嗜血杆菌属CODEHOP PCR检测方法的建立及在树鼩检测中的应用

目的建立树鼩中嗜血杆菌的CODEHOP PCR快速检测方法,为树鼩微生物质量控制提供参考。方法应用CODEHOP在线简并引物设计工具,比对NCBI中6株嗜血杆菌的外膜蛋白序列设计简并引物。通过4株嗜血杆菌标准菌株和24株它属菌株进行特异性和敏感性评价,将建立CODEHOP PCR检测方法,应用于树鼩嗜血杆菌的检测。结果简并引物HF1/HR8和HF3/HR3扩增标准菌株副鸡嗜血杆菌(ATCC 29545)、溶血嗜血杆菌(ATCC 33390)、流感嗜血杆菌(ATCC 33391)、副流感嗜血杆菌(ATCC 33392)的目的片段分别为506 bp~535 bp和344 bp~390 bp,经测序和NCBI Blast比对,结果准确。两对引物组合,能够有效的区分嗜血杆菌属菌株与它属菌株,检测限最低可达2.1 pg/μL。在受试的野生树鼩呼吸道样本中嗜血杆菌阳性率为33.3%(20/60)。结论所建立的方法具有较好的特异性和敏感性,操作简便,能够用于动物样品的嗜血杆菌检测。     

老年患者呼吸道嗜血杆菌的分离及耐药性分析

目的 了解老年呼吸道嗜血杆菌的分离、鉴定及其β-内酰胺酶的产生率和耐药性.方法 采用自配的专用嗜血杆菌培养基分离细菌,在血琼脂平板和M-H平板上做卫星试验对分离出的细菌进行鉴定,阳性者部分用NHI卡进行确认.用头孢硝噻吩法测试β-内酰胺酶的产酶率,并用琼脂扩散法进行药敏试验.结果 1 138份标本共检出119株嗜血杆菌,检出率10.5%,其中流感嗜血杆菌25株（21.0%）,副流感嗜血杆菌94（79. 0% ）株,嗜血杆菌β-内酰胺酶的产生率为23.5%;左氧氟沙星、氨苄西林、复方新诺明对嗜血杆菌的耐药率较高,为15.0%～54.6% （流感嗜血杆菌）、19.2%～56.5%（副流感嗜血杆菌）;而阿莫西林/克拉维酸、氨曲南和二代三代头孢对嗜血杆菌的耐药率则较低（均＜10 %）.结论分离出的嗜血杆菌主要以副流感嗜血杆菌为主,对阿莫西林 /克拉维酸、氨曲南和二代三代头孢菌素的敏感性高于其他抗生素,可作为首选治疗用药.     

鼠类感染沙粒病毒CODEHOPRT-PCR检测方法的建立

目的建立鼠类感染沙粒病毒的CODEHOPRT—PCR检测方法。方法依据沙粒病毒N蛋白氨基酸序列设计1对CODEHOP引物,建立沙粒病毒一步RT—PCR检测方法,分析该引物在对不同种沙粒病毒基因序列上的结合位点及所能获得的产物序列大小;通过检测分离自鼠类的沙粒病毒属淋巴细胞脑膜炎病毒（LCMV）株MS111013,评价方法的特异性和灵敏度;对MS111013扩增产物进行Blast同源性比对。结果从GenBank获得的22种沙粒病毒均存在CODEHOP引物结合位点,扩增产物大小在406～429bp之间。建立的CODEHOPRT—PCR方法可特异性扩增LCMV病毒核酸,目的片段大小与预期结果相符,核酸的最小检出量为11．8Pg。经Blast比对,MS111013与LCMV病毒株Douglas strain（4707）同源性较高,为86％。结论建立的沙粒病毒CODEHOPRT—PCR检测方法敏感、特异,可用于鼠类沙粒病毒感染检测。     

检测猪链球菌2型胞外因子（EF）的PCR方法的建立

根据猪链球菌2型的ef基因和ef^*基因合成了一对可扩增长度为626bp目的片段的引物,成功地建立了检测胞外因子（EF）的PCR方法。用HaeⅡ内切酶进行酶切,获得了与预期一致的354bp和272bp的两个片段,并进行了PCR的牧民性试验和敏感性试验。对马腺疫链球菌兽疫亚种、猪丹毒杆菌、猪肺疫巴氏杆菌和猪肺炎霉形体的PCR检测结果均呈阴性;检测的敏感度可达100个细菌。另外,对9株猪链球菌2型菌株进行了检测,7株呈EF阳性,1株呈EF^*阳性,1株呈EF阴性;对15份正常屠宰猪扁桃体分离物的检测结果1份为阳性。实验结果表明此法特异性和敏感性很高,可作为EF快速诊断和流行病学调查的手段。     

