人降钙素基因的克隆及其序列分析

目的：克隆人降钙素基因（ｈＣＴ）并经序列分析予以确证。方法：首先自新鲜全血中用含ＴｒｉｔｏｎＸ－１００的缓冲液提取基因组ＤＮＡ，经酒精沉淀和洗涤后，作为模板，加入上下游引物，应用聚合酶链反应直接扩增出ｈＣＴ的编码序列。并将此段ＤＮＡ插入克隆载体ｐＵＣ１８的ＥｃｏＲＩ和ＳｍａＩ位点之间。最后用ＰＣＲ－双脱氧末端终止法进行序列分析。结果：成功地克隆了ｈＣＴ，证实所得ｈＣＴ基因克隆含编码人降钙素３２个氨基酸的全长ＤＮＡ序列９６ｂｐ。结论：已获得人降钙素基因克隆，为后续研究打下基础     

白桂木凝集素基因的5'RACE与3'RACE扩增及序列分析

[目的]对白桂木凝集素基因进行扩增及序列分析.[方法]采用RT-PCR结合RACE技术,扩增得到白桂木凝集素(AHL)基因的保守区域、5'末端及3'末端.用VectorNTI软件将测序得到的AHL cDNA的保守区域、5'末端、3'末端进行校正、拼接得到完整AHLcDNA序列.[结果]全长含有933个核苷酸.其推导的氨基酸序列NCBI做BLAST比对,相似度高达70％～80％.[结论]对白桂木凝集素基因的cDNA序列进行研究,可为进一步从分子水平探明白桂木凝集素的作用机制提供科学依据.     

掌叶半夏凝集素A的分离纯化及分析

首次从中草药堂叶半夏（Ｐｔｎｅｌｌｉａ ｐｅｄａｔｉｓｅｃｔａ Ｓｅｈｏｔｔ）中通过Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００分子筛层析、ＤＥ－３２离子交换层析和制备电泳分离纯化出一种对兔红血球有血凝生的凝信要素，称之为掌叶半夏凝集素Ａ（ｐｉｎｅｌｌｉａ ｐｅｄｔａｉｓｅｃｔａ ｌｅｃｔｉｎ Ａ，ＰＰＬ－Ａ）ｄ ＰＡＧＥ＇ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和等电聚焦电泳上ＰＰＬ－Ａ均显示出一条蛋白质着色带。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测定     

檀香萜烯合成酶基因的克隆与序列分析

目的通过克隆技术获得参与檀香挥发油形成的萜烯合成酶基因。方法利用CTAB-LiCl法提取檀香已结香心材总RNA,采用RT-PCR技术克隆萜烯合成酶基因。结果克隆获得了一个檀香萜烯合成酶基因,该基因编码区全长1 731 bp,编码576个氨基酸残基。结论 CTAB-LiCl法能提取较高质量的檀香心材总RNA,克隆获得的萜烯合成酶具有编码区。     

掌叶半夏凝集素A的分离纯化及分析

首次从中草药掌叶半夏（ＰｔｎｅｌｌｉａｐｅｄａｔｉｓｅｃｔａＳｃｈｏｔｔ）中通过ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００分子筛层析、ＤＥ－３２离子交换层析和制备电泳分离纯化出一种对兔红血球有血凝活性的凝集素，称之为掌叶半夏凝集素Ａ（ＰｉｎｅｌｌｉａｐｅｄｔａｉｓｅｃｔａｌｅｃｔｉｎＡ，ＰＰＬ－Ａ）。在ＰＡＧＥ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和等电聚焦电泳上ＰＰＬ－Ａ均显示出一条蛋白质着色带，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测定其Ｍｒ为１６．３×１０３，用等电聚焦电泳测得其等电点为５．８，经ＤＮＳ－Ｃｌ分析法分析其氨基末端为丙氨酸。对所含的１８种氨基酸作了定量分析。通过Ｓｃｈｉｆｆ试剂电泳染色法鉴定ＰＰＬ－Ａ为糖蛋白，用酶标凝集素结合法分析了糖链的结构，糖链部分含有甘露糖，岩藻糖和乙酰氨基葡萄糖。     

滇重楼环阿屯醇合酶基因的克隆及序列分析

目的 获取滇重楼甾体皂苷合成途径关键酶环阿屯醇合酶基因（PpCAS）的全长cDNA序列,并进行序列分析。方法 利用同源克隆和RT-PCR技术获得PpCAS基因保守片段,采用RACE技术获得PpCAS基因的3’及5’末端序列,并采用生物信息学方法进行序列分析。结果 PpCAS基因全长cDNA为2 309 bp,其开放阅读框（ORF）为2 283 bp,可编码760个氨基酸的蛋白质;PpCAS推导的蛋白质相对分子质量为8.69×10⁴,等电点（pI）为6.54;其氨基酸序列与GenBank中其他植物CAS的同源性在60%～83% PpCAS蛋白。结论 从滇重楼中首次获得PpCAS基因cDNA全长序列,该基因具有CAS同源基因的典型特征。     

