姜黄素对高浓度葡萄糖诱导的RF/6A细胞损伤的抑制作用

目的:探讨姜黄素对高浓度葡萄糖培养的恒河猴脉络膜-视网膜内皮细胞(rhesus choroido-retinal endothelial cell,RF/6A)损伤的保护作用及机制。方法:RF/6A细胞分4组培养(n=6/组),对照组:DMEM培养基+100/L胎牛血清;高糖组:对照组培养基添加40mmol/L葡萄糖;姜黄素组:对照组培养基添加30μmol/L姜黄素;姜黄素-高糖组:对照组培养基添加40mmol/L葡萄糖及30μmol/L姜黄素。分组培养5d后,显微镜观察各组细胞生长状态,噻唑蓝比色法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)检测各组细胞活力,琼脂糖凝胶电泳检测DNA ladder判断凋亡,Western-blot检测肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表达。结果:与对照组相比,高糖组RF/6A细胞生长状态较差,活力明显降低(P<0.01),而姜黄素组及姜黄素-高糖组RF/6A活力无明显变化(P>0.05)。高糖组RF/6A出现明显的DNA ladder,对照组、姜黄素组以及姜黄素-高糖组未见明显DNA ladder。与对照组相比,高糖组TNF-α表达上调(P<0.01),姜黄素组及姜黄素-高糖组TNF-α表达无明显变化(P>0.05)。结论:姜黄素抑制高浓度葡萄糖诱导的RF/6A细胞凋亡、维持细胞活力,可能与姜黄素恢复高浓度葡萄糖诱导的TNF-α表达有关。     

pEGFP/Ang-1转染BMSCs对高糖环境中RF/6A细胞的保护作用

目的：观察血管生成素-1/重组质粒（ pEGFP/Ang-1）转染的大鼠骨髓间充质干细胞（ BMSCs）对高浓度葡萄糖损伤猴脉络膜-视网膜内皮细胞（RF/6A）的保护作用。方法：以pEGFP／Ang-1转染BMSCs,倒置荧光显微镜下观察增强型绿色荧光蛋白的表达,再利用Transwell模型,将转染的BMSCs与RF／6A共培养于高浓度葡萄糖培养基中。3d后MTr法检测RF／6A活力,Westernblot检测磷酸化蛋白激酶B（phosphorylatedproteinkinaseB,P—PKB）的表达,从而探讨转染pEGFP／Ang-1的BMSCs对高浓度葡萄糖培养中的RF／6A的保护作用。结果：成功转染pEGFP／Ang-1的BMSCs可见增强型绿色荧光蛋白表达,与转染pEGFP／Ang-1的BMSCs共培养的RF／6A细胞活力及P—PKB的表达均高于未转染组（均P〈0．01）,与对照组无明显差别（均P〉0．05）。结论：质粒pEGFP／Ang-1转染的BMSCs对高糖环境中的RF／6A具有保护作用,其机制可能与P—PKB表达上调有关。     

Ang-1对高糖环境中RF/6A单层的保护作用

目的探讨高浓度葡萄糖及血管生成素-1（Ang-1）对内皮细胞（EC）单层通透性的影响。方法将猴脉络膜-视网膜内皮细胞（RF/6A）接种于0.8μm聚碳酸酯微孔滤膜,形成致密单层后分3个组培养。正常对照组：含葡萄糖25mmol/L;高糖组：含葡萄糖40mmol/L;Ang-高糖组：含葡萄糖40mmol/L＋Ang-1（250ng/mL）。于1、3、5、7d,4个时间点建立EC单层通透性模型,检测蛋白质渗透压反射系数（δ）及滤过系数（Kf）,以监测EC单层通透性的变化;利用Westernblot（NBT/BCIP显色法）检测5d时survivin的表达。结果3、5、7d时,高糖组EC单层通透性增高（P〈0.01）,Ang-高糖组在5d及7d时,EC单层通透性升高（P〈0.01）,但仍低于高糖组;Westernblot结果显示,Ang-高糖组survivin表达明显高于其他各组（P〈0.01）。结论高糖能够增加EC单层通透性,Ang-1能对抗高糖的这种生物学作用。可能是通过上调凋亡抑制基因survivin的表达,抑制RF/6A的凋亡而发挥生物学作用的。     

