非克隆cDNA文库与RACE技术克隆小剂量辐射诱导新基因RIG1

目的：在获得了低剂量辐射诱导新基因RIG1EST片段的基础上,简便、有效地获得其全长cDNA,进行下一步的基因功能研究。方法：结合应用非克隆cDNA文库技术及7增强RACE技术,设计了巢式RACE PCR、生物素磁性分离、生物素标记探针杂交,再次磁性分离的纯化流程,结果：成功地克隆到RIG1EST片段3′端约1kb的序列,该序列3′端具有明显的polyA加尾信号,有编码区的终止密码子。进一步的分析明确了RIG1EST的正、负链及其蛋白编码方法。为RIG1 5′端的克隆提供了大量可靠的信息,目前RIG1 5′端的克隆已得到很好的进展。结论：所得结果与我们的设计完全一致,说明这一技术路线是简单可行的,为下一步研究RIG1基因在细胞辐射应激反应中的功能及被辐射诱导表达的调控模式奠定了基础。     

一低剂量辐射诱导新基因的转录调控和初步功能分析

目的：克隆低剂量辐射诱导基因，研究辐射对其转录调控作用和生物学功能。方法：用mRNA差异显示技术分离辐射诱导表达基因，用RACE技术获取cDNA旁侧序列，Northern杂交分析基因的转录调节，生物信息学分析基因的结构和功能。结果：获得包括3'端在内的辐射诱导新基因LRIGx的cDNA片段，序列同源性比较显示与人染色体20ql 1.2-12一段DNA高度同源（＞99％），Northern杂交结果揭示该基因转录子全长约8．5kb，在0．2Gy照射后2h出现诱导表达，4h后转录子水平为对照细胞的5倍多，也受0．02Gy更低剂量照射诱导表达，2Gy大剂量照射后1h出现短暂诱导表达，但不如低量照射明显，2h后恢复正常水平，生物信息学分析结果显示该基因编码产物含有解旋酶活性保守区，结论：分离鉴定出一低剂量辐射反应基因，其编码蛋白可能参与DNA代谢（如修复）等细胞辐射反应过程。     

辐射诱导基因的寻找及功能研究

辐射诱导基因的启动与表达引起细胞辐射反应 ,若ＤＮＡ损伤后 ,细胞中的感应分子作用于辐射诱导基因或其产物 ,从而进行周期调控 ,启动损伤修复或细胞凋亡。对辐射诱导基因的研究 ,有利于揭示细胞辐射反应的分子生物学机理 ,对细胞增殖、周期调控、癌变等的研究也提供了新的途径。随着人类基因组计划的日趋完成和蛋白组计划的提出和蓬勃兴起 ,在辐射诱导新基因的寻找、定位及其功能研究方面涌现出了许多新技术、新方法。本文作者对近年来的一些方法和技术作一综述。一、辐射诱导基因的寻找与识别1 以差异显示为基础的方法 :有ＤＤＲＴ ＰＣ…     

射线诱导PIRES-Egr-1-IFN-γ在小鼠体内的表达

电离辐射可迅速诱导细胞中早期生长反应（Egr-1）基因的表达，Egr-1基因启动子含有6个CArG元件，电离辐射通过细胞产生活性氧自由基作用于CArG元件诱导Egr-1的表达，用Egr-1启动子经辐射可诱导下游基因的超强表达。根据Egr-1的辐射诱导特性，利用Egr-1启动子区的顺式作用元件以及调节免疫的基因来构建辐射诱导表达调控系统，以实现肿瘤的基因治疗联合放射治疗，又称基因．放射治疗是近年提出的肿瘤治疗新思路。本研究初步探讨放疗诱导Egr-1启动的IFN-γ了基因（PIRES-Egr-1-IFN-γ质粒）在小鼠体内表达的时效和量效关系，为基因．放射治疗的临床应用提供依据。     

