应用酵母双杂交系统筛选Foxp3△2相互作用蛋白

目的:应用酵母双杂交系统从人外周血白细胞cD-NA文库中筛选与转录因子Foxp3相互作用的蛋白,为进一步研究Foxp3的转录调控机制奠定基础。方法:首先构建pG-BKT7-Foxp3△2酵母双杂交诱饵载体,转化AH109酵母细胞,检测其毒性及自激活作用;然后将诱饵质粒与人外周血白细胞cDNA文库共转AH109酵母细胞,筛选了与Foxp3△2存在相互作用的蛋白。结果:成功构建了pGBKT7-Foxp3△2酵母表达载体,经转染AH109酵母细胞,无有毒性,无自激活作用。获得了40个阳性克隆,经生物信息学分析,其中9个具有开放读框。结论:应用酵母双杂交技术筛选出一组可与Foxp3△2相互作用的候选蛋白,为进一步研究Foxp3△2功能奠定了基础。     

酵母双杂交诱饵载体pGBKT7_ppr Ⅰ的构建及自激活检测

目的 构建耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans)R1 ppr Ⅰ蛋白的诱饵表达载体,为应用酵母双杂交系统筛选与ppr Ⅰ相互作用的蛋白建立实验基础.方法 PCR扩增ppr Ⅰ基因片段,克隆入诱饵载体pGBKT7中,经测序鉴定后,将构建好的诱饵载体pGBKT7_ppr Ⅰ转化到酵母细胞AH109中,检测诱饵蛋白有无毒性、渗漏和自激活作用.结果 成功扩增了ppr Ⅰ基因片段,并克隆入pGBKT7中,测序结果正确.诱饵载体成功转化到酵母细胞AH109中,诱饵蛋白无毒性、渗漏和自激活作用.结论 成功构建了ppr Ⅰ的酵母诱饵表达载体,为进一步运用酵母双杂交技术筛选与之相互作用的蛋白奠定了基础.     

酵母双杂交诱饵载体pGBKT7_pprⅠ的构建及自激活检测

目的构建耐辐射球菌（Deinococcvz radiodurans）R1 pprⅠ蛋白的诱饵表达载体,为应用酵母双杂交系统筛选与pprI相互作用的蛋白建立实验基础。方法PCR扩增pprⅠ基因片段,克隆入诱饵载体pGBKT7中,经测序鉴定后,将构建好的诱饵载体pGBKT7_pprⅠ转化到酵母细胞AH09中,检测诱饵蛋白有无毒性、渗漏和自激活作用。结果成功扩增了pprⅠ基因片段,并克隆入pGBKT7中,测序结果正确。诱饵载体成功转化到酵母细胞AH109中,诱饵蛋白无毒性、渗漏和自激活作用。结论成功构建了pprⅠ的酵母诱饵表达载体,为进一步运用酵母双杂交技术筛选与之相互作用的蛋白奠定了基础。     

BI-1作为酵母双杂交系统诱饵的载体构建

目的 用人BI-1完整编码区构建酵母双杂交系统的诱饵蛋白载体,排除自身激活作用,并证实其能否在酵母细胞中的表达,验证它能否用于酵母双杂交系统。方法 以人正常肺组织cDNA为模板,扩增BI-1完整编码区,经EcoRI、SalI双酶切后克隆到酵母双杂交系统诱饵载体pGBKT7上,构建诱饵蛋白载体pGBKT7-BI-1,转化酵母细胞,通过β-半乳糖苷酶活性分析验证有无自激活,Western验证其表达。结果 DNA测序显示BI-1编码区内无突变,β-半乳糖苷酶活性分析显示转入pGBKT7-BI-1和阴性对照的酵母菌落没有激活报告基因LacZ,而阳性对照菌落呈现蓝色。结论 含有BI-1完整编码区的诱饵载体不存在自身激活作用,并能在酵母细胞中表达BI-1蛋白,能够应用于酵母双杂交系统筛选相互作用蛋白。     

柯萨奇病毒A16型2 B基因的酵母双杂交诱饵载体的构建及其特性鉴定

目的：构建柯萨奇病毒A16的2B基因的酵母诱饵表达载体,用于筛选与2B相互作用的蛋白。方法 PCR扩增2B全序列,克隆入pGBKT7?BD,将构建好的 pGBKT7?2B转化到酵母细胞 Y2HGold;用Western印迹分析诱饵蛋白的表达,检测诱饵蛋白有无毒性和自激活效应。结果成功克隆了pGBKT7?2B并转化至Y2 HGold中,转化细胞Y2 HGold [pGBKT7?2B]可以表达诱饵蛋白2B,2B蛋白对转化细胞无细胞毒性和自激活效应。结论成功构建了酵母诱饵表达载体pGBKT7?2B,可用于酵母双杂交筛选与2B蛋白相互作用的宿主靶蛋白。     