高浓度葡萄糖对视网膜毛细血管周细胞的影响

目的观察高浓度葡萄糖对体外培养的视网膜毛细血管周细胞的影响,探讨糖尿病视网膜病变(DR)的发病机制。方法以新鲜牛眼球为材料,分离并培养周细胞;控制培养液中葡萄糖的浓度,采用形态学观察、乳酸脱氢酶(LDH)的测定、3H-TdR掺入法及液体闪烁技术,研究高糖对周细胞的作用。结果周细胞在高糖(10、20、40mmol     

枸杞多糖对高糖所致RF/6As通透性和Rho激酶的影响

目的探讨高糖条件下猴脉络膜-视网膜内皮细胞（RF/6As）损伤时的单层通透性、Rho激酶1（ROCK1）的变化及它们之间的关系,和枸杞多糖（LBP）对上述变化的影响。方法体外培养RF/6As,分为等渗葡萄糖处理组（对照组）、40mmol/L葡萄糖处理组（高糖组）及LBP＋40mmol/L葡萄糖处理组（LBP＋高糖组）。各组分别培养1、3、5、7d,应用倒置显微镜观察培养的RF/6As形态,以辣根过氧化物酶（HRP）作为示踪剂用二室弥散系统检测RF/6As单层通透性的变化,应用免疫荧光法观察各组不同时间点细胞骨架的变化,采用Westernblot法检测ROCK1在5d、7d各组细胞中的表达量。结果第3、5、7天,高糖组RF/6As随时间延长逐渐变形,正常细胞数量明显减少,单层通透性逐渐增加;3个时间点HRP的A值分别为0.074±0.011、0.135±0.022、0.253±0.047,明显高于对照组,差异均有统计学意义（P〈0.01）。LBP＋高糖组仅于7d时细胞形态略有改变,5d及7d时HRP的A值分别为0.069±0.004和0.114±0.009,较对照组明显增加,差异均有统计学意义（P〈0.01）;但明显低于高糖组,差异均有统计学意义（P〈0.01）。Westernblot检测显示,7d时LBP＋高糖组ROCK1灰度值为35849.47±1032.36,高糖组为21356.10±1566.66,差异有统计学意义（P〈0.01）。结论高糖可引起RF/6As单层通透性增加和细胞骨架的重排以及ROCK1的高表达,而LBP可通过下调ROCK1的表达减轻高糖对RF/6As的损伤。     

高浓度葡萄糖对体外培养大鼠Müller细胞P2Y2受体的影响

目的:观察高浓度葡萄糖对体外培养的大鼠视网膜Müler细胞P2Y2受体表达的影响。方法:用改进的酶消化法纯化培养并用胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和谷氨酰胺合成酶(GS)鉴定大鼠Müller细胞。分别在对照组(5.5mmol/L)与高糖组(10,25,50mmol/L)中孵育24h和72h,通过免疫荧光及荧光强度半定量分析检测Müller细胞中P2Y2受体表达的变化。结果:纯化培养到第3~4代的Müller细胞,经鉴定纯度大于90%,表达GFAP和GS。在24h,10,25,50mmol/L组的荧光强度分别为31.05±7.06,59.17±11.42和84.11±12.72,与对照组(26.60±5.15)相比较均明显增高(P<0.01)。而在72h,仅25和50mmol/L组的荧光强度明显强于对照组(P<0.01)。结论:高浓度葡萄糖上调大鼠视网膜Müller细胞P2Y2受体的表达,提示这一受体可能参与糖尿病视网膜病变过程。     