快速检测牛羊猪种布鲁杆菌多重PCR的建立

目的 建立一种能同时快速检测并能鉴别牛、羊、猪种布鲁杆菌的多重PCR方法.方法 根据IS711插入序列设计1条公共引物和3条牛、羊、猪种布鲁杆菌(544A、16M、1330S)特有序列引物,进行多重PCR反应;选择耶尔森菌O:9、大肠埃希菌O157:H7、鼠伤寒沙门菌47729进行多重PCR反应的特异性检测;倍比稀释定量法观察牛种布鲁杆菌多重PCR反应的敏感性.结果 牛、羊、猪种布鲁杆菌多重PCR反应扩增片段产物长度分别为485、731、248 bp;耶尔森菌O:9、大肠埃希菌O157:H7、鼠伤寒沙门菌47729加入布鲁杆菌中进行多重PCR反应.扩增结果呈阴性;牛种布鲁杆菌多重PCR反应敏感性为0.0967 Pg.结论 成功建立快速检测牛、羊、猪种布鲁杆菌多重PCR扩增反应方法,且其特异性、敏感性较好.     

快速检测猪链球菌的环介导等温扩增方法

目的建立猪链球菌(S. suis)的环介导等温扩增方法(LAMP)。方法通过BLASTn序列比对确定较为保守的S. suis种特异基因,用软件PrimerExplorer V4设计针对靶基因的LAMP试验引物;分别用煮沸法和试剂盒提取法提取基因组做敏感性试验,并用62株非S. suis菌株评价了实验的特异性;再用100株分离自不同地区不同时间的S. suis菌株评价该方法的可靠性。结果确定了S. suis种特异性基因dnaN为靶基因,并针对该基因建立了检测S. suis的LAMP方法。敏感性实验中,每个反应的检测下限是31.25 fg纯DNA,相当于14个拷贝;煮沸法的检测下限是每个反应27 CFU。在对62株非S. suis菌株与有争议的S. suis菌株的特异性评价实验中,未发现有假阳性。结论成功建立了针对dnaN基因检测S. suis的LAMP方法。     

聚合酶链反应检测肝硬化患者腹水中细菌DNA

目的:探讨PCR方法检测肝硬化患者腹水中细菌DNA的可行性.方法:在细菌16S rRNA基因保守区设计一对通用引物,对7种对照菌株、人基因组DNA、HBV DNA、37份肝硬化患者腹水进行聚合酶链反应扩增.结果:7种对照菌株均获得530 bp DNA片段.而与人基因组DNA、HBV DNA无交叉阳性反应,敏感性试验可检测出1pg的细菌DNA.37份腹水中有9份获得53bp DNA片段,阳性率24.3%(9/37),而腹水细菌培养阳性率为5.4%(2/37),两者比较差异有显著性意义(P＜0.05).结论:将通用引物通过PCR方法扩增细菌16S rRNA基因,具有高度敏感性、特异性,可应用于肝硬化患者腹水中细菌DNA的检测及细菌移位的研究.     

实时荧光定量PCR检测布鲁杆菌方法的应用

目的 探讨实时荧光定量PCR(FQ-PCR)用于布鲁杆菌检测的可行性.方法 根据布鲁杆菌BCSP31基因设计合成1对引物和TaqMan探针,以克隆有布鲁杆菌基因片段的PMD18-T质粒作为标准品DNA模板,进行FQ-PCR检测,绘制标准曲线;对所应用的方法分别进行敏感性、特异性及重复性分析;并对临床血液标本进行FQ-PCR,与临床诊断进行比较.结果 用标准品DNA建立的定量标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.999);FQ-PCR检测的灵敏度拷贝数为5个/μl,普通PCR为5×102个/μl,FQ-PCR是普通PCR的100倍;用FQ-PCR检测6株布鲁杆菌菌株及5株非布鲁杆菌菌株,布鲁杆菌均检出较强荧光信号,非布鲁杆菌未检出;5×103个拷贝/μl标准品DNA检测后,Ct值批内变异系数(CV)为0.71%,批间CV为7.23%;用FQ-PCR检测临床确诊阳性血标本24份,检出阳性19份,符合率为79%(19/24),阴性对照血标本31份,全部阴性,阴性符合率为100%(31/31),临床症状可疑标本30份,检出阳性2份.结论 用FQ-PCR方法检测布鲁杆菌具有高度敏感性、特异性及良好的重复性,与临床阳性及阴性标本的符合率较高,可用于快速检测各种样本中的微量布鲁杆菌以及作为布鲁杆菌感染的实验室检测方法.     

