SARSN状病毒S蛋白S1区多肽与SARS病人血清的免疫反应

目的 测定根据计算机预测的SARS冠状病毒S蛋白S1区的抗原表位多肽与SARS病人血清的免疫反应．以寻找和确定SARS相关冠状病毒的中和抗原表位。方法 采用多肽合成仪合成SARS冠状病毒S蛋白S1区的多肽．并用ELISA方法检测合成的多肽与SARS病人血清的免疫反应。结果 合成的8个多肽与SARS病人血清免疫反应的光密度值是其与正常人血清免疫反应的光密度值的1．5～2．6倍。结论 合成的多肽与SARS病人血清的免疫反应较低，提示这些多肽是否为SARS冠状病毒的抗原表位还要进一步研究。     

SARS冠状病毒S蛋白抗原表位串联基因的设计和表达

目的:表达严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒S蛋白的抗原表位序列,为研制新型的SARS病毒疫苗提供新思路。方法:应用生物信息学分析软件分析SARS冠状病毒S蛋白的抗原表位序列,设计全新的抗原表位编码基因序列,构建表达载体并在大肠杆菌中表达该基因。结果:设计并合成了SARS冠状病毒S蛋白的抗原表位序列的新基因序列,在大肠杆菌中实现了该基因的高表达。结论:可以重新设计新基因产生新型候选重组疫苗。     

应用合成的SARS病毒S蛋白重叠肽筛选B细胞表位

目的筛选SARS病毒S蛋白的B细胞表位。方法使用SARS-CoV S DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,获得SARS病毒S蛋白的免疫血清。人工合成包含169条部分氨基酸序列重叠的SARS-CoV S蛋白的多肽库。将多肽片段包被ELISA板,利用免疫小鼠血清,通过抗体结合试验来筛选SARS病毒S蛋白的线性B细胞表位。并将筛选结果与使用B细胞表位分析软件预测的结果进行比较。结果使用重叠肽合成法筛选到SARS-CoV蛋白两条多肽片段S335-352和S442-458,能与免疫动物血清特异性结合,与使用Bcipep数据库预测B细胞表位的结果相一致。结论鉴定了两个新的SARS病毒S蛋白B细胞表位。     

SARS冠状病毒M蛋白B细胞抗原表位的原核表达与抗原活性检测

目的从SARS冠状病毒M蛋白的线性重叠肽链文库中筛选出5个B细胞抗原表位,通过构建原核表达载体,表达抗原表位融合蛋白,并检测其抗原活性.方法应用大肠杆菌高频密码子设计引物,通过PCR方法合成编码SARS冠状病毒M蛋白5个抗原表位(MKY1、MKY2、MKY3、MKY4和MKY5)的DNA片段,经克隆和测序分析,亚克隆至表达载体pET-CKS,转化大肠杆菌BL21;阳性菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE分析;大量诱导表达抗原表位融合蛋白,亲和层析予以纯化;Western检测SARS病人阳性血清对融合蛋白的识别.结果成功构建SARS冠状病毒M蛋白抗原表位的表达载体,在大肠杆菌BL21中表达,融合蛋白表达量达到细菌总蛋白30%,经亲和层析纯化,融合蛋白可被SARS病人抗血清识别.结论原核表达的抗原表位融合蛋白具有良好的抗原活性,为下一步进行SARS冠状病毒诊断试剂盒的开发研究奠定基础.     

SARS冠状病毒S蛋白RBD片段抗原多肽的合成及其多克隆抗体制备

目的研究SARS冠状病毒spike蛋白的抗原优势表位,合成多肽免疫小鼠获得多克隆抗体。方法通过固相Fmoc法合成spike蛋白三条多肽CQ19、LV11、TY14,与KLH肽链结合,免疫小鼠。结果固相多肽合成法合成KLH-CQ19、KLH-LV11和KLH-TY14三条多肽,用KLH-CQ19多肽片段免疫小鼠获得多克隆抗体。结论 KLH-CQ19片段免疫小鼠获得有效多克隆抗体,为SARS的抗体后续研究提供了物质基础。     

抗SARS冠状病毒S1蛋白N端249至667的单克隆抗体的制备与鉴定

目的在获得了具有免疫原性的SARS冠状病毒S1蛋白片段的基础上,制备和鉴定特异性抗该段S1蛋白单克隆抗体(mAb)。方法原核表达含S蛋白受体结合区的SARS冠状病毒S1蛋白片段S1c(N端249-667氨基酸残基),其免疫原性经SARS病人恢复期血清鉴定后免疫BALB/c小鼠,按常规方法制备单克隆抗体,并采用ELISA间接法、免疫荧光和免疫印迹进行筛选和鉴定。结果筛选出3株特异性针对SARS冠状病毒S1蛋白N端249-667的mAb杂交瘤细胞株,IgG亚类鉴定1株为IgG1,2株为IgG2a,经免疫荧光鉴定与人冠状病毒株229E和OC43无交叉反应。结论获得3株抗SARS冠状病毒S蛋白受体结合区特异性单克隆抗体,为建立新的SARS冠状病毒检测方法的和进一步研究S蛋白的功能奠定了基础。     