脂联素对RF/6A细胞增殖、迁移及管腔形成的影响

目的 研究脂联素(adiponectin,APN)对体外培养的猴脉络膜/视网膜内皮细胞(RF/6A)增殖、迁移和管腔形成的影响,探讨APN对脉络膜和视网膜新生血管的抑制作用.方法 取体外培养的生长良好的RF/6A细胞用于实验,将细胞随机分为对照组、不同浓度重组APN组(5 pg·mL-1、50 pg·mL-1、500 pg·mL-1预处理1h).培养24h后采用MTT法检测细胞增殖,细胞划痕法检测细胞迁移,基质胶(Matrigel)法检测管腔形成.结果 不同浓度重组APN组24 h的细胞增殖均弱于对照组(均为P＜0.05),不同浓度重组APN组细胞24 h的迁移面积均小于对照组(均为P＜0.05),不同浓度重组APN组管腔形成数均明显少于对照组(均为P＜0.05),且细胞增殖、迁移和管腔形成均随着重组APN浓度的升高而降低.结论 APN能够明显抑制RF/6A细胞的血管生成过程,提示APN对于脉络膜和视网膜新生血管具有一定的保护作用.     

脂联素对视网膜血管内皮细胞缺氧损伤的保护作用及机制研究

目的：研究脂联素对缺氧损伤的恒河猴脉络膜/视网膜内皮(RF/6A)细胞的保护作用及相关机制。

方法：将体外培养的RF/6A细胞随机分为对照组、缺氧损伤(CoCl₂刺激诱导24h)组和缺氧损伤+脂联素(5、50、100μmol/L脂联素预处理6h)组。采用MTT法检测细胞活力,选择合适的脂联素内皮细胞保护作用浓度,并采用Western blot检测凋亡相关因子Bax、Bcl-2的表达情况,同时测定细胞内活力氧簇(ROS)的表达水平。

结果：与对照组相比,缺氧损伤组和各浓度脂联素预处理的RF/6A细胞活力均下降(均P<0.01); 与缺氧损伤组相比,各浓度脂联素预处理后细胞活力均显著增加(均P<0.05),其中50μmol/L脂联素是较为合适的保护作用浓度。与对照组相比,缺氧损伤组细胞活力降低,Bax蛋白表达量升高,Bcl-2蛋白表达量降低,ROS生成增加(P<0.01); 与缺氧损伤组相比,脂联素预处理后细胞活力增加,Bax蛋白表达量降低,Bcl-2蛋白表达量增加,ROS生成减少(P<0.01)。

结论：脂联素可明显减轻缺氧造成的视网膜血管内皮细胞损伤和凋亡,其机制可能与脂联素减轻氧化应激有关。     

血管生成素1对高糖环境中猴脉络膜-视网膜内皮细胞的保护作用

目的 探讨高浓度葡萄糖对内皮细胞（endothelial cell,EC）单层通透性模型通透性的影响以及血管生成素1（angiopoietin-1,Ang-1）对此的保护作用。方法 将猴脉络膜-视网膜内皮细胞（RF/6A）接种于孔径0.8 μm聚碳酸酯微孔滤膜中,形成致密单层后分三组培养。正常对照组：DMEM高糖培养基,含葡萄糖25 mmol/L;高糖组：DMEM培养基,含葡萄糖40 mmol/L;Ang-高糖组：DMEM培养基,含葡萄糖40 mmol/L＋Ang-1 250 ng/ml。于第1天、第3天、第5天、第7天4个时间点建立EC单层通透性模型,检测蛋白质渗透压反射系数（δ）及滤过系数（Kf）,以监测EC单层通透性的变化;利用Western blot（NBT/BCIP显色法）检测第5天时survivin的表达。结果 第3天、第5天及第7天时,高糖组EC单层通透性增高（P〈0.01）,Ang-高糖组在第5天及第7天时,EC单层通透性升高（P〈0.01）,但仍低于高糖组;Western blot结果显示,Ang-高糖组survivin表达明显高于其他各组（P〈0.01）。结论 高糖能够增加EC单层通透性,Ang-1能对抗高糖的这种生物学作用。它可能是通过上调凋亡抑制基因survivin的表达,抑制RF/6A的凋亡而发挥生物学作用。     

Leptin activates the JAK/STAT pathway to promote angiogenesis in RF/6A cells in vitro