临床分离流感嗜血杆菌和副流感嗜血杆菌的耐药性研究

目的 了解上海部分医院分离的流感和副流感嗜血杆菌对常用抗菌药物的敏感性、对β内酰胺类和喹诺酮类药物的耐药机制以及耐药菌株的克隆传播情况.方法 以琼脂稀释法测定氨苄西林等13种抗菌药物对2006年上海5所医院临床分离的156株嗜血杆菌属细菌的体外抗菌活性,头孢硝噻吩纸片法检测β-内酰胺酶,PCR扩增检测TEM和ROB型β-内酰胺酶基因和喹诺酮类耐药株的喹诺酮耐药决定区,以肠杆菌科基因间重复序列聚合酶链反应(ERIC-PCR)比较细菌的同源性.药物敏感性试验结果采用χ2检验,ERIC-PCR条带模型转换数据进行聚类分析.结果 109株流感嗜血杆菌对氨苄西林敏感率为74.3%,而对氨苄西林舒巴坦、头孢菌素类、氟喹诺酮类等敏感率为100.0%.109株流感嗜血杆菌和47株副流感嗜血杆菌β-内酰胺酶产酶率分别为25.7%和19.1%(χ2=0.776,P=0.378),产酶株均检测到TEM基因.109株流感嗜血杆菌中仅1株对环丙沙星耐药,其gyrA基因存在84位丝氨酸突变为亮氨酸,parC基因存在206位甘氨酸突变为精氨酸.ERIC-PCR结果显示,106株流感嗜血杆菌在85%相似度水平可被分为73型.结论 上海地区流感嗜血杆菌临床菌株对除氨苄西林外的其他常用抗菌药物仍保持很高的敏感率.受试流感嗜血杆菌对氨苄西林耐药的主要机制均为产TEM型β-内酰胺酶.在包括氨苄西林耐药株在内的流感嗜血杆菌中,克隆传播尚不普遍.     

军团菌双重PCR检测方法的建立及其应用研究

目的　建立一种双重PCR方法 ,用于简便 ,快速检测军团菌。方法　根据军团菌 16SrRNA基因和mip基因序列设计合成引物 ,可以扩增 386bp 16SrRNA基因和 2 0 6bpmip基因片段。用该方法对军团菌标准参考菌株和 47份临床标本进行了检测。结果　通过一次PCR反应 ,不仅能够检测嗜肺军团菌 ,而且能够检测非嗜肺的军团菌 ,从而克服了单一引物应用时的不足。 2 1株对照菌株扩增阴性 ,最小检出限为 2× 10 1 cfu/ml。 47份临床标本 (包括 12份血 ,2 0份支气管肺泡灌洗液 ,7份胸水 ,8份痰 )PCR检测的阳性标本为 2 8份 (2 8/4 7) ,在临床上均支持为军团菌感染 ,高于血清抗体检测的阳性标本数 (2 4/4 7)。结论　该方法用于军团菌的检测简便、快捷 ,具有很高的特异性和敏感性 ,为未来军团病分子流行病学调查及临床早期诊断提供了有效的检测手段     

blaOXA-51-like碳青霉烯酶基因PCR扩增用于鲍曼不动杆菌检测的可行性评价

目的分析blaOXA-51-like碳青霉烯酶基因PCR扩增用于鲍曼不动杆菌检测和鉴定的可行性。方法PCR扩增105株不动杆菌的blaOXA-51-like碳青霉烯酶基因,并对检测的特异性进行评估。结果PCR检测82株鲍曼不动杆菌blaOXA-51-like碳青霉烯酶基因均阳性,但其中1株PCR产物比预期大（1 664 bp）;测序发现blaOXA-51-like碳青霉烯酶基因中包含一段1 308 bp的插入序列。不动杆菌属其他菌株blaOXA-51-like碳青霉烯酶基因PCR检测均阴性。若以353 bp扩增带作为blaOXA-51-like碳青霉烯酶基因PCR阳性标准,检测的敏感度和特异度分别为98.9%和100%;若以出现PCR扩增条带为阳性标准,则检测的敏感度和特异度均为100%。结论blaOXA-51-like碳青霉烯酶基因PCR扩增用于检测鲍曼不动杆菌特异性较高,但如果仅从扩增片段长度判断,存在出现假阴性的可能。     