人存活素基因编码区的克隆和序列分析

目的：克隆人存活素(survivin)基因编码区cDNA并进行序列分析。方法：以人骨肉瘤细胞系MG63的mRNA为模板，采用RT-PCR方法得到人存活素的编码区cDNA，克隆至载体pUC19中，酶切鉴定后进行序列分析。结果：获得人存活素编码区基因和重组质粒pUC19-SURVIVIN，DNA序列分析证实所获得的存活素基因编码区cDNA序列和文献报道一致。结论：采用基因克隆的方法获得人存活素基因，为进一步研究其结构和功能奠定了基础。     

党参肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析

目的 对党参肌动蛋白（actin）基因进行克隆及序列分析。方法 根据已经克隆的植物actin基因的保守序列设计一对简并性引物,以党参根部总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增actin 基因片段并连接到pMD19-T Simple载体上,阳性克隆经PCR检测后进行测序。结果 得到一段603 bp的序列,序列分析表明,该片段编码200个氨基酸,与高等植物actin基因核苷酸序列同源性在78%以上,与其他肌动蛋白氨基酸序列同源性达90%以上。结论 首次从党参中克隆出了actin基因,为有效利用该基因奠定了基础。     

桑黄肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析

目的 对桑黄肌动蛋白（Actin）基因进行克隆及序列分析。方法 搜索网上已知数据库中Actin基因,与本实验室测得的桑黄转录组数据进行生物信息学比对,找到转录组数据中与Actin相似性最高的片段,并根据其设计引物,提取桑黄菌丝体总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增Actin基因片段并对PCR产物进行测序。结果 得到一段839 bp的序列,序列分析表明,该片段编码279个氨基酸,与其他物种Actin基因核苷酸序列同源性在87%以上。结论 首次从桑黄中克隆出了Actin基因,为有效利用该基因奠定了基础。     

当归肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析

目的 对当归肌动蛋白（Actin）基因进行克隆及序列分析。方法 根据已经克隆的植物Actin基因的保守序列设计一对简并性引物,以当归根部总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增Actin基因片段并连接到pMD19-T载体上,阳性克隆经PCR检测后进行测序。结果 得到一段598 bp的序列,序列分析表明,该片段编码198个氨基酸,与高等植物Actin基因核苷酸序列同源性在83%以上,与其他肌动蛋白氨基酸序列同源性达94%以上。结论 首次从当归中克隆出了Actin基因,为有效利用该基因奠定了基础。     

半夏及近缘种叶绿体非编码区序列分析

目的 通过测定半夏及近缘种的DNA叶绿体的非编码区序列,为半夏的分子鉴别和遗传多样性研究提供依据。方法 在我国半夏主要分布区收集到43份半夏及滴水珠和虎掌半夏2个近缘种,采用PCR法克隆叶片基因组DNA中psbK-psbI和atpF-atpH两段序列,借助生物信息学软件进行比对分析。结果 半夏atpF-atpH序列长为337～342 bp,较为保守,仅含变异位点7个,其中信息位点1个,遗传距离为0～0.024。半夏psbK-psbI序列长为432～435 bp,变异位点37个,其中信息位点17个,遗传距离为0～0.069。聚类分析结果均显示出与表型以及地理居群的不一致。结论 psbK-psbI序列较atpF-atpH有更好的鉴别能力,在半夏种内具有较丰富的变异位点。     

半夏毒针晶的致炎作用研究

目的 探讨半夏毒针晶引起的刺激性炎症的机体表现及对相关炎症介质的影响。方法 采用小鼠毛细管通透性实验、小鼠腹腔炎症实验及大鼠足跖肿胀实验,考察不同剂量半夏毒针晶的致炎效应及其量-效关系,并测定相关炎症介质的量。结果 半夏毒针晶混悬液可使小鼠腹腔毛细血管通透性增加,腹腔渗出液中炎症介质前列腺素E₂（PGE₂）、一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）的量增加;亦可引起大鼠足跖肿胀,并在一定剂量范围内表现为典型的量-效关系,还可使大鼠致炎足跖中炎症介质PGE₂、环氧合酶-2（COX-2）的量显著增加。结论 半夏毒针晶刺激性毒性在机体内表现为炎症反应。     

一株植物内生真菌漆斑菌次级代谢产物的研究

从一株植物内生漆斑菌属Myrothecium sp.真菌固体发酵物的乙酸乙酯提取物中分离得到12个化合物。采用硅胶、Sephadex LH-20和制备高效液相等柱色谱技术进行分离纯化,通过理化性质研究及波谱学手段对单体化合物进行结构鉴定,分别鉴定为3''-羟基疣孢菌素A（1）、疣孢菌素A（2）、乙酰基疣孢菌素L（3）、疣孢菌素J（4）、疣孢菌素K（5）、漆斑菌素A（6）、漆斑菌素D（7）、漆斑菌素H（8）、漆斑菌素J（9）、verrol 4-acetate （10）、（3S, 3aS, 6α, 6aR）-dihydrosporothrioride （11）和4,6-二羟基-1（3H）-异苯并呋喃（12）。其中,化合物1、5、9 ~ 12为首次从漆斑菌属真菌中分离得到,化合物2、3、4、7和8对白色念珠菌有较强的抑制作用,其最低抑菌浓度MIC₅₀分别是0.318、0.218、0.047、0.569和0.558 μg/mL。     