辐射诱导的野生型及突变型PTEN基因重组质粒的构建及鉴定

目的构建辐射诱导人野生型及突变型PTEN基因重组质粒并进行鉴定。方法以HeLa细胞总DNA为模板PCR扩增Egr-1基因启动子辐射敏感区,将PCR产物分别定向插入携带野生型PTEN和突变型PTEN蛋白编码基因的表达载体pEGFP-PTEN和pEGFP-PTEN-G129E启动子区,构建具有辐射诱导能力的重组表达质粒pEgr-PTEN和pEgr-PTEN-G129E。同时,将Egr-1基因启动子辐射敏感区亚克隆入pGL3-Promoter载体中,通过荧光素酶报告实验,验证不同照射剂量、照射后不同时间点下人肝癌SMMC-7721细胞中Egr-1启动子区对X线照射的辐射诱导能力。Western印迹检测X线照射对PTEN蛋白表达的影响。结果凝胶电泳分析证实,PCR扩增出Egr-1基因启动子辐射敏感区,构建出具有辐射诱导能力的重组表达质粒pEgr-PTEN和pEgr-PTEN-G129E,经不同酶切实验均证实含有与Egr-1辐射诱导区和PTEN基因相同片段大小的条带。荧光素酶报告实验证实,在不同时间点和不同照射剂量照射下,含Egr-1启动子区报告质粒细胞组的荧光素酶活性均明显高于转染空载体细胞,Western印迹检测表明,转染了pEgr-PTEN和pEgr-PTEN-G129E的细胞组在未接受照射时PTEN蛋白的表达量极低,但在接受8 Gy的X线照射后,PTEN蛋白的表达量明显提高,高于转染了pEGFP-PTEN和pEGFP-PTEN-G129E的细胞。结论成功构建了具有辐射诱导能力的含人野生型及突变型PTEN基因的重组质粒,为今后肿瘤的治疗奠定了基础。     

小鼠β-酪蛋白基因的克隆及序列分析

目的：从129Sv小鼠基因组文库中分离克隆β－酪蛋白基因。方法：PCR方法扩增部分β－酪蛋白基因作为探针，用原位杂交和PCR方法从小鼠基因组文库中分离克隆β－酪蛋白基因。结果和结论：通过3轮原位杂交分析，获得了包括小鼠β－酪蛋白全长基因在内的阳性克隆，为进一步构建乳腺特异表达基因打靶载体创造了条件。     

低剂量辐射诱导小鼠睾丸生精细胞凋亡的适应性反应

目的：研究低剂量辐射诱导小鼠睾丸生精细胞凋亡的适应性反应。方法：应用原位末端标记（TUNEL）和常规HE染色法分别结合光镜定量地观察75mGyX射线照射诱导小鼠睾丸生精细胞在生精周期中凋亡的适应性反应。结果：当1．0、2．0或3．0Gy（攻击剂量，D2）X射线照射前6h给予75mGy（诱导剂量，D1）预照射时明显减轻D2对睾丸精原细胞和精母细胞的凋亡损伤作用，而对精子细胞影响不明显，当1．0、1．5、2．0、2．5、3．0Gy（D2）X射线照射前3、6、12、24h给予75mGy（D1）预照射时，发现当D2剂量较小（1．0、1．5、2．0Gy）时，精原细胞和精母细胞的凋亡百分率减少出现较早，较明显，而且持续时间较长；反之，当D2剂量较大（2．5和3．0Gy）时，精原细胞和精母细胞的凋亡百分率减少只有照后6h）出现，而且不显著。结论：低剂量电离辐射可以诱导精原细胞和精母细胞凋亡的适应性反应，并与D1和D2间隔时间及D2剂量有关。     

抑制差减杂交筛选辐射致癌差异表达基因

目的筛选研究辐射诱发小鼠肿瘤相关差异表达基因。方法以^60Coγ射线照射诱发的小鼠白血病动物模型为研究对象，采用抑制差减杂交技术构建辐射致癌差异表达基因cDNA文库，鉴定后挑取阳性克隆测序，并与GeneBank数据库进行同源性比对分析。结果抑制差减杂交筛选得到102个阳性克隆，随机挑选30个克隆进行菌液PCR，扩增得到28个特异性插入片段，DNA测序结果经与GeneBank数据库比对发现代表了24个已知基因，其中3个为重复检出基因，暂未发现有未知序列基因。结论成功建立辐射致癌差异表达基因cDNA文库，初步筛选获得24条表达上调的差异片段，该结果将有助于充实完善辐射致癌的分子机制。     

Egr—1基因的辐射生物学效应研究进展

Egr-1（early growth response-1）基因是一系列“立即早期基因（immediate early gene）”之一，参与细胞的多种辐射生物效应。研究表明，Egr－1在多种正常细胞和肿瘤细胞受到电脑辐射后的早期就能被激活，它的激活表达与辐照后细胞的生长、周期、凋亡等的改变密切相关。另外，Egr-1基因调控序列具有辐射可诱导特性，这一特点使其具有潜在的临床和基因工程生产应用前景。     