人肝再生增强因子cDNA的克隆及其酵母双杂交载体的构建

目的：获取人肝再生增强因子（hALR)阅读框的cDNA及构建其酵母双杂交系统的“诱饵”质粒。方法：利用RT－PCR方法，从人胎肝组织中扩增出一约380bp的DNA片段，重组入pGBKT7载体中，构建成pGBKT7-hALR，然后研究此重组质粒在酵母AH109中的表达情况并用于筛选人肝cDNA文库，结果：获得的378bp的DNA序列与文献报道的人ALR序列一致；转化的酵母细菌在选择性培养基SD／-Trp上培养65小时，长出约Φ1mm大小的白色菌落，而在SD／－Trp/-His上不生长；酵母提取液的Western blot分析，证实ALR基因在AH109以融合蛋白的形式表达，并具有免疫活性；初步得到hALR相互作用的阳性克隆。结论：pGBKT7-hALR对宿主菌AH109没有毒性作用，也没有自身激活报告基因，可作为酵母双杂交系统中的“诱饵”质粒。     

应用酵母双杂交技术筛选干扰素β结合蛋白的研究

目的 应用酵母双杂交技术筛选干扰素β（IFNp）结合蛋白。方法 用多聚酶链反应（PCR）技术扩增IFNB基因，连接酵母表达载体pGBKT7构建诱饵质粒，转化酵母细胞AH109，与含人肝细胞cDNA文库质粒的酵母细胞Y187进行配合，在营养缺陷型培养基（SD／-Trp-Leu-His-Ade）和X-α-半乳糖（X-α-gal列）上进行双重筛选阳性克隆，提取酵母质粒后转化大肠埃希菌（DH5α）并经氨苄西林抗性筛选，提取单克隆菌落质粒，进行酶切鉴定及序列测定，并进行生物信息学分析。结果 应用酵母双杂交技术筛选出阳性克隆29个，经生物信息学分析，排除读码框架不正确者，最后得到19个克隆基因，编码14种已知蛋白和一种未知功能蛋白。初步发现铁蛋白与IFNB具有结合作用。结论 应用酵母双杂交技术筛选出多种与IFNB具有结合作用的蛋白。     

早幼粒细胞白血病基因结构域诱饵载体的构建及鉴定

目的 研究早幼粒细胞白血病基因(promyelocytic leukemia,PML)中含环指/B-BOX结构与含coiled-coil结构的两个结构域的功能,构建含其结构域序列的诱饵表达载体,为进一步应用酵母双杂交系统筛选与之相互作用的蛋白建立实验基础.方法 PCR扩增PML的两个结构域序列,克隆入诱饵载体pGBKT7中,经测序鉴定后,将诱饵载体转化到酵母细胞AH109中,检测诱饵蛋白有无毒性,渗漏和自激活作用,同时利用蛋白印迹法分析诱饵蛋白的表达.结果 成功扩增了PML两个结构域的基因片段,并正确克隆入pGBKT7中.诱饵载体成功转化到酵母细胞AH109中,其中一个诱饵蛋白BD-PML-B无毒性,但具有渗漏和自激活作用,另一个诱饵蛋白BD-PML-C无毒性,渗漏和自激活作用,蛋白印迹法分析证实酵母细胞表达诱饵蛋白.结论 含环指/B-BOX的结构域具有转录因子活性,全长PML的转录活性与之有关;成功构建了含coiled-coil结构的PML结合域的酵母诱饵表达载体,为运用酵母双杂交技术筛选与之作用的蛋白并探讨其功能奠定了基础.     

酵母双杂交筛选与单剪接型2.2 kb乙型肝炎病毒剪接特异性新蛋白相互作用的肝细胞蛋白

目的 筛选与单剪接型2.2 kb乙型肝炎病毒(HBV)剪接特异性新蛋白相互作用的肝细胞蛋白.方法 PCR扩增单剪接型2.2 kb HBV剪接特异性新基因TPss并克隆于诱饵载体pGBKT7,在证实TPss蛋白不具有自激活作用的前提下,以酵母双杂交系统筛查与TPss蛋白相互作用的肝细胞蛋白,进而通过哺乳动物细胞双杂交实验验证候选肝细胞蛋白与TPss蛋白在Huh7和HepG2肝细胞中的相互作用.结果 构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-TPss,Western blot显示其在酵母中表达TPss蛋白.酵母双杂交筛选及哺乳动物细胞双杂交证实TPss蛋白可与4种肝细胞蛋白相互作用,即组织蛋白酶B、微粒体环氧化物水解酶、组织蛋白酶D与纤维蛋白原γ链.结论 TPss可与多种肝细胞蛋白相互作用.     

