重组免疫毒素hlL-2-Luffin P1的构建及表达

目的构建人分泌型IL-2与免疫毒素Luffin P1的重组基因原核表达载体,并对其产物进行鉴定及纯化.方法采用基因工程原理,将IL-2-Luffin P1的重组基因片段克隆入表达载体pET20b( )中,经酶切及DNA序列测定鉴定正确,转化表达宿主菌Origami(DE3)pLysS中,经IPTG诱导表达含His标签的融合蛋白-重组免疫毒素hlL-2-Luffin P1.结果成功构建了免疫毒素表达载体pET20b( )-hIL-2-Luffin P1,获得纯化的重组免疫毒素,并经Western blot鉴定正确.结论hIL-2-Luffin P1的成功构建,为进一步研究它在抗移植排斥中的作用奠定了基础.     

苦瓜核糖体失活蛋白MAP30的原核表达和生物活性研究

目的:从苦瓜籽中克隆HIV-1整合酶抑制剂MAP30,构建其表达载体,并在大肠杆菌中进行表达,用于MAP30在细胞内的转运机理研究.方法:从成熟苦瓜种子中提取基因组DNA,通过PCR的方法扩增出MAP30基因的全长,并将其克隆进入原核表达载体pET-30a,转化Eoli.BL21(DE3),IPTG诱导表达,Ni-NTA亲和纯化,梯度咪唑洗脱.MTT法分析生物学活性.结果:测序发现插入的MAP30基因序列正确,SDS-PAGE鉴定表达产物分子量正确,且MAP30主要以可溶形式表达.MTT法测定重组的MAP30具有生物学活性,且对肿瘤细胞的毒性远远大于对正常细胞的毒性.结论:本研究成功地构建了MAP30的表达系统,并实现了MAP30的可溶性表达,表达后的蛋白具有生物学活性,可用于抗体-毒素的肿瘤靶向药物的合成.     

核糖体失活蛋白及其在生物医学领域的应用与研究进展

核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating proteins,RIPs)是一类具有特殊生物毒性的蛋白。它具有N-糖苷酶活性,可以灭活真核细胞的核糖体,使其蛋白质的生成受阻,从而导致细胞死亡[1]。具体来说,RIPs因其具有N-糖苷酶活性,能够作用于真核生物28S核糖体RNA大亚基上的茎环节构顶部GA4324GA的普遍保守的S/R区域,通过脱嘌呤作用,阻滞了     

苦瓜核糖体失活蛋白的研究

综述了苦瓜核糖体失活蛋白的分离纯化、理化性质、作用机理和方式，并对该蛋白的应用前景作了展望。     

丝瓜籽核糖体失活蛋白luffin-a基因的克隆和表达

目的:从丝瓜籽中克隆HIV整合酶抑制剂luffin-a基因,并构建其表达载体.方法:根据报道的cDNA序列,用RT-PCR的方法从未成熟的丝瓜籽中克隆luffin-a基因,T-A克隆后鉴定核苷酸序列.构建表达载体pET-44a( )-luffin-a,转化大肠杆菌BL21(DE3),并经IPTG诱导表达.用透析法对包含体复性;SDS-PAGE鉴定luffin-a表达产物,用MTT法分析其生物学活性.结果:克隆的luffin-a基因与国外报道的核苷酸序列同源性为99.73%,其所编码的氨基酸序列完全一致.经SDS-PAGE分析:luffin-a主要存在于包含体中.MTT法测定:复性后蛋白具有与蓖麻毒素A链相似的细胞毒性.结论:本研究成功地构建了luffin-a的表达系统,所表达蛋白经复性后具有生物学活性.     

丝瓜籽核糖体失活蛋白基因Lufiin-a

目的探讨丝瓜籽核糖体失活蛋白基因Luffin—a原核表达载体的构建方法。方法从Pubmed中查到Luffin—a的mRNA全序列,用RT—PCR的方法从未成熟的丝瓜种子中克隆Luffin—a基因,T—A克隆后鉴定核苷酸序列,构建原核表达载体pET-15b（＋）-Luffin—a,转化大肠杆菌BL21（DE3）,并经IPTG诱导表达;SDS-PAGE鉴定Luffin—a表达产物。结果克隆出Luffin—a基因,IPTG诱导后大肠杆菌培养液和超声破碎的菌体沉淀中都有Luffin—a表达产物。结论本研究成功构建了Luffin—a原核表达载体。     

