分化抑制因子ID1''基因酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活作用的检测

目的：构建酵母双杂交用分化抑制因子IDl’基因的诱饵载体，并检测其自激活作用。方法：PCR扩增ID1’，基因全长，酶切后与诱饵载体pHybLex/Zeo连接形成重组诱饵载体，电穿孔方法转化到酵母细胞EGY48中，β—半乳搪昔酶滤膜分析检测重组诱饵载体对报告基因LacZ的自激活情况。结果：扩增出IDl’基因全长，成功构建了重组诱饵载体pHybLex/Zeo—IDl’，经酶切和测序鉴定正确；重组诱饵载体无自发激活报告基因功能。结论：重组诱饵载体构建成功，对报告基因无自激活作用，为下一步cDNA文库筛选莫定了基础。     

人DOC-2氨基端PID结构域酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活鉴定

目的：获得人DOC-2氨基端磷酸酪氨酸作用结构域（PID）cDNA基因，构建酵母双杂交诱饵载体，并检测对报告基因的激活作用。方法：PCR扩增含人DOC-2编码区的全长cDNA片段，克隆入诱饵载体pGBKT7，再亚克隆得到含PID结构域的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-nDOC2。将重组质粒导入酵母菌AHl09，检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用。结果：成功构建人DOC-2氨基端磷酸酪氨酸作用结构域（PID）酵母双杂交诱饵载体，该段基因表达的蛋白对酵母菌AH109既无毒性，对报告基因也没有激活作用。结论：我们可利用构建的酵母双杂交诱饵载体来钓取人DOC-2氨基端PID结构域的相互作用蛋白，以利于对DOC-2基因功能进行研究。     

神经特异性转录因子DAT1酵母双杂交诱饵载体的构建

目的：用神经特异性转录因子DAT1构建酵母双杂交系统中的诱饵载体。方法：根据GenBank中提供的DATl序列设计引物，以小鼠脑组织cDNA文库为模板，PCR扩增DAT1，并与pLexA载体连接，测序鉴定。用醋酸锂法转化酵母菌EGY48，在选择性培养基上观察pLexA-DATl在EGY48中的表达。结果：PCR扩增出的DNA片段约490bp，大小正确，构建的融合表达载体pLexA-DAT1，测序结果表明序列完全正确，融合区域的读码框正确。转化了pLexA-DAT1的酵母菌EGY48在加有X-Gal的SD／Gal／Raf／-His／-Ura营养缺陷型诱导平板上菌落不变蓝，证明LexA-DAT1融合蛋白本身不具有激活p80p-LaeZ报告基因的能力，可以用作进一步的实验。结论：获得了在酵母细胞中正确表达且未自主激活报告基因的融合表达载体pLexA-DAT1，可作为酵母双杂交系统中的“诱饵”。     

酵母双杂交技术研究与内皮抑制素相互作用的蛋白质

目的：应用酵母双杂交技术研究与内皮抑制素(endostatin)发生相互作用的蛋白，有助于阐明其本身抑制血管生成作用的分子机制。方法：应用酵母双杂交系统3，以内皮抑制素为诱饵，筛选人肝cDNA文库，寻找能与之相互作用的蛋白。利用生物信息学技术，一对一酵母回复性杂交，β-GAL实验等提供的信息，筛除假阳性克隆。结果与结论：经过酵母双杂交共获得281个克隆，经过验证，有6个阳性克隆，这些蛋白基因有可能与内皮抑制素的作用过程有关。     

人肠三叶因子酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用鉴定

目的 构建人肠三叶因子酵母双杂交诱饵载体并验证其自激活作用.方法 以pET32a-hITF质粒为模板,PCR扩增hITF成熟肽cDNA片段,Sal I和EcpRV双酶切后连接到pENTR3c载体,通过λ噬菌体臂同源重组反应(LR重组反应)将hITF片段连接到酵母双杂交诱饵载体pDEST32,获得诱饵质粒pDEST32-hITF,测序后与酵母双杂交空质粒pDEST22共转化到酵母菌株Mav203,经营养缺陷培养基筛选后,观察在含不同浓度3-氨基三唑(3AT)的营养缺陷培养基中pDEST32-HITF的自激活作用.结果 成功克隆hITF基因片段,构建酵母双杂交诱饵质粒pDEST32-hITF,其与酵母双杂交空载体pDEST22共转化到酵母菌株Mav203后,可在3AT浓度为0、10、25mmol/L的营养缺陷培养基上生长,而在3AT浓度为50、75、100mmol/L的营养缺陷培养基上不能生长.结论 成功构建酵母双杂交诱饵载体,经验证50mmol/L及以上浓度的3AT营养缺陷培养基可以抑制其自激活作用.     

hPer1 bHLH-PAS结构域酵母双杂交系统的构建

目的构建hPer1 bHLH-PAS结构域的酵母双杂交系统,以寻找与hPer1相互作用的新蛋白.方法构建pGBKT7-hPer1 bHLH-PAS重组诱饵质粒及pGADT7-Rec-脑cDNA文库质粒;将两种质粒顺序转染至酵母细胞AH109中,进行营养缺陷筛选阳性克隆株.结果经酶切和基因测序鉴定,证实重组诱饵质粒pGBKT7-hPer1 bHLH-PAS构建成功.脑cDNA文库转化效率为1.2×106/3 μg pGADT7-Rec.结论酵母双杂交文库筛选得到24个阳性克隆.这为寻找脑组织中与hPer1相互作用的未知蛋白奠定了基础.     

