庚型肝炎病毒转基因小鼠的特性研究

庚型肝炎病毒 (HGV)是一种新发现的与肝炎相关的病毒 ,作者已克隆了 HGV的全长基因 ,并制备了含有庚型肝炎病毒 (HGV)全长基因的转因基小鼠。作者以本室构建的 HGV转基因小鼠为材料 ,取转基因小鼠的各种组织进行 RT- PCR、免疫组织化学、Westernblotting等实验 ,分析 HGV基因在转基因小鼠体内的复制、表达及前体蛋白的剪切。并以外周血单核细胞(PBMC)及血清 RNA阳性的转基因小鼠血清接种Molt- 4细胞 ,鉴定细胞及上清中的 HGV RNA以及HGV病毒颗粒 ,研究 HGV的传染性。结果发现 HGV的正、负链 RNA以及蛋白产物可以在多个组…     

丙型肝炎病毒F蛋白对p21基因的调节作用

目的研究丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白对细胞p21基因转录、表达的影响。方法PCR扩增HCV 1b来源的F基因,克隆至pcDNA3.1真核表达载体。F基因质粒转染HepG2细胞,48h后抽提细胞总RNA和总蛋白,实时定量PCR及Western blot检测p21基因表达变化。结果HCV F蛋白在HepG2细胞内瞬时表达,相对于空载体对照(目标基因表达量为1),HCV F基因质粒转染细胞的p21转录水平为3.2,蛋白表达水平为1.4。结论HCVF蛋白增加p21转录和表达,其生物学效应值得进一步研究。     

形成丙型肝炎病毒负链复制体的相关蛋白的分析

目的：确定丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NS5B以及肝母细胞瘤株HepG2胞浆提取物中的宿主蛋白与HCV负链RNA3′末端的特异性结合作用。方法：用蛋白-核酸紫外交联试验分别检测NS5B以及HepG2胞浆提取物中的宿主蛋白与HCV负链RNA3′末端的结合作用，用非同源RNA和非同源蛋白作为竞争物分析这种结合的特异性。结果：NS5B以及宿主细胞内一约45ku的蛋白质（简称P45）均可与HCV负链RNA3′末端特异性结合。结论：NS5B和P45是HCV负链RNA3′末端复制体的两个成分。     

形成丙型肝炎病毒负链复制体的相关蛋白的分析

【目的】确定丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白NS5B以及肝母细胞瘤株HepG2胞浆提取物中的宿主蛋白与HCV负链RNA 3′末端的特异性结合作用。【方法】用蛋白 核酸紫外交联试验分别检测NS5B以及HepG2胞浆提取物中的宿主蛋白与HCV负链RNA 3′末端的结合作用 ,用非同源RNA和非同源蛋白作为竞争物分析这种结合的特异性。【结果】NS5B以及宿主细胞内一约 4 5ku的蛋白质 (简称P4 5 )均可与HCV负链RNA 3′末端特异性结合。【结论】NS5B和P4 5是HCV负链RNA 3′末端复制体的两个成分     

抑制丙型肝炎病毒 NS5A基因表达的shRNA系统的构建及意义

目的：构建抑制丙型肝炎病毒 NS5A基因(HCV NS5A)表达的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体系统,观察其对HCV NS5A蛋白表达的抑制作用。方法：根据HCV NS5A基因已知序列,设计3段19个碱基的HCV NS5A特异性靶序列,合成两对63 bp并含有编码shRNA序列的寡核苷酸,双链退火后,克隆到经过BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切后线性的pSilencer^TM 3.1-H1neo载体的H1启动子下游,重组构建RNA干扰(RNAi)质粒,进行电泳,将3个不同的RNAi质粒和阴性对照质粒分别与HCV NS5A真核表达质粒共转染正常肝细胞HL-7702细胞系,用Western  blotting印迹法鉴定 NS5A蛋白表达。结果：对重新构建的pSilencer^TM3.1-H1neoHCV  NS5A- R1、R2、R3质粒进行测序,与设计的序列完全相同;3个质粒电泳均在4　348 bp处出现特异性条带;Western blotting印迹法测得R1、R2和R3的 NS5A蛋白未见明显条带,阴性对照质粒 NS5A蛋白在相对分子质量5　600处出现条带。结论：设计合成的3个不同位点的63个碱基均成功插入到预计位点,并且序列完全正确,对HCV NS5A基因表达有特异性抑制作用。     