AIM: To investigate the effect of leptin on the angiogenesis of RF/6A cells (monkey retinal choroidal endothelial cells) in vitro and test the cellular signaling in the mechanism. METHODS: RF/6A cells were cultured in vitro and randomly divided into four groups: normal control, with leptin at 50, 100, 200 ng/mL for cell counting kit-8 (CCK8). RF/6A cell proliferation and migration were examined by Transwell assays, while RF/6A cell tube formation by Matrigel assay. JAK2, p-JAK2, STAT3, and p-STAT3 protein expression was measured by Western blotting. Cells were then divided into the following treatment groups: control, 100 ng/mL leptin and AG-490 (100 ng/mL leptin+10 μmol/L AG-490) for examinations of RF/6A cellular behaviour again. Analysis of differences was carried out using one-way ANOVA and least significant difference (LSD). RESULTS: RF/6A cell proliferation, migration and cell tube formation were promoted significantly by leptin in a dose-dependent manner (P<0.05). Western blotting showed that leptin up-regulated p-JAK2 and p-STAT3 expression levels. Treatment with the JAK/STAT pathway inhibitor, AG-490, decreased leptin-induced p-JAK2 and p-STAT3 expression, and inhibited cell proliferation, migration and cell tube formation induced by leptin (P<0.05). CONCLUSION: Leptin can promote RF/6A cell angiogenesis in vitro via activation of the JAK2/STAT3 signaling pathway.     

虫草素对高糖培养的恒河猴脉络膜-视网膜血管内皮细胞血管新生的影响

目的：观察虫草素对高糖培养的恒河猴脉络膜-视网膜血管内皮细胞(RF/6A)血管新生作用的影响,探讨其可能的作用机制。
　　方法：培养 RF/6A 细胞,分为正常对照组(NC 组)、高糖对照组(HG 组)、高糖加不同浓度的虫草素组(HG+10μg/ mL组、HG+50μg/ mL 组、HG+100μg/ mL 组)。采用 CCK8法检测各组细胞的增殖活性;采用 Transwell 实验检测各组细胞的迁移;采用 Matrigel 检测各组管腔形成的情况;采用 Western-blot 检测各组细胞中 VEGF 和 VEGFR2蛋白表达的情况。
　　结果：与 NC 组相比,HG 组 RF/6A 的增殖活性增加( P<0.05)。不同浓度的虫草素对 RF/6A 的增殖均有抑制作用,随着虫草素浓度增加,细胞活性下降。 HG+10μg/ mL组、HG+50μg/ mL 组、HG+100μg/ mL 组的增殖活性抑制率分别为(10.2依0.9)%、(23.4依1.5)%、(31.1依1.2)%,与 HG 组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。 NC 组、HG组、HG+10μg/ mL 组、HG+50μg/ mL 组、HG+100μg/ mL 组细胞迁移个数分别为55.6依2.70、87.4依2.40、65.4依2.7、57.8依2.38、62.4依2.77个。与 NC 组相比,HG 组迁移细胞数量增加(P<0.05);不同浓度虫草素组细胞迁移数量随着虫草素浓度的增加而减少,与 HG 组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。 NC 组、HG 组、HG+10μg/ mL 组、HG+50μg/ mL 组、HG+100μg/ mL 组的细胞管腔形成个数分别为18.7依2.08、25.7依1.52、19.9依1.57、16.3依2.51、5.7依1.72个。与 NC 组相比,HG 组细胞管腔形成个数增加(P<0.05);不同浓度虫草素组细胞管腔形成个数随着虫草素浓度的增加而减少,与 HG 组相比,差异具有统计学意义( P <0.05)。与 NC 组相比, HG 组 VEGF 和VEGFR2蛋白表达的量增加(P<0.05);不同浓度虫草素组中细胞内 VEGF 和 VEGFR2蛋白表达的量均低于高糖对照组(P<0.05)。
　　结论：虫草素可能通过抑制高糖下 VEGF 和 VEGFR2蛋白的表达,抑制 RF/6A 细胞增殖、迁移和管腔形成,进而抑制血管新生。     

