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1.
人趋化因子ELC的克隆与表达 总被引:1,自引:0,他引:1
目的克隆人趋化因子ELC基因,表达并初步纯化ELC融合蛋白.方法从扁桃体中提取总RNA,再进行RT-PCR,扩增ELC成熟蛋白基因,并在5′和3′分别添加NcoⅠ和EcoRⅠ酶切位点,通过这两个酶切位点重组于pET32a( )载体上,转化E.coli DH5α,筛选阳性克隆,酶切鉴定,DNA测序检测插入序列的正确性,缺失突变获得ELC天然蛋白表达载体pET32a( )/ELC,SDS-PAGE分析其表达,Western blot验证融合蛋白.大量表达并初步纯化ELC融合蛋白.结果成功克隆了ELC基因,表达并初步纯化得到ELC融合蛋白.结论构建的ELC硫氧还蛋白融合表达载体以可溶性蛋白的方式表达ELC硫氧还蛋白. 相似文献
2.
目的:制备纯化的新型血管生长抑制剂可溶性嵌合蛋白VEGI ,为进一步研究其活性奠定基础.方法:应用PCR方法制备血管内皮细胞生长抑制因子(VEGI)与寡肽CTTHWGFTLC相嵌合的融合基因VEGI ,将PCR产物克隆至pGEM-T载体中,经酶切及测序鉴定后,与原核表达载体pET30a( )重组,构建重组表达载体pET30a-VEGI ,转化大肠杆菌BL21并诱导表达,纯化并鉴定表达产物.结果:成功扩增融合基因VEGI ,构建的重组质粒pET30a-VEGI 酶切鉴定结果与预期一致,诱导后表达产物以包涵体为主.SDS-PAGE电泳及Western印迹结果表明,复性纯化后的嵌合蛋白VEGI 相对分子质量约为23 000,纯度约为90%.结论:成功构建了重组表达载体,并在大肠杆菌诱导表达,亲和层析纯化后获得纯度较高的可溶性嵌合蛋白VEGI . 相似文献
3.
目的构建趋化因子SLC(secondary lymphoid-tissue chemokine)的硫氧还蛋白融合表达载体并表达融合蛋白.方法从人扁桃体中提取总RNA,再进行RT-PCR,扩增SLC成熟蛋白基因,并在5'和3'分别添加Nco Ⅰ和EcoRⅠ酶切位点,通过这两个酶切位点重组于pET32a( )载体上,转化E.coli DH5α,筛选阳性克隆,酶切鉴定,DNA测序检测插入序列的正确性,经突变删除因Nco Ⅰ位点引入而在肠激酶位点和目的基因间多余的3个氨基酸,DNA再测序检测突变结果,SDS-PAGE分析其表达,并通过金属离子亲和层析、除盐、弱阳离子交换层析,得到纯化的融合蛋白,Western blot验证纯化的融合蛋白.结果成功构建了SLC天然蛋白的硫氧还蛋白融合表达载体,表达并纯化出融合蛋白,Western blot证明该融合蛋白能与羊抗人SLC一抗结合.结论构建的天然SLC硫氧还蛋白融合表达载体以可溶性蛋白的方式稳定表达SLC硫氧还蛋白,并对融合蛋白进行了初步纯化. 相似文献
4.
hVEGF165和嵌合水蛭肽融合基因的真核表达载体的构建及其表达 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:克隆hVEGF165和嵌合水蛭肽(fused hirudin,FH)融合基因,构建hVEGF165-FH/pcDNA3.0基因表达载体,并在人内皮细胞株中表达.方法:分别通过PCR法扩增hVEGF165和引物退火法合成FH基因,将融合基因插入表达载体pcDNA3.0,构建重组质粒hVEGF165-FH/pcDNA3.0.对重组质粒进行酶切鉴定和测序分析,将正确克隆的质粒分别作体外快速转录翻译鉴定,以及经脂质体介导转染人内皮细胞株,并对表达产物进行鉴定.结果:hVEGF165和FH成功融合,形成711 bp的目的片段,并成功构建重组质粒hVEGF165-FH/pcDNA3.0,重组质粒转染人内皮细胞株有hVEGF165-FH表达.结论:重组质粒hVEGF165-FH/pcDNA3.0在人内皮细胞株中得到表达,为其融合蛋白活性研究及基因治疗打下良好基础. 相似文献
5.