多配体聚糖结合蛋白1过表达增加低密度丙型肝炎病毒颗粒的产生

目的　探讨syntenin-1蛋白对丙型肝炎病毒（HCV）颗粒组装的影响。 方法　用免疫印迹法分析人原代肝细胞中syntenin-1的含量。用慢病毒转染质粒在人肝癌细胞系Huh7.5.1构建syntenin-1过表达细胞系和绿色荧光蛋白（GFP）过表达细胞系。采用电转法将HCV RNA转入细胞后,通过荧光素酶分析、免疫印迹分析和病毒滴度测定方法分别从RNA复制、病毒蛋白表达和感染性病毒颗粒的分泌方面检测syntenin-1过表达对HCV的影响。用密度梯度分析法检测HCV RNA和感染滴度在不同密度组份的分布情况。 结果　人原代肝细胞中syntenin-1含量与实验室常用的肝癌细胞系Huh7.5.1相比较高。Syntenin-1过表达不影响HCV RNA在宿主细胞中的复制;syntenin-1过表达细胞来源的HCV 病毒的感染性与Huh7.5.1细胞或GFP过表达细胞的对照组相比差异无统计意义;在syntenin-1过表达细胞培养上清液中的HCV感染性颗粒从主要集中在1.08～1.16 g/mL区域变为有部分转移到密度为1.01～1.02 g/mL的低密度区域。 结论　Syntenin-1过表达改变了HCV感染性颗粒的密度组份分布,从主要集中在1.08～1.16 g/mL区域变为有部分转移到密度为1.01～1.02 g/mL的低密度区域,在低密度区域出现了具有更高单位RNA感染能力的病毒颗粒。     

庚型肝炎病毒E2蛋白在转基因小鼠细胞内的定位及致病性研究

目的 :在已建成庚型肝炎病毒 (HGV)转基因小鼠模型的基础上 ,研究 HGV包膜蛋白 E2在转基因小鼠体内的表达及定位 ,并探讨 HGV在转基因小鼠体内是否引起病理学改变。 方法 :取小鼠的器官组织用免疫组织化学方法 ,以 HGV E2蛋白的单克隆抗体对 HGV包膜蛋白 E2的表达进行分析和定位。通过血清 AL T检测及常规病理学技术观察转基因小鼠不同器官的病理学变化。 结果 :免疫组织化学结果表明 ,HGV E2主要表达于转基因小鼠肝细胞膜 ,少量表达于胞质内 ;肾脏、心脏、肺及脾脏均未呈现 E2蛋白的阳性反应。组织病理学检查显示转基因小鼠的肝细胞出现水样变性、脂肪变性及淋巴细胞浸润等轻度炎性反应 ,这些变化不随年龄增长而加重 ;其他组织的病理学检查无异常。转基因小鼠血清转氨酶 AL T与对照小鼠无明显差异。 结论 :HGV包膜蛋白 E2的表达具有相对的嗜肝性 ,主要分布在转基因小鼠的肝细胞膜 ,并可引起轻度肝细胞损伤。     

丙型肝炎病毒整个开放阅读框序列的克隆及各组分蛋白的表达

目的 在痘苗系统中表达丙型肝炎病毒(HCV)各组分蛋白。方法 将编码HCV大前体蛋白的开放阅读框(ORF)序列克隆至痘苗启动子后，构建重组质粒pVHCV。重组质粒转染BHK21细胞后，再用痘苗病毒vTF7-3株感染，培养48h后收集细胞。Western blotting和免疫荧光技术鉴定HCV非结构蛋白NS3和NS5a的表达情况。结果 Western blotting结果表明，在细胞中检测到相对分子质量为70000(NS3)和58000(NS5a)的两条带；免疫荧光试验结果表明，无论采用抗NS3单抗还是抗NS5a单抗，大部分转染质粒细胞的细胞质中都具有较强的荧光反应。结论 HCV非结构蛋白NS3和NS5a在BHK21细胞中得到表达。     

L型电压门控钙通道α1C亚基羧基末端肽段真核表达载体的构建和表达

目的 构建增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)标记的L型电压门控钙通道(L-type voltage-gated calcium channels,L-VGCCs)α1C亚基羧基末端肽段(CT,1587-2169)的真核表达载体,并在COS-7细胞中表达.方法 采用RT-PCR方法扩增CT的cDNA,克隆至真核表达载体pcDNA3.1;采用PCR方法扩增标签蛋白EGFP的cDNA,克隆至重组体pcDNA3.1-CT,EGFP位于CT的羧基末端;采用脂质体转染法将重组体pcDNA3.1-CT-EGFP转染COS-7细胞,通过荧光显微镜和免疫印迹等方法检测重组体的表达.结果 扩增了CT和EGFP的cDNA;构建的pcDNA3.1-CT-EGFP真核表达载体经限制性内切酶酶切鉴定及测序分析证实了其序列的正确性;荧光显微镜下转染重组质粒的COS-7细胞中观察到绿色荧光,免疫印迹分析显示pcDNA3.1-CT-EGFP转染组有明显条带.结论 成功构建pcDNA3.1-CT-EGFP真核表达载体,并且在COS-7细胞中得到表达.     