SARS冠状病毒S2基因变异性分析

目的 测定SARS冠状病毒GD322株S2基因序列并对SARS-CoVS2基因进行系统进化树分析。方法用RT-PCR法从SARS-CoV GD322株基因组中扩增S2基因片段并克隆至pGEM—T载体,转化大肠杆菌DH5a株后测序。利用Lasergene、ClustalX、DNAman和Treeview等软件,将基因序列翻译成氨基酸序列后,与早、中、晚期各地暴发的SARS-CoVS2蛋白序列进行比对,构建系统进化树,并在Internet网数据库中对S2蛋白氨基酸序列进行T细胞抗原表位预测。结果随着SARS-CoV的传播流行,S2基因趋于稳定,晚期的SARS-CoVS2基因的同源性达到99．9％。T细胞抗原表位预测发现。SARS-CoVS2蛋白第57位氨基酸突变对T细胞抗原表位有影响。结论SARS流行过程中SARS-CoVS2基因较为稳定,S2蛋白57位氨基酸的突变可影响病毒T细胞抗原表位。     

抗SARS冠状病毒S1蛋白N端249至667的单克隆抗体的制备与鉴定

目的 在获得了具有免疫原性的SARS冠状病毒S1蛋白片段的基础上，制备和鉴定特异性抗该段S1蛋白单克隆抗体(mAb)。方法 原核表达含S蛋白受体结合区的SARS冠状病毒S1蛋白片段Slc(N端249-667氨基酸残基)，其免疫原性经SARS病人恢复期血清鉴定后免疫BALB／c小鼠，按常规方法制备单克隆抗体，并采用ELISA间接法、免疫荧光和免疫印迹进行筛选和鉴定。结果 筛选出3株特异性针对SARS冠状病毒S1蛋白N端249-667的mAb杂交瘤细胞株，IgG亚类鉴定1株为IgG1，2株为IgG2a，经免疫荧光鉴定与人冠状病毒株229E和OC43无交叉反应。结论 获得3株抗SARS冠状病毒S蛋白受体结合区特异性单克隆抗体。为建立新的SARS冠状病毒检测方法的和进一步研究S蛋白的功能奠定了基础。     

SARS冠状病毒M蛋白二级结构和B细胞抗原表位的稳定性分析

目的预测具有代表性的3株SARS冠状病毒M蛋白二级结构和B细胞抗原表位,探讨基因变异对M蛋白二级结构和B细胞抗原表位的影响。方法采用Chou-Fasman方法、Garnier-Robson方法和Karplus-Schulz方法预测SARS冠状病毒M蛋白二级结构;按Kyte-Doolittle方案、Emini方案和Jameson-Wolf方案预测B细胞抗原表位。结果3株SARS冠状病毒M蛋白的二级结构和B细胞抗原表位完全一致。结论SARS冠状病毒M蛋白的二级结构和抗原表位比较稳定,提示利用某一毒株的M蛋白制备单克隆抗体和疫苗可应用于SARS的诊断和防治。     

SARS病毒S蛋白的B细胞表位预测

目的预测SARS病毒S蛋白的B细胞表位.方法基于SARS 蛋白基因组序列,采用Kyte-Doolittle的亲水性方案,Emini方案和Jameson-Wolf抗原指数方案,辅以对S蛋白的二级结构中的柔性区域的分析,预测SARS病毒S蛋白的B细胞表位.结果推测最有可能的B细胞表位位于S蛋白N端第91～98区段、第1 121～1 153区段和第185～193区段内或它们的附近.其它,如S蛋白N端第1 050～1 059、752～765、41～50、666～674、264～287、340～348、408～416区段和第424～439区段内或附近也可能存在B细胞表位.结论用多参数预测SARS病毒S蛋白的B细胞表位,为分子免疫学的深入研究提供线索.     

Immunological reaction between the peptides from S1 domain of SARS coronavirus S-protein and the serum from SARS patients]

OBJECTIVE: To examine the immunological reactions between the peptides of SARS coronavirus (SARS-Cov) S-protein and the serum of SARS patients for identifying the SARS-Cov epitope. METHODS: The peptides from S1 domain of SARS-Cov S-protein were synthesized by peptide synthesizer, and the immunological reaction of the peptides with the serum of SARS patients were examined by means of ELISA. RESULTS: The optical density value of the immunological reaction of synthesized 8 peptides with SARS patient serum was 1.5-2.6 times higher than that with normal serum. CONCLUSION: The 8 peptides from S1 domain of S protein appear to have low immunogenicity to the serum of SARS patients, indicating that these peptides may not be the epitope of the SARS-Cov.     