目的 利用硫氧还蛋白融合表达系统表达小鼠内皮抑素(endostatin).方法 采用PCR技术从pMFGendo质粒上扩增出小鼠endostatin完整的cDNA序列,将其克隆至硫氧还蛋白融合表达载体pThiohisA中,转化大肠杆菌BL21,经IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导表达重组融合蛋白,SDS-PAGE分析表达产物为包涵体,将包涵体纯化后通过镍柱亲和层析得到纯化的、可溶性的小鼠内皮抑素,经SDS-PAGE分析鉴定.结果 高效表达出相对分子量约32KD的重组融合蛋白,灰度扫描软件分析显示,其表达量占菌体总蛋白质的35.9%,经镍柱亲和层析获得了高纯度的小鼠内皮抑素重组融合蛋白,纯度可达95%,得率为0.27g/L.结论 用硫氧还蛋白融合表达系统在大肠杆菌中表达的小鼠内皮抑素重组融合蛋白易纯化并具有高活性. 相似文献
6.
重组结核分枝杆菌ESAT6-PPE68融合蛋白的制备 总被引:2,自引:0,他引:2
目的 构建结核分支杆菌esat6-ppe68融合基因及其原核表达载体,在大肠杆菌中表达融合蛋白ESAT6-PPE68.方法 用基因拼接(GeneSOEing)法扩增esat6-ppe68融合基因,并将其定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建原核表达重组质粒pGesat6-ppe68.重组子经限制性内切酶分析、聚合酶链式反应及测序鉴定后转化宿主菌大肠杆菌BL21,IPTG(异丙基-β-D硫代半乳糖苷)诱导表达约69 000带谷胱苷肽硫转移酶蛋白(GST)标签的正SAT6-PPE68融合蛋白,经谷胱苷肽-硫-转移酶融合蛋白纯化试剂盒得到纯化的融合蛋白,产物进行SDS-PAGE电泳、Western-blotting鉴定.结果 重组质粒pGesat6-ppe68中目的基因测序结果与报道序列完全相同;在大肠杆菌中以可溶性非包涵体形式表达;表达量约占菌体总蛋白的40%,表达蛋白纯化后获得纯度为90%左右的重组蛋白;Westernblotting结果证实重组蛋白与确诊的结核病患者血清发生特异免疫反应.结论 成功构建了原核表达载体pGesat6-ppe68,获得了rESAT6-PPE68融合蛋白,为rESAT6-PPE68融合蛋白在结核病诊断中的应用奠定了基础. 相似文献
7.
目的:探讨乙醇促进结核分枝杆菌Mr 38000蛋白的可溶性表达,并获得可溶性的Mr 38000重组蛋白.方法:采用聚合酶链反应(PCR)从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Mr 38000蛋白的编码基因,用限制性内切酶消化后插入载体pGEx-4T-2中,将重组质粒转化大肠杆菌BL21。在乙醇添加剂存在下,经IPTG诱导,表达GST-38融合蛋白;聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)分析融合蛋白的相对分子质量及表达形式,免疫印迹法鉴定融合蛋白的活性.结果:经PCR扩增后证实为Mr 38000蛋白的基因,成功构建了具有正确基因序列的重组表达载体,在大肠杆菌BL21中诱导表达融合蛋白约占菌体总蛋白的18%.在乙醇存在下,可溶性目的蛋白的表达量约是无乙醇时的5倍.结论:在原核表达中乙醇作为一种添加剂可以促进结核分枝杆菌Mr 38000蛋白在大肠杆菌BL21中的可溶性表达. 相似文献
8.