姜黄素对体外培养的硒性白内障形成的作用

目的观察姜黄素对亚硒酸钠诱导的体外培养兔晶状体混浊的影响,探讨姜黄素对抗晶状体氧化损伤的效果。方法将体外培养的40只正常家兔的晶状体分为5组：空白对照组、亚硒酸钠组（30μmol/L）、姜黄素A组（30mg/L）、姜黄素B组（50mg/L）及卡林-U组（质量分数1%）。分别于培养后24、48、72、96h观察各组晶状体的透明度,同等条件下用数码相机拍照记录各组晶状体的形态,用分光光度计测定晶状体组织中的谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）的变化。结果在48h时,不同质量分数姜黄素组与空白对照组比较,不同分级的晶状体混浊的眼数差异无统计学意义（H=1.464,P〉0.05）,姜黄素组与卡林-U组及亚硒酸钠组比较,不同分级的晶状体混浊眼数的差异有统计学意义（H=10.607,P〈0.01）;72h时,不同质量分数姜黄素组与空白对照组比较,不同分级的晶状体混浊的眼数差异无统计学意义（H=3.288,P〉0.05）;姜黄素组与卡林-U组及亚硒酸钠组比较,不同分级的晶状体混浊眼数的差异有统计学意义（H=8.258,P〈0.05）。晶状体培养后96h,不同质量分数姜黄素组与空白对照组比较,不同分级的晶状体混浊眼数的差异有统计学意义（U=7.102,P〈0.05）;不同质量分数姜黄素组与卡林-U组及亚硒酸钠组比较,不同分级的晶状体混浊眼数的差异有统计学意义（H=9.699,P〈0.05）。与空白对照组比较,亚硒酸钠组GSH-Px、SOD活性明显降低,MDA浓度明显升高。不同质量分数姜黄素组和卡林-U组的GSH-Px、SOD活性高于亚硒酸钠组,低于空白对照组,MDA浓度介于空白对照组与亚硒酸钠组之间,卡林-U组的GSH-Px、SOD活性低于姜黄素组,MDA浓度高于姜黄素组。结论姜黄素及卡林-U均具有抗氧化损伤作用,均可推迟亚硒酸钠诱导的体外培养兔晶状体混浊的发生时间,姜黄素的作用强于卡林-U,但姜黄素与卡林-U最终均不能抑制白内障的发生。     

高浓度糖对体外培养的视网膜Müller细胞膜离子通道的影响

目的观察在高浓度葡萄糖条件下,体外培养的兔视网膜Müller细胞的钙依赖性钾通道的变化.方法高浓度葡萄糖条件下体外培养兔视网膜Müller细胞,应用免疫组织化学技术和透射电镜鉴定Müller细胞,并采用膜片钳技术观察不同时期高糖条件下视网膜Müller细胞钙依赖性钾通道的变化.结果高糖对体外培养的Müller细胞钙依赖性钾通道有阻滞作用,其阻滞作用呈时间依赖性.结论 高浓度葡萄糖可能通过阻滞钙依赖性钾通道而降低Müller细胞的生物学功能.     

鱼精蛋白体外抑制RF/6A细胞中血管内皮生长因子表达的研究

目的研究鱼精蛋白对体外培养的RF/6A细胞中血管内皮生长因子（VEGF）表达的抑制作用。方法建立RF/6A细胞的正常及缺氧培养模型,在上清液中加入鱼精蛋白,质量浓度分别为10、20、40、80、160μg/mL。在细胞培养的0、24、48、72、96、120h取上清液行ELISA检测,定量分析细胞的VEGF表达情况。在培养96h时,取出细胞铺片行免疫病理学检测,检测VEGF与受体的结合状况。结果在10～80μg/mL的范围内,鱼精蛋白的抑制作用与质量浓度成正比,80μg/mL为最佳的抑制质量浓度。缺氧条件下RF/6AVEGF的表达量始终高于正常氧浓度条件下;正常和缺氧状态下,鱼精蛋白均可以明显抑制VEGF的表达,不同组的差异有统计学意义（F=7.85,P=0.002）。免疫病理染色表明鱼精蛋白减少了VEGF与其受体的结合。结论一定质量浓度的鱼精蛋白对正常及缺氧状态下的RF/6AVEGF的表达有明确的抑制作用,同时还可以减少VEGF与VEGF受体的结合。鱼精蛋白有可能成为临床治疗缺血型新生血管性眼底病的新药。