SARS病毒S蛋白的原核表达与DNA疫苗的构建

目的 探讨SARS冠状病毒的刺突(spike,S)蛋白的免疫学特性,以及S蛋白作为SARS-CoV病毒疫苗组分的可行性。方法 将S蛋白基因分段克隆入原核表达载体pET-15b,并在大肠杆菌中表达,经过亲和层析得到纯化的重组蛋白rS_a和rS_b;将全长S基因克隆入真核分泌表达载体pSecTagB,得到重组DNA疫苗pSecS,免疫小鼠,得到SAS-CoVS蛋白抗血清。然后用纯化的重组蛋白rS_a和rS_b建立的SARS-CoVS抗体ELISA检测技术研究所构建的S-DNA疫苗的免疫效果。结果 分段的重组蛋白rS_a和rS_b在大肠杆菌中均以可溶性形式得到高效表达,并能与SARS确诊病人血清以及pSecS免疫鼠血清发生特异性抗原抗体反应,原核表达的重组分段S蛋白具有SARS-CoVS蛋白相似的抗原性。结论 原核表达的两段重组S蛋白有可能作为抗原组分用于临床SARS-CoV检测中;所构建的SARS-CoV的S基因核酸疫苗能在小鼠体内产生特异性抗体,这为进一步SARSDNA疫苗的研制提供一定的借鉴作用。     

SARS病毒S蛋白的原核表达与DNA疫苗的构建

目的探讨SARS冠状病毒的刺突(spike，S)蛋白的免疫学特性，以及S蛋白作为SARS—CoV病毒疫苗组分的可行性。方法将S蛋白基因分段克隆入原核表达载体pET—15b，并在大肠杆菌中表达，经过亲和层析得到纯化的重组蛋白rSa和rSb；将全长S基因克隆入真核分泌表达载体pSecTagB，得到重组DNA疫苗pSecS，免疫小鼠，得到SAS—CoV S蛋白抗血清。然后用纯化的重组蛋白rSa和rSb建立的SARS—CoV S抗体ELISA检测技术研究所构建的S-DNA疫苗的免疫效果。结果分段的重组蛋白rSa和rSb在大肠杆菌中均以可溶性形式得到高效表达，并能与SARS确诊病人血清以及pSecS免疫鼠血清发生特异性抗原抗体反应，原核表达的重组分段S蛋白具有SARS—CoV S蛋白相似的抗原性。结论原核表达的两段重组S蛋白有可能作为抗原组分用于临床SARS—CoV检测中；所构建的SARS—CoV的S基因核酸疫苗能在小鼠体内产生特异性抗体，这为进一步SARS DNA疫苗的研制提供一定的借鉴作用。     

严重急性呼吸综合征(SARS)临床排除病例与SARS病例心肌酶谱和体液免疫结果分析

目的 :分析 SARS临床排除病例与 SARS病例心肌酶谱和体液免疫的特征 ,为严重急性呼吸综合征( SARS)临床排除病例与 SARS病例的鉴别诊断提供依据。方法 :采用 ( IFCC)推荐方法、速率散射免疫比浊法和间接酶联免疫吸附实验 ( EL ISA)、双抗原夹心 EL ISA分别检测 18例 SARS临床排除病例和 4 5例 SARS病例入院第 2天血清天冬氨酸转氨酶 ( AST)、乳酸脱氢酶 ( L DH)、肌酸激酶 ( CK)、肌酸激酶同工酶 ( CK- MB)、羟丁酸脱氢酶 ( HBDH) ,血清免疫球蛋白 Ig G、Ig M、Ig A ,补体 C3、C4、C反应蛋白 ( CRP)的含量 ,以及血清抗 SARS病毒特异性抗体。结果 :SARS临床排除病例组 AST活力显著低于 SARS病例组 ( P<0 .0 5 ) ,L DH、HBDH活力也显著低于 SARS病例组 ( P<0 .0 1) ,CK、CK- MB活力与 SARS病例组无显著差别 ( P>0 .0 5 )。 SARS临床排除病例组 CRP含量显著低于 SARS病例组 ( P<0 .0 5 ) ,血清免疫球蛋白 Ig G、Ig M、Ig A,补体 C3、C4含量与 SARS病例组差异不显著 ( P>0 .0 5 )。间接 EL ISA检测 SARS临床排除病例特异性抗体 Ig G和 Ig M均为阴性 ,SARS病例组特异性抗体 Ig G阳性 32例 ,Ig M阳性 19例 ,累计阳性 34例 ;双抗原夹心 EL ISA检测 SARS临床排除病例特异性抗体阳性 1例 ;SARS病例组特异性抗体阳     

