因调控奠定基础。方法 根据植物FPPS基因保守功能域设计简并引物,通过PCR和RACE方法克隆罗汉果FPPS基因的全长cDNA。结果 获得罗汉果FPPS（SgFPPS）基因的全长cDNA序列共1 354个核苷酸,包含一个1 026核苷酸的开放阅读框架（open reading frame, ORF）,cDNA编码的蛋白包含342个氨基酸,推断蛋白质相对分子质量为3.92×10⁴。NCBI Blastx结果显示,SgFPPS基因编码的蛋白与苹果树来源FPPS具有最高同源性,氨基酸一致度达85.1%。SgFPPS具有异戊烯基转移酶的5个典型保守功能域。进化树分析结果显示,SgFPPS基因与苹果树的FPPS具有较近的亲缘关系。结论 首次克隆SgFPPS基因的全长cDNA序列,为分析SgFPPS基因表达特性及其在罗汉果甜苷V生物合成中的功能奠定基础。     

吴茱萸遗传多样性的SRAP分析

目的 分析不同产区吴茱萸的遗传多样性。方法 应用 SRAP 技术对吴茱萸的遗传背景进行研究,试剂盒提取吴茱萸幼嫩叶片基因组DNA,构建SRAP 试验体系,筛选引物并对35份样品进行遗传背景的研究,用NTSYS-pc 2.1 软件对SRAP扩增结果进行聚类分析。结果 从100对SRAP 引物中优选10对用于吴茱萸遗传背景的研究,其中两对引物可有效鉴别吴茱萸品种,分别为Me4＋Em1和Me9＋Em10。10对引物共扩增得到清晰条带188条,其中共有条带43条,多态性条带145条,多态性比率为77.1%。聚类结果显示在相关系数为0.52时,吴茱萸与密果吴萸分居两群;在相似系数为0.62时,共分为3大类群。吴茱萸中的石虎变种比吴茱萸原变种的遗传差异更显著;石虎品种呈现出较强的地缘相关性,特别是受海拔因素影响明显。结论 吴茱萸遗传背景差异明显,SRAP分析可有效鉴别不同品种的吴茱萸,并检测到地区间的差异。     

球药隔重楼HMGR功能基因保守区序列的克隆与分析

目的 研究球药隔重楼次生代谢产物甾体皂苷甲羟戊酸合成途径的一个关键酶即3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR）的基因，有助于对活性物质的合成进行调控，从而提高产量。方法 比较NCBI上公布的11种植物11条HMGR基因mRNA的同源保守区域，设计简并引物，利用RT-PCR技术，以球药隔重楼新鲜茎总RNA反转录的cDNA为模板成功扩增出404 bp的保守区基因片段。结果 序列分析表明，球药隔重楼HMGR基因片段与其他7种植物的一致性达到76%～81%，球药隔重楼HMGR氨基酸片段与其他植物有较高的同源性，经Genbank查询为一新的cDNA。结论 通过蛋白质特征区、保守区以及进化树分析，初步确定该基因为HMGR基因，这是首次从药用植物球药隔重楼中克隆得到甲羟戊酸途径关键酶HMGR的基因片段，也是百合科植物首次获得的HMGR基因。     

铁皮石斛磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆及表达分析

目的 克隆铁皮石斛Dendrobium officinale磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（pepc）基因,并对其在F型和H型铁皮石斛中的表达进行分析,为研究铁皮石斛pepc基因的结构、功能提供依据。方法 基于GenBank上已知的pepc基因的同源序列设计引物,应用RT-PCR和RACE等方法,克隆铁皮石斛pepc基因全长。采用荧光定量PCR方法研究pepc基因在2种铁皮石斛中的表达。结果 成功克隆了铁皮石斛pepc基因,登录号为JF423930,该基因全长为3 560 bp,其中cds序列为2 895 bp,与兰科植物的同源性为80%左右,与其他科属植物的同源性达到70%以上,编码964个氨基酸。pepc基因在F型铁皮石斛中的表达量为H型的5.55倍。结论 成功克隆了铁皮石斛pepc基因,且F型铁皮石斛pepc基因的表达量高于H型。