大鼠肺泡巨噬细胞酵母双杂交cDNA文库的构建与筛选

目的构建脂多糖(LPS)和地塞米松(Dex)作用后的肺泡巨噬细胞(AMs)酵母双杂交cDNA文库,探寻炎症条件下与糖皮质激素受体(GR)相互作用的蛋白质分子。方法用LPS(10mg/ml)和Dex(10-5mol/L)作用于原代培养的肺泡巨噬细胞4h后,从肺泡巨噬细胞中提取总RNA,再以SMARTⅢTM和CDSⅢoligo(dT)为引物进行PCR扩增,得到两端具有同源臂的双链cDNA,后者纯化后,与线性质粒pGADT7-Rec共转化感受态酵母菌AH109,二者在酵母细胞中同源重组成环形的有复制活性的cDNA文库质粒,收集在缺亮氨酸(Leu)培养板上筛选出所有克隆,即为AMs酵母双杂交文库菌。进而通过诱饵质粒pGBKT7-GR转化构建成功的文库菌,筛选与GR相互作用的蛋白分子。结果构建了具有基因多样性和库容量足够大的AMscDNA文库,共获得1.07×106个转化子,插入的双链cDNA片段的长度在0.3~1.5kb之间。筛选文库获得1个真阳性克隆,经测序和同源性比较证实该克隆为BAG-1。结论利用ClontechSMART技术成功构建了肺泡巨噬细胞的酵母双杂交cDNA文库;GR与BAG-1在酵母细胞中存在着相互作用。     

人β防御素-3在人工关节感染患者中的表达及其意义的实验研究

目的观察人β防御素-3(human beta-defensin-3,HBD-3)在人工关节感染患者松质骨中的表达,探讨其意义。方法按临床诊断收集术中切取的假体周围的松质骨和正常髂骨,并分为以下4组:人工关节感染组13例,假体无菌性松动组8例,占位器治疗后组9例,正常组7例。采用HE染色观察炎性细胞浸润,免疫荧光染色观察阳性细胞数目及强度并采用Image-pro plus(IPP)7.0C软件测量平均光密度值。收集术前外周血白细胞计数、红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)、C-反应蛋白(C-reactive pro-tein,CRP)结果。分析比较各组间差别。结果 HE染色4组无明显差别,免疫荧光染色以人工关节感染组阳性细胞最多、阳性程度及平均光密度值最高,依次为假体无细菌性松动组,占位器后组及正常组。术前外周血白细胞计数、ESR和CRP感染组最高,其余3组无明显差别。结论 HBD3在人工关节感染及假体无菌性松动患者的假体周围组织和松质骨中存在高表达,且在感染与松动间存在差异。     

水蛭素12肽与低分子量尿激酶融合基因的构建和表达

目的：旨在获得既能抗栓又能溶栓的双功能蛋白，并在大肠杆菌中表达。方法：化学合成水蛭素１２肽基因编码序列，通过ＤＮＡ重组技术将水蛭素１２肽基因片段连接到低分子量尿激酶ｃＤＮＡ片段５′端，构建成融合基因，结果：构建了水蛭素１２肽与低分子量尿激酶的融合基因，在大肠杆菌中获得表达，重组融合蛋白具有溶栓与抗栓双功能。结论：运用ＤＮＡ重组技术可将两种不同功能的蛋白合理地融合在一起，使其具有溶纤活性和抗凝活性。     

重组人β-防御素3对铜绿假单胞菌生物膜结构影响的初步研究

目的研究重组人β-防御素3（rhBD-3）对铜绿假单胞菌（PA）形成生物膜的体外抑制作用。方法平板培养法培养PA,得到早期和成熟期生物膜;琼脂糖弥散抗菌法测定最低抑菌浓度（M IC）;扫描电镜（SEM）观察载体表面BF形态;连续稀释法行活菌计数。结果 rhBD-3对PA的M IC值是64μg/m l。rhBD-3作用后8、16、24 h,膜片载体表面PA活菌黏附量减少,且随着rhBD-3浓度的增高,活菌群数量进行性减少;SEM观察见rhBD-3组少量散在的游离细菌,有少量小斑片状多糖复合物,而空白对照组可见大量分布均匀的微菌落和游离细菌及多糖复合物交联。结论 rhBD-3可以抑制PA的BF形成,并对早期和成熟期BF具有破坏作用。     

人自噬相关基因LC3 B原核表达载体的构建及活性检测

目的：构建带GST标签的人LC3B基因原核表达载体,得到GST-LC3B重组质粒并纯化出GST-LC3B融合蛋白,体外检测并证实该蛋白的生物学活性。方法利用PCR技术从人乳腺文库中扩增出LC3B基因的编码序列,将该序列插入到pGEX-KG载体中,得到GST-LC3B重组质粒,转化大肠杆菌Rossate,经小量诱导后利用GST-Sepharose 4B亲和珠纯化GST-LC3B融合蛋白,通过SDS-PAGE电泳和Western印迹方法进行检测,GST pull-down技术证实其生物学活性。结果利用PCR技术从人乳腺文库中成功扩增得到大小约400 bp的目的基因片段,插入pGEX-KG载体中得到GST-LC3B质粒,经双酶切鉴定及测序结果表明重组质粒构建成功;转化Rossate菌并小量诱导,表达鉴定成功后纯化得到相对分子质量（ Mr）约为40×103的目的蛋白;GST pull-down技术检测出GST-LC3B融合蛋白可以和Atg4B蛋白在体外作用,具有较好的生物学活性。结论成功构建了人自噬相关基因LC3B的原核表达产物,为进一步研究LC3 B在自噬中的作用机制奠定了基础。