Flanders病毒TaqMan RT-PCR检测方法的建立

目的 应用TaqMan PCR技术建立针对Flanders病毒(Flanders virus, FLAV)的实时荧光定量PCR检测方法。方法 下载GenBank中FLAV基因序列资料并进行多序列比对分析,选择其L基因中的高保守序列片段进行FLAV特异引物与探针的设计,使用来自于不同科属的15株病毒验证方法特异性,通过重复/平行实验验证方法稳定性,并利用体外转录的L基因RNA标准品建立基因拷贝数绝对定量分析模型。结果 引物与探针工作特异性良好,同一样品重复检测Ct值的变异系数均小于1.7%,定量分析模型灵敏度达到100 copies/PCR。结论 建立完成针对FLAV的TaqMan PCR检测方法。实验结果显示,本方法具有高特异性、高敏感性、高稳定性、简便、易操作的特点,为今后对FLAV的检测、监测及相关研究提供技术手段。     

用人工繁育的围生期和幼年树鼠句感染人乙型肝炎病毒的初步研究

目的通过用人工繁育的围生期和幼年树鼩接种人乙型肝炎病毒(HBV),并优选感染指标的检测方法,提高树鼩对HBV的感染率及检出方法的敏感性和可靠性。方法用人HBV阳性血清接种42只人工繁育的围生期和幼年树鼩,选择合适的引物,经巢式PCR(nPCR)技术检测它们肝组织及血清的HBV DNA,并对扩增出的DNA片段进行测序验证,以及对活检肝组织作病理组织学观察。结果接种后动物的肝组织和血清HBV DNA的阳性率分别为47.6%(20/42)和71.4%(30/42),肝组织和血清共同阳性的为40.5%(17/42),总阳性率为78.6%(33/42);扩增的DNA片段经测序与人HBV DNA相应片段的同源性为98%和99%;肝组织病理改变以轻度炎性病变较多见。结论用人工繁育的围生期和幼年树鼩感染HBV,可提高树鼩对HBV的感染效率;用nPCR技术及选择合适的引物配对检测肝组织和血清标本的HBV DNA,是评价树鼩感染HBV状况的敏感、可靠方法。     

香港海鸥形菌多重PCR及嵌合荧光PCR检测方法的建立与应用

目的 建立香港海鸥形菌(Laribacer hongkongensis, LH)的多重PCR(multi-PCR)及嵌合荧光法(SYBR Green I)PCR检测方法,并对其在临床及环境微生物方面的应用前景进行评价。方法 通过对62株香港海鸥形菌16S RNA 基因和16S-23S rRNA基因间隔区(16-23S rRNA intergenic spacer region, ISR)进行PCR扩增和多序列比对,设计两对特异性引物,建立多重PCR体系,用15种细菌性腹泻标准菌株及临床菌株进行PCR特异性和敏感性检验;并在此基础上针对两对引物分别用嵌合荧光PCR法进行浓度梯度检测,以确定最低检测限。结果 香港海鸥形菌多重PCR法特异性为100%,最低检出限为5×10³ CFU/mL菌液;而嵌合荧光PCR法两对引物的最低检出限均达到5×10² CFU/mL菌液。结论 该法的建立为临床及环境微生物学提供了一种快速和灵敏的香港海鸥形菌检测手段。     

大肠杆菌肠毒素基因多重PCR检测方法的建立

目的 建立一种快速检测大肠杆菌耐热肠毒素(heat-stable enterotoxin, STa, STb)和不耐热肠毒素(heat-labile enterotoxin, LT-Ⅰ, LT-Ⅱ)基因的多重PCR方法。方法 参照文献合成四对可扩增产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)耐热肠毒素基因(estA、estB)和不耐热肠毒素基因(elt-Ⅰ、elt-Ⅱ)的特异性引物,通过反应条件的优化,敏感性、特异性试验和临床样品检测,建立检测大肠杆菌肠毒素的多重PCR方法。结果 用所建立的多重PCR方法可特异性扩增出estA(229 bp)、estB(480 bp)、elt-Ⅰ(605 bp)和elt-Ⅱ(300 bp)基因片段,最低检出量分别为2.55×10¹ CFU/μL、2×10¹ CFU/μL、2×10¹ CFU/μL和2.47×10³ CFU/μL。从22株大肠杆菌分离株中检测到estA基因(2/22),elt-Ⅱ基因(3/22),未检测到estB和elt-Ⅰ基因,检测结果与常规PCR检测结果一致。结论 建立了检测大肠杆菌肠毒素基因(estA、estB、elt-Ⅰ和elt-Ⅱ)的多重PCR方法,该方法具有良好的特异性和敏感性,能够满足对细菌培养物的检测要求。     