MART-1特异性治疗性多肽诱导CD8+ T细胞应答的研究

目的探讨基于黑色素瘤特异性抗原MART-127-35表位的治疗性多肽抗原组分、结构,及诱导抗原特异性CD8+ T细胞应答的关系.方法用蛋白质分子设计技术,设计基于黑色素瘤特异性抗原MART-127-35表位、HIV Tat49-57CCP序列及破伤风类毒素通用Th表位的治疗性多肽候选分子,经Merrifield固相多肽合成技术合成,HPLC纯化、鉴定.以黑色素瘤病人PBMC为实验对象,对其诱导T细胞增殖、Th1极化、抗原特异性CD8+ CTL效应进行研究.结果所设计治疗性多肽分子可在体外诱导Th1极化和抗原特异性CD8+T细胞应答,含Th、CTL表位的双表位肽抗原略优于单纯CTL表位肽,含Th、CTL表位和HIV Tat49-57CCP序列的肽抗原效应显著优于前二者(P<0.05).结论提示基于黑色素瘤特异性抗原优势CTL表位、HIV Tat49-57CCP序列及破伤风类毒素通用Th表位的治疗性多肽设计可显著提高肿瘤治疗性小分子肽的免疫原性.     

重组SARS-CoV刺突蛋白基因片段的原核表达及纯化

目的:冠状病毒(SARS-CoV)的刺突蛋白(spike glycoprotein,S蛋白)是病毒的主要结构蛋白之一,也是重要的病毒抗原,重组S蛋白的表达可用于检测病毒感染后血清抗体.方法:根据抗原性预测分析结果,将S蛋白中抗原决定簇的编码基因重新拼接成两个新的基因,通过全基因合成方式直接合成至原核表达载体pET32a( ),转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达,Ni-NTA试剂盒纯化目的蛋白.结果:SDS-PAGE证实重组S蛋白的表达,并被纯化.结论:重组刺突蛋白的表达及纯化,可做为检测SARS-CoV抗体的抗原,有助于进一步开展SARS-CoV相关研究.     

SARS病毒S1蛋白N端片段在大肠杆菌中的表达、纯化与鉴定

目的:获得纯化的重组SARS病毒S1蛋白N端部分,研究其与机体产生针对SARS病毒免疫应答的规律和机制.方法:将编码SARS病毒S1蛋白N端334个氨基酸残基的基因进行克隆,并在原核表达系统中表达,获得了纯化的重组蛋白.利用SARS患者恢复期已知的SARS抗体阳性血清,鉴定纯化的重组S1蛋白片段.结果:克隆表达的重组蛋白基因序列与公布的SARS病毒S1蛋白N端的基因序列相同,所表达的重组蛋白相对分子质量约为64 000.3份SARS患者恢复期的血清均与重组蛋白反应,在相对分子质量64 000处形成特异性的反应条带,而来自SARS流行前的正常人对照血清则不能与重组蛋白反应.结论:获得的重组蛋白与SARS病毒抗体呈现特异性的反应,为进一步研究SARS病毒感染免疫应答机制和制备SARS病毒的重组疫苗奠定基础.     

SARS冠状病毒N蛋白在免疫荧光诊断技术中的应用

目的 应用基因工程技术,在昆虫细胞中表达SARS—CoV N基因,产生无感染性的核蛋白,作为诊断抗原,用于检测血清中SAILS特异性抗体。方法 从一例输入性SARS病人血清中提取病毒RNA,通过RT-PCR方法扩增SAILS—CoV N基因,将它插入昆虫杆状病毒,构建重组昆虫杆状病毒,转染sf 9昆虫细胞,经丙酮固定,制成SARS特异性诊断抗原,建立检测病人血清抗SARS-CoV抗体的免疫荧光试验(immunofluorescence assay,IFA)。结果 此抗原仅与SARS阳性病人血清起反应,而与正常人及其他发热病人血清不起反应。经双盲试验,与空斑减少中和试验(plaque reduction neutralization test,PRNT)阳性的2003年SAILS病人血清的符合率为97．8％;检测2004年广东新发4例SAILS病人进展期血清均阳性,发病后第6天即可检出抗体1：40阳性,至第9天,升至1：640.结论 此法用于检测病人血清中SARS抗体,具有特异性强、敏感性高,试剂制备简单、安全,不需P3实验室,为诊断与研究SAILS提供新的途径和手段。