丙型肝炎病毒整个开放阅读框序列的克隆及各组分蛋白的表达

目的在痘苗系统中表达丙型肝炎病毒(HCV)各组分蛋白。方法将编码HCV大前体蛋白的开放阅读框(ORF)序列克隆至痘苗启动子后,构建重组质粒pVHCV。重组质粒转染BHK21细胞后,再用痘苗病毒vTF7-3株感染,培养48 h后收集细胞。Western blotting和免疫荧光技术鉴定HCV非结构蛋白NS3和NS5a的表达情况。结果Western blotting结果表明,在细胞中检测到相对分子质量为70 000 (NS3)和58 000 (Ns5a)的两条带;免疫荧光试验结果表明,无论采用抗NS3 单抗还是抗NS5a 单抗,大部分转染质粒细胞的细胞质中都具有较强的荧光反应。结论HCV非结构蛋白NS3和NS5a在BHK21细胞中得到表达。     

Extrahepatic and Intrahepatic Replication and Expression of Hepatitis C Virus

HepatitisCvirus(HCV)isthemajorpathogenofpost--transfusionalhepatitiswithachroniccourseinupto60%ofindividuals,leadingtocirrhosisandeventuallytohepatocellularcarcinomain20%ofindividuals[1'2].HCVcontainsasingleplusstrandRNAwhichissimilartopestivirusandflavivirusingenomestructures.HCVRNAcanbedetectedinsera,livertissues,peripheralbloodmononuclearcells(PBMCs)andsalivaglandsbypolymerasechainreaction(PCR)assay['-'j.Inthisstudy,theinsituhybridizationandimmunohistochemicaltechniqueusingdigoxinla…     

HCV核心和截短的包膜蛋白E2基因在昆虫细胞中的表达及其抗原性

目的:构建含HCV全长核心基因和截短的包膜蛋白E2基因的重组杆状病毒表达载体,研究其表达和抗原性.方法:以含HCV全长cDNA克隆的pGEM-HCJ4质粒为模板,PCR扩增全长的HCV核心抗原基因和截短的E2基因片段,插入转座载体pFastBacHTa构建重组转座质粒pFB-CE2t,转化DH10Bac大肠杆菌,获得重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-CE2t,以之转染昆虫Sf 9细胞进行外源基因的表达,并对其抗原性进行ELISA检测.结果:SDS-PAGE和Western blot分析表明Bacmid-CE2t在Sf 9细胞表达了HCV C-E2蛋白,并能利用细胞内蛋白酶将其裂解为单独的C蛋白和截短的E2蛋白.纯化后的蛋白能分别与HCV C蛋白、E2蛋白单抗以及慢性丙型肝炎患者血清反应.结论:HCV核心蛋白和截短的E2蛋白在昆虫细胞中成功表达并具有抗原性.     

丙型肝炎患者血清中丙型肝炎病毒交叉中和抗体的检测

[摘要]目的分析HCV感染者血清中是否存在交叉反应性中和抗体。 方法以分泌表达HCV包膜E2蛋白真核表达质粒转染的293T 细胞培养上清液中的HCV E2蛋白作为检测抗原,建立检测HCV E2抗体的ELISA方法,检测32份HCV抗体阳性的慢性丙肝患者血清,然后用免疫荧光分析血清与HCV全长包膜蛋白表达质粒转染的293T细胞的结合反应,再用5株HCV假病毒(HCVpp)及两株细胞培养产生的HCV(HCVcc)为模型分析血清的病毒中和活性。 结果32份HCV抗体阳性血清中,26份血清可检测出E2抗体,阳性率81.3%。其中HCV RNA阳性的12份血清均为E2抗体阳性,E2抗体水平与HCV RNA水平负相关。HCV E2抗体阳性血清对5株HCVpp以及两株HCVcc的感染性均有不同程度的中和作用,中和活性与E2抗体水平相平行。结论HCV感染可诱导保护性体液免疫应答,丙肝患者血清中存在交叉中和抗体,提示开发能诱导广泛交叉中和抗体的丙肝疫苗具有可行性。     

Detection of hepatitis G virus RNA in hepatitis C patients and hepatitis C virus infected hemodialysis patients

AlthoughsensitiveandspecificimmunoassayandmolecularbiologicaltechniquesforthedetectionofthehepatitisA--Evirusesareavailable,theetiologyofasubstantialfractionofpost--transfusionandcommunity--acquiredhepatitiscasesremainsundefined[1],suggestingtheexistenceofadditionalcausativeagents.Anewhumanhepatitisviruswasisolatedbytwoindependentgroups.ThenewvirusisprovisionallydesignatedashepatitisGvirus(HGV)[ZJorGBvirusC(GBV~C)[3'4),whichwasthoughttobetheagentofpartofthenon--A--Ehepatitispatients.Fro…     