不同产地半夏指纹图谱的建立及化学模式识别研究

[目的]建立半夏药材超高效液相色谱（UPLC）指纹图谱,结合化学模式识别筛选差异性标志成分。[方法]采用ACQUITY UPLC HSS T3柱（2.1 mm×100 mm,1.8μm）,流动相为0.1%磷酸水-乙腈,梯度洗脱,流速为0.2 m L/min,进样体积为10μL,柱温为32°C,检测波长为260 nm。采用相似度评价和化学模式识别相结合的方法对其进行分析。[结果]在18批半夏UPLC指纹图谱中指认出15个共有峰,其中16批样品相似度均大于0.877,其余2批分别为0.606、0.778。聚类分析结果显示不同产地的半夏分为两大类,主成分分析和聚类分析结果一致,采用正交偏最小二乘-判别分析筛选出6个差异性标志成分,通过对照品指认出3个成分（胞苷、次黄嘌呤、鸟苷）。[结论]建立的指纹图谱方法稳定、可靠、重复性好,结合化学模式识别,可为半夏质量评价提供参考。     

球药隔重楼HMGR功能基因保守区序列的克隆与分析

目的 研究球药隔重楼次生代谢产物甾体皂苷甲羟戊酸合成途径的一个关键酶即3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR）的基因,有助于对活性物质的合成进行调控,从而提高产量。方法 比较NCBI上公布的11种植物11条HMGR基因mRNA的同源保守区域,设计简并引物,利用RT-PCR技术,以球药隔重楼新鲜茎总RNA反转录的cDNA为模板成功扩增出404 bp的保守区基因片段。结果 序列分析表明,球药隔重楼HMGR基因片段与其他7种植物的一致性达到76%～81%,球药隔重楼HMGR氨基酸片段与其他植物有较高的同源性,经Genbank查询为一新的cDNA。结论 通过蛋白质特征区、保守区以及进化树分析,初步确定该基因为HMGR基因,这是首次从药用植物球药隔重楼中克隆得到甲羟戊酸途径关键酶HMGR的基因片段,也是百合科植物首次获得的HMGR基因。     

Ca2+对悬浮培养半夏类原球茎生长及次生代谢物累积的影响

目的 研究Ca²⁺对半夏类原球茎生长、高温胁迫及次生代谢产物量的影响。方法 以半夏叶柄为外植体,固体培养基培养获得类原球茎,悬浮培养,采用不同质量浓度Ca²⁺处理,测定类原球茎生长速率、抗逆性指标,以及生物碱、鸟苷、有机酸的量。结果 在（25±2）℃条件下培养,随Ca²⁺质量浓度增加,半夏类原球茎生长呈慢-快-慢变化趋势,质量浓度为440 mg/L时,生长速率达到最大值;不同处理半夏类原球茎中生物碱、鸟苷、有机酸量差异显著,Ca²⁺质量浓度为440 mg/L时,生物碱量最高（0.158%）,Ca²⁺质量浓度为660 mg/L时,鸟苷、有机酸累积量最高（分别为0.017 3%、0.608%）。在（35±2）℃条件下,质量浓度为0～660 mg/L,随Ca²⁺质量浓度升高,SOD、POD活性逐渐增强,Ca²⁺质量浓度为660 mg/L时,活性最高,但Ca²⁺质量浓度为880 mg/L时,SOD、POD活性均降低;不同质量浓度Ca²⁺处理MDA量变化不显著。结论 一定质量浓度的Ca²⁺能促进半夏类原球茎生长,增强抗逆性,提高有用次生代谢产物的量。     

黄花蒿HDS基因的克隆与功能分析

目的 克隆获得黄花蒿MEP途径中必需关键酶——羟甲基丁烯基-4-磷酸合成酶基因（HDS）,并进行生物信息学分析和功能互补分析研究。方法 对已知的其他种子植物HDS基因的核苷酸序列进行多重序列比对,选取保守区域设计简并引物,利用同源扩增和cDNA末端快速扩增技术从黄花蒿中获得目的基因;利用BLAST进行序列比对,ORF Finder寻找开放阅读框,并用MEGA3.0中的临位相联法构建进化树。结果 得到1条长2 324 bp的HDS cDNA序列,其ORF框长1 854 bp,编码617个氨基酸残基的蛋白;生物信息学分析显示,黄花蒿HDS基因AaHDS与其他种子植物来源的HDS高度同源;功能互补分析表明,AaHDS能互补突变菌株Escherichia coli MG1655 ara＜＞HDS中缺失的HDS功能,使突变菌株恢复生长,证明AaHDS具有典型的HDS基因功能。结论 首次克隆获得黄花蒿HDS基因,为青蒿素的代谢工程研究提供相应的基础。