苦瓜核糖体失活蛋白广泛的生物学功能

核糖体失活蛋白（ribosomal inactivating proteins,RIPs）广泛存在于植物界,目前已从350余种植物中筛选到110多种RIPs,少数细菌和真菌中也分离出了RIPs。苦瓜RIPs是从苦瓜籽或果肉中分离纯化得到的碱性蛋白质,具有抗病毒、抗肿瘤、抗细菌及真菌和抗生育等广泛生物活性,其中因其抗HIV等病毒及抗肿瘤作用而受到广泛关注和研究,现就苦瓜RIPs的生物学功能作一总结。     

抗核糖体P蛋白抗体对系统性红斑狼疮的临床意义

目的探讨抗核糖体P蛋白抗体（ARPA）在检测系统性红斑狼疮（SLE）中的临床意义，了解其与SLE以及与其他自身抗体的关系。方法用酶免疫斑点（条带）实验检测SLE患者、其他风湿性疾病对照组（包括干燥综合征，多发性肌炎，进行性硬化征，皮肌炎，类风湿性关节炎和强直性脊柱炎）和正常对照组血清中ARPA的阳性率；分析ARPA与它们的关系。结果SLE患者血清中的ARPA阳性率显著高于其他风湿性疾病对照组和正常对照组（P〈0．05）。ARPA阳性组中神经系统损害和关节炎的发病率明显高于ARPA阴性组（P〈0、05）。ARPA的表达与抗SSA、抗SSB和抗nRNP抗体表达相关（P〈0．05）。而与ANA、抗dsDNA和抗sm抗体的相关性不强（P〉0．05）。结论ARPA是SLE血清学诊断的一个重要指标，它与SLE的神经系统损伤和关节炎的发病有关；与抗SSA、抗SSB和抗nRNP具有相关性，联合检测能对SLE的诊断提供重要依据。     

食管鳞状细胞癌中细胞周期素 D1和 P16蛋白的表达及意义

目的：探讨食管鳞状细胞癌中周期素D1（CyclinD1）和P16蛋白的表达及其临床意义。方法采用免疫组织化学法及Western blot方法检测食管鳞状细胞癌组织及食管正常黏膜组织中CyclinD1及P16蛋白表达水平,并分析其与临床病理学指标之间的关系,探讨食管鳞状细胞癌组织中CyclinD1与P16蛋白表达的相关性。结果免疫组化显示,CyclinD1在食管癌组织中的阳性表达率高于食管正常黏膜组织（P＜0.05）,P16在食管癌组织中的阳性表达率低于食管正常黏膜组织（ P＜0.05）。 Western blot 检测结果显示,食管癌组织中CyclinD1蛋白表达量明显高于食管正常黏膜组织（P＜0.05）,P16蛋白表达量明显低于食管正常黏膜组织（P＜0.05）。 CyclinD1的表达与肿瘤浸润深度、是否淋巴结转移、肿瘤分化程度有关（P＜0.05）,P16的表达与是否淋巴结转移有关（P＜0.05）。食管癌组织中CyclinD1与P16蛋白表达之间无明显相关性（P＞0.05）。结论检测CyclinD1和P16蛋白表达有望作为评估食管鳞状细胞癌生物学行为和预后的参考指标。     

P15、P27和Bcl-2在人食管鳞状细胞癌中的表达及其临床意义

目的探讨人食管鳞状细胞癌组织P15、P27和Bcl-2的表达及其临床意义。方法用免疫组化及Westernblot方法检测人食管鳞癌组织中P15、P27和Bcl-2的表达,结合病例随访资料分析其临床意义。结果 48例食管鳞癌病例获得完整随访资料,鳞癌组织中Bcl-2的表达（90.5%）明显高于癌旁正常组织（6.3%）（P〈0.05）;高分化鳞状细胞癌组织中Bcl-2的表达（80%）明显低于低分化鳞癌（91.7%）（P〈0.05）;在有淋巴结转移的鳞癌中Bcl-2的表达（100%）明显高于无淋巴结转移鳞癌（83.3%）（P〈0.05）。P15、P27在人食管鳞状细胞癌组织中的表达显著低于癌旁正常黏膜组织（P〈0.05）,而在高级别上皮内瘤变中P15、P27的表达就明显降低（P〈0.05）。结论 P15、P27和Bcl-2的表达与人食管鳞癌的发生及进展有一定相关性;P15、P27表达的降低为食管鳞癌发生的早期事件,检测P15、P27和Bcl-2的表达对人食管鳞癌的早期诊断、判断预后有参考价值。     