重组丙型肝炎病毒在7721细胞中的复制

目的 探讨构建的重组丙型肝炎病毒(HCV)能否在易感细胞系中复制和表达。方法 用人工构建的HCV感染易感细胞系7721,培养72h后利用RT-PCR检测HCV的RNA表达,并应用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察免疫荧光标记的HCV核心抗原和胞膜抗原E1在细胞中的表达。结果 人工构建的HCV感染7721细胞72h后,RT-PCR检测细胞内可检出HCV正链及负链RNA,细胞培养上清中可检出HCV正链RNA,CLSM检测HCV核心抗原和E1抗原在细胞内的分布呈胞浆型。结论 构建的HCV72h内可以在易感细胞系7721中复制和表达。     

体外培养人肝癌细胞系7721中HCV复制和表达特性

建立支持ＨＣＶ体外长期复制的细胞培养体系,研究其体外复制和表达特性。方法：将ＨＣＶ感染血清接种人肝癌细胞系７７２１后,以逆转录－聚合酶链反应、免疫组化、原位杂交检测细胞内ＨＣＶ的感染和复制情况。结果细胞内和培养上清中在孵育后的３月余均可间断地检测出ＨＣＶ正链和／或负链ＲＮＡ,多种ＨＣＶ抗原在细胞内能稳定有达;ＨＣＶ ＲＮＡ和抗原多位于胞浆中,结论ＨＣＶ在７７２１细胞系中的复制和表达与体内感染状态接     

乙型肝炎病毒X基因-丙型肝炎病毒C基因融合表达蛋白对肝癌细胞端粒酶活性的影响

目的建立HBV X-HCV C融合蛋白细胞表达模型,并探讨其对细胞端粒酶活性的影响.方法双酶切质粒pXT1-X,得到完整的HBV X基因片段后,将其插入到质粒PBK-CMV和PBK-HCV C的相应酶切位点,得到重组质粒PBK-X和PBK-X-C;再将质粒PBK-CMV、PBK-X、PBK-HCV C和PBK-X-C分别导入肝癌细胞株HepG2中,G418筛选,RT-PCR、蛋白印迹鉴定HBV X和HCV C蛋白表达.PCR-ELISA法检测端粒酶活性.结果质粒PBK-CMV、PBK-X、PBK-HCV C和PBK-X-C在HepG2细胞中有稳定表达.表达融合蛋白的细胞的端粒酶活性较转染空载体的细胞及单独表达HBV X、HCV C蛋白的细胞明显升高.结论HBV X-HCV C融合蛋白能显著上调端粒酶活性,提示HBV、HCV可能具有协同致癌作用.     

Hepatitis G viral RNA co-infection in plasma and peripheral blood mononuclear cells in patients with hepatitis C

Hepatitis G virus( HGV) is identified as a mem-ber of Flaviviridae family and is a single chain( )RNA virus.The transmission route of HGV is sameas that of hepatitis C virus( HCV) ,mainly thoughthe approaches of blood product use and intravenousinjection.Thus,HCV- HGV co- infection becomespossible.There has been domestic report about de-tecting HGV RNA in serum of hepatitis C,but notdetecting it in peripheral blood mononuclear cells( PBMCs) simultaneously.Therefore,some patients…     

维拉帕米通过下调硫氧还蛋白互作蛋白的表达抑制丙型肝炎病毒感染

目的 探讨抗高血压药维拉帕米是否可通过下调宿主硫氧还蛋白互作蛋白(TXNIP)的表达而抑制丙型肝炎病毒(HCV)的感染.方法 用不同浓度梯度的维拉帕米处理人肝癌细胞系Huh7.5.1,用qPCR和蛋白质印迹法检测TXNIP的表达.用维拉帕米处理Huh7.5.1细胞,同时加入细胞培养产生的HCV (HCVcc),48 h后检测HCVcc感染情况.用TXNIP siRNA转染Huh7.5.1细胞,检测下调TXNIP表达后,维拉帕米对HCVcc感染的影响;用TXNIP启动子调控的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因表达质粒(pTXNIP-EGFP)转染Huh7.5.1细胞,分析维拉帕米对TXNIP启动子转录活性的影响.结果 与对照孔相比,维拉帕米(100、200、400 μmol/L)可下调Huh7.5.1细胞中TXNIP的表达,并呈现浓度依赖性(P＜0.05);并可抑制HCVcc对Huh7.5.1细胞的感染,且浓度越高抑制作用越明显(P＜0.05).进一步研究结果显示,与对照组相比,维拉帕米能够抑制pTXNIP-EGFP转染细胞中EGFP的表达水平(P＜0.05).结论 维拉帕米可下调TXNIP的表达从而抑制HCV感染,这可能是通过抑制TXNIP启动子的转录活性来实现的.