应用酵母双杂交系统研究与血管紧张素-(1-7)相互作用的蛋白

目的用酵母双杂交系统筛选与血管紧张素-(1-7)相互作用的蛋白,为该7肽在体内如何发挥功能提供线索。方法构建Ang-(1-7)的真核表达载体pBD—Ang-(1—7),转化酵母菌YRG-2,进行毒性和自身非特异激活性检验。与大鼠心肌细胞文库质粒共同转化酵母细胞,在营养缺陷培养基上进行双杂交筛选,选择既能在3重营养缺陷培养基上生长,也能使X—gal变蓝的克隆为阳性,提取靶质粒后进行复交,将真阳性质粒测序,进行生物信息学分析。结果诱饵载体构建成功并转化酵母,对酵母无毒性,无自身激活现象。筛选出的蛋白主要参与细胞代谢和蛋白合成。结论Ang-(1-7)可能影响细胞内某些蛋白合成和细胞代谢,发挥对血管紧张素Ⅱ的结抗作用。酵母双杂交结果为Ang-(1—7)的作用途径的进一步研究提供了分子生物学线索。     

应用酵母双杂交系统筛选与蛋白激酶Pkmyt1相互作用的候选分子

目的蛋白激酶Pkmyt1负调控小鼠1-细胞期受精卵有丝分裂的进程,但具体调控机制还不清楚。因此,利用酵母双杂交系统从人卵巢c DNA文库中筛选与Pkmyt1相互作用的候选蛋白,为研究Pkmyt1调控小鼠受精卵早期发育提供新线索。方法以小鼠卵巢组织c DNA为模板,构建p GBKT7-Pkmyt1诱饵质粒,转化酵母感受态细胞后,分别接种于SD/-Trp(SDO)、SD/-Trp/X-α-Gal(SDO/X)和SD/-Trp/X-α-Gal/Ab A plates(SDO/X/A)培养板,检测其对酵母的毒性和自身激活能力,Western blotting法检测p GBKT7-Pkmyt1在酵母细胞中的表达。将人卵巢c DNA文库与含有p GBKT7-Pkmyt1的酵母感受态细胞融合,PCR筛选出阳性克隆,提取质粒,测序鉴定,再次检测其对酵母自激活能力,利用生物信息学分析筛选蛋白与胚胎发育的关系。结果酶切鉴定和Blast分析表明p GBKT7-Pkmyt1质粒构建成功。将该质粒转入Y2H golden中,在SDO板上克隆均匀生长,在SDO/X/A平皿上无克隆生长,Western blotting检测Pkmyt1在酵母细胞中有表达。PCR验证融合后的阳性克隆质粒有插入片段。通过初步筛选得到182种能够与Pkmyt1相互作用的蛋白质,经回复性实验进一步验证有46个与Pkmyt1之间存在相互作用的蛋白。结论通过筛选发现46个蛋白可能通过与Pkmyt1相互作用调控小鼠卵母细胞成熟和受精卵早期发育。     

酵母双杂交技术筛选NECL1胞内区的结合蛋白

目的 筛选人源膜表面黏附分子NECL1蛋白胞内区相互作用蛋白。 方法 构建含人NECL1蛋白胞内区氨基酸编码序列的诱饵质粒pGBKT7-NECL1C,对人胎脑cDNA文库进行酵母双杂交筛选。用GST pull down实验进行体外蛋白相互作用的验证。结果 酵母双杂交阳性克隆测序后显示共存在9段不同序列（存在重复克隆）。比对氨基酸序列得到5个可能相互作用蛋白。通过GST pull down 实验验证了其中两个蛋白与NECL1胞内区的相互作用。结论 应用酵母双杂交系统,获得了一些候选的NECL1胞内区相互作用蛋白。     

甲型H3N2流感病毒截短型PB1-F2蛋白与宿主蛋白的相互作用的初步研究

目的利用酵母双杂交技术研究甲型H3N2流感病毒截短型PB1-F2蛋白与人类宿主蛋白的相互作用,为该病毒蛋白的功能研究和致病机制提供理论依据。方法以本实验室分离和鉴定的甲型H3N2流感病毒A／Guangdong／7028／2010为模版,构建pGBKT7-PB1-F2重组载体,利用Y2HGold酵母双杂交系统,从人类通用cDNA文库中筛选与其相互作用的蛋白。结果成功构建含诱饵蛋白基因的pGBKT7-PB1-F2重组载体,转化酵母自激活和毒性实验显示为阴性：酵母双杂交实验显示Y2HGold和Y187酵母的结合率为5．22％,符合实验要求;经筛选和验证后,得到3个与截短型PB1-F2蛋白有相互作用的阳性克隆,分别为钾／钠ATP酶B1亚基、热休克蛋白40和白介素-2受体1亚基。结论初步推断截短型H3N2流感病毒PB1-F2蛋白可能影响流感病毒在宿主细胞中的复制功能和凋亡调控。     