我国登革2型病毒株NS1基因的克隆与表达

目的：通过对登革病毒ＮＳ１基因的表达,研究表达的ＮＳ１蛋白的抗原性,为研制新型登革疫苗提供依据。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ和分子克隆技术将扩增的ＮＳ１基因插入到ｐＢＶ２２０载体中,通过温控诱导进行外源蛋白的表达,用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和蛋白质印迹法分别测定表达产物的相对分子质量及特异性。结果：获得正向插入的ＮＳ１－ｐＢＶ２２０重组质普,表达产物的相对分子质量约为５１０００,与预期大小一致,并且可与登革２型     

整体原位杂交研究mCcd1在小鼠胚胎发育过程中的表达

目的：研究mCcdl新基因在小鼠胚胎发育过程中的基因表达，为其功能研究提供线索。方法：用地高辛标记mCcd1 RNA探针，对E9～E11．5小鼠整体胚胎进行原位杂交，检测胚胎发育过程中基因的表达。结果：在E9～E11．5都有不同程度的表达，E9和E10．5全身都表达，但表达量低。在E11．5的小鼠胚胎开始神经特异性表达，在中脑、眼原基、端脑、菱脑、问脑和脊髓观察到清晰的杂交信号。结论：mCcd1在胚胎发育过程中的表达有阶段性，在E9和E10．5广泛表达，而在E11．5该基因表现出神经系统特异性表达，这些提示它可能参与了神经系统的发育。     

宫颈癌中转移相关基因MTA1高表达的临床意义及其协同表达基因的生物信息学分析

目的 分析转移相关基因MTA1高表达与宫颈癌临床转移的相关性,并筛选MTA1协同表达基因网络中的潜在干预靶点基因.方法 应用SPSS软件分析TCGA-CESC数据集中MTA1与宫颈癌转移和病理分级的相关性,应用edgeR软件分析该数据集中MTA1高表达组与低表达组的全转录组差异表达基因,应用DAVID平台对这些差异表达基因进行聚类分析,应用STRING在线平台和Cytospace软件对这些基因进行互作网络分析,筛选关键的网络节点基因.结果 TCGA-CESC宫颈癌数据库中MTA1表达水平与肿瘤临床转移和病理分级呈显著正相关(P＜o.o1),在不同MTA1表达水平的宫颈癌转录组中存在显著且较一致的差异表达基因集,这些基因主要聚集在癌症通路、干细胞通路、细胞转移、细胞分化等方面,与肿瘤的恶性生物学行为显著相关.基因筛选显示,宫颈癌中与MTA1协同表达的Agt、Acta1、Fpr2、Pmch和RGS18等基因是差异表达基因集中最重要的节点基因,这些基因聚集在GPCR相关通路.结论 MTA1高表达与宫颈癌转移显著相关,且与肿瘤细胞的干细胞通路、趋化因子受体通路、细胞转移、细胞分化等基因调控网络活化相关.MTA1的协同表达基因网络中的节点基因可能参与了宫颈癌的转移调控,并最有可能成为宫颈癌治疗的分子靶点.     

亚细胞定位及信号转导检测技术在hrnt_1基因功能研究中的应用

目的 :hrnt_1是本实验室克隆的全长基因 ,GenBankNr库中编号为AF2 2 3393。实验证实该基因与支气管上皮细胞恶性转化相关 ,但具体的生物学功能尚不清楚。本研究旨在建立一种功能研究的方法 ,为探索hrnt_1在细胞恶性转化过程中的生物学功能提供线索。方法 :构建hrnt_1与pEGFP荧光素表达载体 ,通过融合蛋白的表达 ,观察hrnt_1基因产物在细胞中的位置分布 ;利用信号通路检测技术 ,观测hrnt_1对细胞内信号转导通路的影响。结果 :hrnt_1产物主要分布在细胞核中 ,对Myc Max,GR ,NFκB ,EIK_1 STAT等核转录因子活性有上调作用。结论 :细胞定位与信号通路检测技术相结合的方法简便、快速 ,适用于新的疾病基因功能研究。     

乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活蛋白5基因的克隆化研究

目的克隆乙型肝炎病毒（HBV）前-S1蛋白反式激活新基因PS1TP5的cDNA,并应用生物信息学技术初步探讨其结构及功能。方法应用聚合酶链反应（PCR）技术以HepG2细胞的cDNA为模板扩增PSlTP5,以pGEM-T载体进行TA克隆,通过PCR、限制性酶切分析及测序进行鉴定,再将其亚克隆到真核表达载体pcDNA^TM 3．1／myc-His A,通过PCR、限制性酶切分析进行鉴定,并应用生物信息学技术初步分析其物理化学性质、蛋白质结构和功能。结果PCR成功扩增出PS1TP5基因,并将其分别克隆进pGEM-T和pcDNA^TM3．1／myc-HisA载体,经PCR、限制性酶切鉴定后测序证实。因其可以被前-S1蛋白反式激活,故命名为前-S1反式激活蛋白5（PS1TP5）,已在GenBank中注册,注册号：AY427953。生物信息学分析确定其ORF为438个核苷酸（nt）,编码产物为145个氨基酸残基（aa）。结论发现了HBV前-S1蛋白反式激活新基因PS1TP5,构建了pcDNA^TM 3．1／myc-His A真核表达载体,为进一步研究其生物学功能及慢性乙型肝炎发病机制创造了条件。     

白细胞介素1在多效生长因子对Schlafen2基因负性调控中的作用

目的:在多效生长因子(pleiotrophin,Ptn)基因稳定沉默的小鼠胚胎成纤维细胞Ptn-siRNA B/MEF241中,研究白细胞介素1(interleukin-1,IL-1)在多效生长因子对Schlafen2(Slfn2)基因负性调控中发挥的作用. 方法:本研究用Ptn-siRNA B/MEF241细胞的培养液培养对照NC细胞不同时间,通过Northern杂交检测NC细胞中Slfn2表达水平变化;应用RT-PCR和Western印迹检测外源性PTN因子(终浓度50 ng/μl)作用对Ptn沉默细胞内IL-1表达水平的影响;分别使用重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhIL-1ra)和IL-1α中和抗体阻断IL-1的作用通路,检测Ptn稳定沉默细胞中Slfn2基因表达变化.结果:Ptn沉默细胞培养液可以诱导对照细胞Slfn2表达;外源性PTN能抑制沉默细胞中IL-1α和IL-1f6的表达;IL-1受体拮抗剂(rhIL-1ra) 和IL-1α中和抗体可抑制Ptn沉默细胞中Slfn2表达.结论:Ptn可能部分通过分泌性的细胞因子间接调控Slfn2基因表达,并且鉴定出在此调控过程中IL-1家族是其中一种非常重要的调控因子.     

人LDLR基因的克隆及在Hepa1-6细胞中的表达

目的 :从能感染HCV的人肝癌细胞HepG2中克隆出人LDLR基因 ,构建其真核表达质粒 ,并在小鼠肝癌细胞Hepa1 6中进行表达。方法 :从HepG2中提取总RNA ,采取逆转录PCR(RT PCR)方法得到人LDLR的cDNA。将获得的人LDLR基因克隆到真核表达载体pcDNA3中 ,进行酶切和序列鉴定。将重组质粒pcDNA3 hLDLR和空载体转入Hepa1 6 ,G4 18筛选 ,并用RT PCR和FACS检测人LDLR基因转录和蛋白的表达。结果 :人LDLR的cDNA已插入载体pcDNA3构建成真核表达质粒pcDNA3 hLDLR ,双酶切和测序表明 ,克隆的人LDLR与已登录GenBank的序列存在核苷酸多态性 ,但编码的氨基酸序列完全一致 ,该序列的GenBank登录号为gi|2 16 2 96 4 7|gb|AY114 15 5 .1,并且真核表达质粒的构建正确。用脂质体介导的方法转入Hepa1 6后 ,用RT PCR和FACS检测表明 ,细胞可表达人LDLR。结论 :成功地构建了真核表达质粒pcDNA3 hLDLR ,为进一步研究HCV和人LDLR的相互作用 ,以及建立可能的HCV细胞感染模型奠定了基础。     

噬菌体表面展示技术筛选乙型肝炎病毒前S1蛋白结合蛋白基因

目的 以乙型肝炎病毒(HBV)前s1蛋白为靶蛋白,寻找其相应的结合蛋白。方法 应用T7 cDNA文库噬菌体展示技术克隆与前s1蛋白具有结合作用的蛋白序列,命名为前s1结合蛋白(PreS1BP)。将推断的氨基酸序列在蛋白质库中进行搜索,自GenBank中获得结合蛋白的cDNA和基因组的全长序列。结果 初步确定PreS1BP即为神经胶质瘤抑制基因区候选基因2(GLTSCR2),cDNA长为1436核苷酸,基因位于第19号染色体长臂13.3区(19q13.3),长度11445碱基对(bp),位于19号染色体10403483～10414989,PreS1BP基因含有13个外显子,具有12个内含子。结论 应用T7 cDNA文库噬菌体展示技术和生物信息学方法获得了HBV PreS1BP基因。