应用GeXP系统检测败血症患者肺炎克雷伯杆菌多重耐药基因的研究

目的采用GeXP系统检测肺炎克雷伯杆菌多重耐药基因,以指导败血症患者的临床治疗。方法从败血症患者血液标本中分离出肺炎克雷伯杆菌,用建立GeXP多重耐药基因检测体系,对其多重耐药基因进行检测。结果扩增出的7对特异性目的基因片段的大小与设计的引物相符合,拼接后比对与基因库中公布的相应基因序列吻合。以该引物多重PCR扩增肺炎克雷伯多重耐药基因,扩增产物用GeXP毛细管电泳分离,根据扩增的基因片段大小确定各峰分别为rmtB(176.71/179.03bp)、aac(6’)-Ib(190.74/192.56bp)、aac(6’)-Ⅱ(218.67bp)、armA(249.84bp)、aac(3)-Ⅱ(268.63/270.51bp)、aph(3’)-IV(289.18bp)、ant(3’)-Ⅰ(319.24/320.99bp),片段长度与理论值误差为3~5bp,即在GeXP毛细管电泳分离过程中发生了片段大小漂移现象。结论采用GeXP系统能从败血症患者感染的肺炎克雷伯杆菌检测出7个不同大小的耐药基因,可据此指导败血症的临床治疗。     

PCR快速检测食品中志贺氏菌方法的建立

目的本研究根据福氏志贺菌(Shigella lexneri)侵袭性质粒抗原H基因(invasion plasmid antigen H,ipaH),设计了一对特异性引物,预计PCR扩增的目的基因片段为435bp。对PCR的特异性、敏感性分析以及建立L16(43)正交试验对PCR扩增条件如引物浓度、dNTP浓度和Tm值等的优化,建立了快速检测福氏志贺菌的稳定的PCR方法。该方法检测的灵敏度为可以检测到食品中7 ng/ml福氏志贺菌的基因组DNA。并且模拟检测食品中的细菌,结果很稳定。该方法操作简单、检验周期短、特异性和灵敏度高,能够快速地实现对食品中的志贺菌的诊检和监控。     

基于TaqMan探针的双重荧光定量PCR方法检测海产品中的副溶血弧菌

目的建立海产品中副溶血弧菌检测的双重荧光定量PCR体系。方法针对副溶血弧菌种特异性基因tlh和tdh设计引物和TaqMan探针,建立双重荧光定量PCR体系,进行特异性与敏感性研究;利用该体系检测海产品中的副溶血弧菌。结果副溶血弧菌可得到特异性扩增,而其它与副溶血弧菌共存于海产品中的细菌均未见扩增曲线。副溶血弧菌与其它细菌的混合DNA检测表明,其它细菌基因组的存在时并不干扰副溶血弧菌检测。副溶血弧菌典型菌株FJ14和BJ97的敏感性试验显示,该体系的最低检测DNA浓度分别为49.8pg与77.8pg,最低检测细菌浓度为56CFU/mL和371CFU/mL。对舟山菜市场采集的50份样本检测表明,32份为tlh基因阳性,3份为tdh基因阳性,与传统方法的检测结果相同。结论与传统检测方法相比,副溶血弧菌的双重荧光定量PCR检测方法快速准确,结果直观。     

用聚合酶链反应技术对粉尘螨和屋尘螨进行鉴别和检测

目的用聚合酶链反应（PCR）技术对粉尘螨和屋尘螨进行鉴别和检测。方法用随机引物PCR对粉尘螨和屋尘螨的DNA进行扩增,选择3个扩增条带进行测序和分析。根据测序结果再次设计PCR引物用于粉尘螨和屋尘螨的鉴别和检测,并对该引物的特异性和敏感性进行了分析。结果随机引物扩增反应,粉尘螨在750bp和500bp左右均有明显条带;而屋尘螨仅500bp左右条带较清晰,无大于500bp的扩增产物出现。测定了3个新的尘螨DNA片段的序列结构。新设计的引物用于两种尘螨的检测有较好的特异性和敏感性。结论随机引物PCR技术可用于粉尘螨和屋尘螨的鉴别。本研究方法具有检测环境中粉尘螨和屋尘螨的潜力。     

成人嗜血杆菌心内膜炎

Clemence的报告,对1983至1995年间发生于法国的4 2例成人嗜血杆菌心内膜炎病例进行回顾性分析。41例病人均从血样中分离到嗜血杆菌,仅1例从瓣膜中分离到该菌;其中26例是副流感嗜血杆菌引起.3例患者由多种微生物引发心内膜炎.仅3株嗜血杆菌产生β-内酰胺酶;76％(32/42)病人可通过超声心动图谱证实心内膜炎存在;根据Duke标准,38例可确诊为单纯嗜血杆菌性心内膜炎。疾病的发作