与人巨细胞病毒UL128两种不同结构蛋白相互作用蛋白的筛选与分析

目的 利用酵母双杂交系统从人胎脑cDNA文库中筛选与两种不同转录结构的人巨细胞病毒(HCMV)UL128编码蛋白相互作用的蛋白,比较两者相互作用蛋白之间的异同点.方法 通过3'RACE和5'RACE技术扩增出两种HCMV UL128片段,其大小分别为519 bp和642 bp,并将其成功构建到酵母诱饵表达载体pGBKT7中.将以上两种酵母表达载体分别转化到酵母菌AH109中,再将文库DNA转化到已含有酵母表达载体的AH109中,筛选与两种片段大小不同的UL128编码蛋白相互作用的人胎脑蛋白,并对筛选得到的阳性克隆进行测序和生物信息学分析.结果 筛出EFEMP2与UL128-519 bp编码蛋白相互作用,THY-1与UL128-642 bp编码蛋白相互作用.结论 成功构建pGBKT7 UL128-519 bp和pGBKT7 UL128-642 bp,并应用酵母双杂交系统分别筛选出EFEMP2和THY-1与UL128-519 bp和UL128-642 bp编码蛋白相互作用,在所筛选得到的相互作用蛋白之间未发现有相同的蛋白,UL128-519 bp和UL128-642 bp所编码的蛋白在HCMV感染致病过程中可能发挥不同的作用.     

人FAM92A1基因诱饵表达质粒的构建与鉴定

目的 构建人FAM92A1基因(hFAM92A1)的诱饵表达质粒pGBKT7-hFAM92A1并检测其蛋白表达、毒性和自激活作用.方法 PCR扩增hFAM92A1的基因编码序列并克隆入诱饵表达载体pGBKT7中,酶切和测序鉴定后,转化到酵母AHl09细胞中,Western印迹检测诱饵蛋白表达情况,同时检测诱饵蛋白的毒性...     

应用酵母双杂交系统筛选与乙型流感病毒BM2相互作用的蛋白质

目的　筛选与乙型流感病毒BM2蛋白相互作用的蛋白质。方法　应用酵母双杂交系统,以BM2 (2 6 10 9)插入载体pGBKT7作为诱铒,在四缺培养基上筛选人KidneyMATCHMAKERcDNA文库,寻找与BM2蛋白相互作用的宿主蛋白。结果　筛选得到6个阳性AD 文库质粒,并用酵母双杂交实验验证了阳性AD 文库质粒与BM2的相互作用。将阳性AD 文库质粒测序并对测序结果做BLAST分析,发现它们分别是N 乙酰神经氨酸酶丙酮酸裂解酶,Angiopoietin 3、锌指蛋白2 5 1、核糖体蛋白S2 0、蛋白精氨酸N 甲基转移酶1(PRMT)、转录因子样1(TCFL1)。结论　BM2能与这些转录翻译功能相关的蛋白质相互作用,表明BM2蛋白在病毒生活周期中发挥重要作用。     

GnRH缺陷疾病致病基因 RNF216互作蛋白的筛选

目的:通过酵母双杂交实验筛选与环指蛋白216(ring finger protein 216, RNF216)相互作用的蛋白,进一步阐明RNF216在GnRH缺陷疾病中的作用。方法:构建pGBKT7- RNF216重组表达载体,将其转化到Y2HGold酵母中,与人cDNA文库进行杂交,筛选与RNF216相互...     

人星状病毒非结构蛋白nsP1 a／1相互作用的宿主细胞靶蛋白筛选

目的：利用细菌双杂交技术筛选与人星状病毒非结构蛋白nsP1a／1相互作用的蛋白。方法培养人肠道细胞HT29,提取基因组,利用细菌双杂交系统载体pUT18 C构建HT29基因组文库,同时构建诱饵载体nsP1a／1?pKT25。将文库和诱饵载体共转化进入细菌BTH101,在M63培养基上进行筛选。结果通过酶切鉴定以及测序分析,诱饵载体构建正确,并且利用细菌双杂交技术成功从HT29细胞基因组文库中筛选出能与人星状病毒非结构蛋白 nsP1a／1相互作用的蛋白。结论成功构建了人星状病毒非结构蛋白nsP1a／1的诱饵载体,在HT29细胞基因组文库中筛选得到了3个与nsP1a／1相互作用的蛋白,为进一步研究人星状病毒在细胞内的增殖和防治药物的应用奠定基础。