hSesn1基因真核表达载体构建及蛋白的表达和定位

目的 构建人源的Sesn1真核表达载体同时检测融合蛋白在COS-7细胞系内的表达和定位。方法 提取工具细胞系HeLa的mRNA,进而反转录成为cDNA。聚合酶链反应方法扩增人源Sesn1基因的cDNA全长片段,将其克隆于pEGFP-C1真核表达载体中。进一步将已构建好的重组表达载体进行双酶切以及测序鉴定,继而转染到工具细胞系COS-7中,进行Western blot方法检测。最后应用激光共聚焦扫描显微镜方法来观察pEGFP-hSesn1在COS-7细胞中的定位情况。结果 hSesn1基因cDNA全长片段克隆至pEGFP-C1真核表达载体中,酶切鉴定片段大小为1479bp,测序证实成功。Western blot方法检测出GFP-hSesn1融合蛋白的成功表达,分子质量（Mr）约为80kDa。pEGFP-hSesn1在COS-7于细胞中主要定位在细胞质及核周。结论 成功构建了pEGFP-hSesn1真核表达载体,进而检测到融合蛋白的表达,并且在COS-7细胞中主要定位于核周及细胞质。     

hBMP9在人骨肉瘤细胞株MG63、U2OS和143B中的内源性表达

目的:研究人骨形态发生蛋白(Human bone morphogenetie protein,hBMP)9在人骨肉瘤细胞株MG63、U2OS和143B中的内源性表达,为下一步研究hBMP9对骨肉瘤的体内外作用奠定实验基础.方法:利用免疫细胞化学法和Western blot法检测hBMP9在人骨肉瘤细胞株MG63、U2OS和143B中的内源性表达.结果:在MG63、U2OS和143B中,hBMP9均呈不同程度的阳性表达,并且两种检测方法所得结果一致.结论:hBMP9在人骨肉瘤细胞株MG63、U2OS和143B中均有内源性表达.     

MCP-1在子宫内膜异位症在位内膜的表达

目的探讨MCP-1在子宫内膜异位症(EMT)患者的在位子宫内膜中的表达水平及其在内异症发病中的作用。方法 2008年5月～2009年5月在南通大学附属医院妇产科以正常子宫内膜为对照,采用免疫荧光方法与Western blot分析内异症患者在位内膜的表达水平,并比较其差异。结果 1)免疫荧光检测结果:MCP-1在内膜腺体和间质细胞中均有表达,主要定位于内膜腺体的腺泡浆。正常子宫内膜分泌期MCP-1的表达(16.1826±3.0363)与其增生期(14.7431±2.0946)相比,组间比较无显著性差异(P>0.05);内异症在位内膜分泌期MCP-1的表达(51.0695±5.3293)高于其增生期(30.0012±4.3439),组间比较存在显著性差异(P<0.01);内异症在位内膜MCP-1的表达高于正常子宫内膜(P<0.01)。2)Western blot结果显示:正常子宫内膜分泌期MCP-1的表达(0.36788±0.02522)与其增生期(0.35678±0.02984)相比,组间比较无显著性差异(P>0.05);内异症在位内膜分泌期MCP-1的表达(1.06894±0.10542)高于其增生期(0.53686±0.02303),组间比较存在显著性差异(P<0.01);内异症在位内膜MCP-1的表达高于正常子宫内膜(P<0.05)。结论 MCP-1可能在子宫内膜异位症的病变中起重要作用。     