胃癌相关基因GCRG213的克隆及其在大肠杆菌中的表达 总被引:1,自引:1,他引:0
目的:利用硫氧还蛋白融合表达系统表达胃癌相关基因GCRG213。方法:采用PCR技术从pGEM-T质粒上扩增出含完整ORF的GCRG213 cDNA序列,将其克隆至硫氧还蛋白融合表达载体pET102/D-TOPO中,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达重组融合蛋白,SDS-PAGE分析表达产物。结果:高效表达出相对分子量约29.4ku的重组融合蛋白。薄层凝胶扫描显示,其表达量占菌体总蛋白质的28.7%。结论:在大肠杆菌中成功表达了Thioredoxin-GCRG213融合蛋白,为后续功能研究、蛋白制备及其抗体研制奠定了基础。 相似文献
9.
目的:将硫氧还蛋白融合表达系统表达的小鼠内皮抑素(endostatin)进行纯化并对其生物学活性进行测定.方法: 将含有pThioHis-endo重组质粒转化大肠杆菌BL21,经IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导表达重组融合蛋白,SDS-PAGE分析表达产物为包涵体,将包涵体纯化后通过镍柱亲和层析得到纯化的、可溶性的小鼠内皮抑素,经SDS-PAGE分析鉴定.将纯化的蛋白质通过鸡胚尿囊膜血管生成抑制实验和内皮细胞抑制实验对纯化的蛋白质进行生物学活性测定.结果:经SDS-PAGE电泳分析获得了高纯度的小鼠内皮抑素重组融合蛋白,纯度可达95%,得率为0.27 g/L.纯化的重组蛋白在体外能抑制鸡胚囊膜血管生成及具有抑制血管内皮细胞增殖的活性,加入重组蛋白内皮抑素5 μg组与10 μg组血管生成抑制率分别为(22.3±2.0)%和(47.1±4.0)%,P<0.05,和对照组经过方差分析,差异都有显著性意义;内皮细胞抑制实验可见不同剂量重组蛋白内皮抑素对内皮细胞的生长具有抑制作用[抑制率分别为(49.6±4.1)%,(53.2±2.3)%,(55.0±3.6)%,(67.1±5.7)%],经过方差分析和相关性分析,具有剂量依赖效应(r=0.984,P<0.05).结论: 用硫氧还蛋白融合表达系统在大肠杆菌中表达的小鼠内皮抑素重组融合蛋白易纯化并具有高活性. 相似文献
10.
目的构建人晚期糖基化终产物受体胞质内段(hRAGE-C)GST融合蛋白的重组原核基因表达载体并进行表达与纯化,研究其功能并鉴定与其相互作用的蛋白。方法采用PCR方法扩增hRAGE基因编码区的胞质内段,并将其重组于pGEX-KG载体中。重组质粒经PCR、酶切、序列鉴定分析后,转化大肠杆菌BL21,以异丙基β-D硫代半乳糖(IPTG)诱导产生hRAGE胞质内段的GST融合蛋白。结果PCR、酶切和测序结果表明所克隆的GST/hRAGE-C原核表达载体完全正确,继而表达、纯化获得了相对分子质量约35 000的融合蛋白(符合预期大小)。结论将hRAGE胞质内段构建于含有GST标记的载体上并获得融合蛋白的高效表达。 相似文献
11.
目的:构建真核膜蛋白ω‐3脂肪酸去饱和酶Fat‐1基因在大肠埃希菌中的高效表达质粒。方法利用分子克隆技术构建携带Fat‐1基因的重组原核表达质粒pET32a‐Fat‐1和插入膜蛋白表达分子伴侣Mistic基因的pET32a‐Mistic‐Fat‐1;将两种重组质粒转化大肠埃希菌株BL21(DE3),IPTG诱导表达Fat‐1蛋白和M110‐Fat‐1蛋白,通过十二烷基‐聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS‐PAGE)灰度分析其表达量,蛋白免疫印迹法(Western blot)进一步鉴定蛋白表达。结果经酶切鉴定和测序证实成功构建了pET32a‐Fat‐1和pET32a‐Mistic‐Fat‐1原核表达载体;SDS‐PAGE和Western blot证实ω‐3脂肪酸去饱和酶Fat‐1在原核表达系统中没有明显诱导表达,而M 110‐Fat‐1融合蛋白在大肠埃希菌中获得了高效表达,占全细胞蛋白总量的15%。结论ω‐3脂肪酸去饱和酶Fat‐1基因与Mistic基因融合表达,实现了在原核宿主中高效表达真核膜整合蛋白ω‐3脂肪酸去饱和酶Fat‐1。 相似文献
12.
血管内皮细胞生长因子在哺乳动物细胞的表达 总被引:4,自引:2,他引:2
目的:本实验试图构建具有生物学活性的VEGF真核表达载体,为VEGF基因治疗提供载体。方法:将已获得的hVEGF165 cDNA克隆到GST融合表达载体,构建原核表达质粒,转染大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达,Western blot鉴定表达产物。在此基础上构建真核表达载体pcDNA3 /hVEGF165,脂质体介导转染CHO-K1细胞,G-418筛选,Northern blot,West-ern blot分别检测其在细胞内的转录和表达情况,3H-TdR掺入法检测表达蛋白的活性。结果:实验组的Northern blot和Western blot出现特异性条带,而对照组在相应部位未出现条带。实验组的大鼠心肌血管内皮细胞3H-TdR掺入率明显高于对照组(P< 0.001)。结论:本实验所构建的VEGF真核表达质粒能够在真核细胞内获得表达,其表达产物具有血管内皮细胞增殖刺激活性。 相似文献
13.
HPV16 E7蛋白编码基因原核表达与鉴定 总被引:2,自引:1,他引:1
目的研究HPV16E7蛋白的生物学特性及其细胞转化机制,对HPV16E7蛋白原核表达质粒进行构建、表达和鉴定。方法以临床确诊的HPV16感染患者子宫颈细胞DNA为模板,采用PCR方法扩增HPV16E7基因,经BamH Ⅰ和Hind Ⅱ双酶切后插入相同酶切pET32a(+)载体,转化JM109感受态细胞,并进行阳性克隆筛选。经IPTG对重组质粒进行蛋白诱导表达,SDS—PAGE和Western blot检测目标蛋白表达情况。结果成功构建了原核表达质粒pET32/E7,HPV16E7-TRX融合蛋白在BL21(DE3)菌株中高效表达,在1mmol/L IPTG、30℃诱导条件下融合蛋白表达量占菌体总蛋白的30%左右。结论pET32/E7原核表达质粒的构建、HPV16E7融合蛋白的表达为进一步深入研究HPV16E7蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用机制奠定了基础。 相似文献
14.
目的:分别克隆小鼠白介素17受体A胞外段(mIL-17RAaa32-322)及小鼠IgG2AFc(mIgG2AFc)基因,构建mIL-17RAaa32-322-mIgG2AFc融合蛋白原核表达载体,并在体外表达、纯化及鉴定。方法:利用基因重组技术构建pET32a(+)-mIL-17RAaa32-322-mIgG2AFc原核表达载体,并在E.coli Rosetta中表达mIL-17RAaa32-322-mIgG2AFc融合蛋白,经镍离子螯合层析分离纯化后,用SDS-PAGE电泳和蛋白质印迹法进行鉴定。结果:成功构建pET32a(+)-mIL-17RAaa32-322-mIgG2AFc原核表达载体,获得高效表达的融合蛋白,且蛋白质印迹证实为目的蛋白。结论:获得mIL-17RAaa32-322-mIgG2AFc融合蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定基础。 相似文献
15.
幽门螺杆菌尿素膜通道基因的克隆和表达 总被引:1,自引:0,他引:1
目的 克隆幽门螺杆菌(Hp)尿素膜通道基因(ureI)和构建能表达UreI蛋白的原核表达工程菌,并初步研究产物的表达特性和免疫特性.方法 用PCR方法从Hp基因组中克隆ureI基因,构建原核表达重组质粒pET32a/ureI,双酶切和测序鉴定正确后,重组质粒转染大肠杆菌BL21 (DE3),构建高效表达UreI的工程菌BL21 /UreI.不同温度条件下用1.0 mmol/LIPTG诱导重组蛋白表达,用SDS-PAGE和Gel-Pro Analyzer 4分析重组蛋白的表达,并用Western blotting对其免疫原性进行分析.结果 克隆到约650 bp的基因片段,测序结果与GENBANK中对应菌株的ureI序列100%同源,与其他Hp的序列同源性不低于98.5%.工程菌BL21 /UreI含完整的ureI基因.在37℃、1.0 mmo1/LIPTG诱导14 h后,重组蛋白表达量可达菌体总蛋白的20.2%.分析表明重组蛋白主要以包涵体形式表达,经免疫印迹证实该重组蛋白有一定的免疫反应性和特异性.结论 成功构建了Hp ureI基因的原核表达载体,该载体可高表达有免疫特性的重组蛋白,为进一步研究Hp在胃的定植机制和抗Hp新药奠定了基础. 相似文献
16.