S1P1真核表达载体的构建及在HEK293细胞膜上的表达

目的构建含人Ⅰ型1-磷酸鞘氨醇受体(SIPI)-全长cDNA序列及HA和/或EGFP标签的真核表达载体,并观察其在HEK293细胞上的表达。方法合成2条HA寡核苷酸,克隆入S1P1-Myc-EGFP-N1载体。以HA-S1P1-Myc-EGFP-N1为模板,用PCR的方法扩增HA-S1P1并克隆入pcDNA3.1(+)载体。限制性酶切消化、PCR、测序的方法鉴定,载体经Polyfect转染入HEK293细胞。G418筛选出稳定细胞株。用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测S1P1在HEK293细胞上的表达。结果限制性酶切消化、PCR、测序结果证实载体构建成功。S1P1表达在HEK293稳定细胞株的表面。结论成功构建带有HA和/或EGFP标签的S1P1真核表达载体,表面表达S1P1的HEK293稳定细胞株可作为我们进一步研究的细胞模型。     

EphA2受体及其配体在浆液性卵巢癌中的表达及其临床意义

目的 探讨浆液性卵巢癌组织中EphA2及其配体EphrinA-1的蛋白表达、定位及其与临床病理学因素及生存的关系.方法 应用免疫组织化学方法 检测浆液性卵巢癌组织中EphA2及其配体EphrinA-1的蛋白表达、定位,并应用免疫组织化学方法 、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot分析方法 联合...     

窖蛋白-1在肺腺癌A549细胞凋亡中的作用及其分子机制

目的 探讨窖蛋白1（caveolin-1,Cav-1）在肺腺癌A549细胞凋亡中的作用及其分子机制。方法 体外培养A549细胞,100nM星形孢菌素（staurosporine,STS）处理6、12和24h后,流式细胞术检测STS处理后细胞周期的改变和凋亡率,Westernblot方法检测STS诱导细胞凋亡过程中Cav-1、caspase-3、PI3K蛋白表达的变化。结果FACS检测显示100nMSTS作用后,出现G2/M阻滞和细胞凋亡,促凋亡作用于用药后6h出现,持续至24h,G2/M阻滞的作用在12h达到峰值,凋亡率在24h达到峰值。Westernblot结果显示经100nMSTS处理A549细胞6、12和24h后,Cav-1蛋白含量逐渐增加,组间比较差异均有统计学意义（P＜0.01）;caspase-3蛋白显示32kDa和17kDa条带,caspase-3含量逐渐增加,与对照组相比,STS处理12h和24h后,差异有统计学意义（P＜0.01）;PI3K含量逐渐下降,与对照组相比,差异均有统计学意义（P＜0.05）。采用caspase-3的抑制剂能阻止STS诱导的细胞凋亡。结论Cav-1在STS诱导的A549细胞凋亡中起正调控作用。     

人VEGF基因杆状病毒表达载体的构建及生物学活性鉴定

目的构建含人血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因的杆状病毒表达载体,并对其表达产物的生物学活性进行测定。方法用HindⅢ对pcDNA3.1/VEGF进行酶切,回收575 bp的VEGF片段;pFast a载体用HindⅢ酶切回收,与VEGF片段连接。NcoI酶切鉴定方向,得到正向连接重组载体pFast/VEGF;将其转化DH10BAC感受态细胞,经卡那霉素、四环霉素、庆大霉素及蓝白斑筛选得到重组杆状病毒载体pBacmid-Fa-VEGF,PCR扩增鉴定得到单一VEGF条带。将该病毒载体转染sf9细胞,用噬斑筛选及SDS-PAGE和Western blot检测VEGF表达,并通过MTT法检测VEGF促内皮细胞生长活性。结果病毒液在稀释到10-7时出现噬斑,Western blot检测出现单一条带,MTT检测促内皮细胞生长率为19.44%。结论成功构建了含VEGF基因的杆状病毒表达载体,且表达产物具有显著的促内皮细胞生长作用。     

P16MTS1、P27KIP1基因在胆管癌组织中的表达研究

目的：探讨P16^MIS1,P27^KIP1基因与胆管癌临床病理的关系。方法：采用免疫组化方法，检测48例胆管癌和8例伴慢性炎症的胆管壁组织中P16^MIS1,P27^KIP1蛋白表达情况。结果：（1）胆管癌中P16^MIS1,P27^KIP1阳性表达率分别为47．9％和35．4％，而伴炎症的胆管组织阳性表达率为100％和87．5％；（2）P16^MIS1,P27KIP1蛋白表达与胆管癌的分化程度，有无淋巴结或远处转移以及临床分期呈显著相关性。结论：P16^MIS1,P27^KIP1多基因表达异常可能与胆管癌的发生发展有关，是衡量胆管癌预后的有用指标。