目的研究HPV16 E5蛋白的生物学特性及其细胞转化机制,对HPV16 E5蛋白原核和真核表达质粒进行构建、表达和鉴定。方法以临床确诊的HPVl6感染患者子宫颈细胞DNA为模板,采用PCR方法扩增HPV16 E5基因,经BamHⅠ和HindIⅡ双酶切后插入相同酶切的pET32a(+)载体,转染JMl09感受态细胞,并进行阳性克隆筛选。经IPTG对重组质粒进行蛋白诱导表达,SDS-PAGE和Wlescem blotting检测目标蛋白表达情况。将BamHⅠ和XhoⅠ双酶切pET32(+),E5质粒后取得的E5全基因片段转入pcDNA3.1(+)空质粒,构建pcDNA3.1(+)m5真核表达质粒并对NIH3T3细胞进行转染,最后用G418进行稳定表达株的筛选,并采用RT.PCR鉴定细胞内HPV16 E5基因表达情况。结果成功构建了原核表达质粒pET32/E5,在1mmol/LPTG、28℃诱导条件下BL21(DE3)菌体中HPVl6E5.TRX融合蛋白占菌体总蛋白的10%左右。真核表达质粒pcDNA3.1(+)/E5在成功转染NIH3T3细胞后于250μg/mlG418浓度时筛选21d得到了E5基因稳定表达株,RT-PCR产物测序得到了HPV16 E5基因全序列。结论成功构建了pET32/E5原核和pcDNA3.1(+)/E5真核表达质粒,HPV16 E5蛋白在大肠杆菌和NIH3T3细胞中的稳定表达.这些结果为进一步深入研究HPV16 E5蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用奠定了坚实基础。 相似文献
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表达人幽门螺杆菌外膜蛋白的穿梭质粒的构建及在耻垢分枝杆菌中的表达 总被引:2,自引:0,他引:2
目的建立表达人幽门螺杆菌外膜蛋白重组耻垢分枝杆菌疫苗株,为进一步应用重组耻垢分枝杆菌疫苗防治幽门螺杆菌感染打下基础。方法利用聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)扩增的幽门螺杆菌的外膜蛋白528编码基因全长片段,克隆入pET32a(+),鉴定无误后,再亚克隆入大肠杆菌一分枝杆菌穿梭质粒pLA71,构建pLA71-omp载体,将pLA71-omp电转化耻垢分枝杆菌,经卡那霉素筛选后,抽提质粒用PCR法鉴定,Westernblot检测omp的表达及活性。结果从幽门螺杆菌基因组中扩增出约528bp的基因片段。所构建重组体阳性克隆经酶切和PCR鉴定与预期结果一致,测序结果确证了插入片段的正确性,Westernblot检测说明幽门螺杆菌的外膜蛋白528编码基因在分枝杆菌中获得了表达并具有良好的免疫原性。结论成功构建了幽门螺杆菌外膜蛋白528编码基因大肠杆菌一分枝杆菌穿梭表达质粒。该质粒能在E.coli/MS间进行穿梭,并在耻垢分枝杆菌中表达。 相似文献
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人幽门螺杆菌26 000外膜蛋白与热休克蛋白双价疫苗的构建和表达及抗原性研究 总被引:4,自引:1,他引:3
目的构建含人幽门螺杆菌(Hp)热休克蛋白A(HspA)和26 000外膜蛋白(OMP)编码基因的重组载体,进行核苷酸序列分析,并在大肠杆菌BL21中表达,研究其抗原性,为疫苗的开发奠定基础.方法利用分子克隆技术从Hp DNA染色体中,扩增HspA编码基因片段,将目的基因HspA与载体pET32a(+)经kpnⅠ、BamH I 双酶切后,进行连接、测序;同时将重组载体pET32a(+)/HspA和pET32a(+)/Omp26分别经Hind Ⅲ、BamH I 双酶切, 通过凝胶电泳回收pET32a(+)/HspA和26 000 OMP DNA片段,经T4连接酶将HspA和26 000 OMP编码基因通过酶切粘端进行连接,而后转化并筛选含有两种目的基因的重组载体,并在大肠杆菌BL21(DE30)中表达,表达产物经纯化后,以western 印迹法检测其抗原性.结果经酶切、测序分析表明,插入的基因片段为Hp HspA和26 000外膜蛋白编码基因,由951bp组成,与GenBank报道的相比较,有1.15%的bp发生变异,1.26%的氨基酸残基改变;经SDS-PAGE分析发现,融合基因表达的蛋白相对分子质量(Mr)为59×103 ,其中pET32a(+)表达的蛋白Mr约为20×103,可溶性表达产物占全菌总蛋白的19.96 %;重组蛋白经含Ni2+琼脂糖树脂纯化后,其纯度达95%以上;western 印迹法检测显示,该重组蛋白可被Hp阳性患者的血清及抗26 000 OMP单克隆抗体所识别,具有良好的抗原性.结论成功地克隆并融合表达了Hp HspA和26 000 OMP,为Hp蛋白质疫苗和核酸疫苗的研制和快速诊断试剂盒的研究奠定了良好的基础. 相似文献
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血管内皮生长因子在原核细胞中的高效表达、纯化与活性研究 总被引:1,自引:0,他引:1
目的用基因工程的方法在大肠杆菌中诱导表达人血管内皮生长因子(VEGF165),分离纯化并检测其免疫学以及生物学活性,为后期构建携带VEGF165蛋白的预成血管化组织工程骨提供充足的蛋白来源。方法利用PCR亚克隆的方法获得目的基因片段,构建表达质粒pQE30-VEGF165,在大肠杆菌JM109中用IPTG进行诱导表达并使用Ni^2+--NTA进行蛋白纯化。酶联免疫吸附(ELISA)和Western blot技术检测纯化的VEGF165蛋白免疫学活性,鸡胚尿囊绒毛膜实验和matrigel血管形成实验检测其生物学活性。结果重组表达质粒pQE30-VEGF。在大肠杆菌中成功的表达了相对分子质量为23000的蛋白,该蛋白以不溶性包涵体的形式存在,占菌体总蛋白的30%左右。经过分离和Ni柱纯化获得了VEGF165蛋白,浓度约为0.2mg/ml,ELISA和Westernblot实验显示其具有良好的免疫学活性,鸡胚尿囊绒毛膜实验和matrigel血管形成实验显示所表达的蛋白具有良好的生物学活性。结论本实验在原核细胞中稳定、高效的表达了具有活性的VEGF165蛋白,为后期预购血管化组织工程骨的构建提供了充足的蛋白来源。 相似文献
20.
目的 克隆肺炎链球菌自溶素(LytA)基因并在大肠埃希菌中表达及蛋白纯化。方法 用PCR方法从肺炎链球菌基因组中克隆肺炎链球菌自溶素基因,然后将其插入原核表达载体pET32a(+),构建pET32a(+) - LytA重组质粒,经IPTG诱导使该基因在大肠埃希菌BL21 (DE3)中表达,亲和层析法纯化目的蛋白,将获得的蛋白用Western blot鉴定门结果扩增出的DNA序列与GenBank中的LytA基因序列一致,成功构建了pET32a(+) - LytA重组质粒并在大肠埃希菌中高效表达,所表达的蛋白经Western blot证实为肺炎链球菌自溶素融合蛋白。结论 成功克隆了肺炎链球菌自溶素基因,并将其在大肠埃希菌中表达、纯化,为新型肺炎链球菌疫苗的研制奠定了基础。 相似文献