RNA干扰抑制Skp2表达对人喉癌细胞系Hep-2的影响

[目的]研究RNA干扰抑制Skp2表达对喉癌鳞状细胞p27表达、细胞增殖和凋亡的作用.[方法]利用脂质体将重组质粒转染Hep-2细胞,用慢病毒系统建立干扰Skp2基团的稳定细胞株;荧光实时定量PCR和Western blot法检测转染细胞株中Skp2和p27mRNA及其蛋白表达;采用MTr法和流式细胞仪检测转染细胞的增殖和凋亡情况.[结果]通过慢病毒siRNA技术,Skp2可持续稳定抑制Hep2喉癌细胞,siRNA可诱导抑制Skp2,增加p27表达,降低细胞增殖,增加喉癌细胞的凋亡.[结论]靶向Skp2基因的siRNA对Hep-2细胞的抑制作用可能是通过上调p27基因水平来实现的,Skp2是基因疗法治疗喉癌的有利靶点.     

RNA干扰hTERT基因治疗喉鳞状细胞癌的实验研究

目的:探讨RNA干扰hTERT(人端粒酶逆转录酶)基因对人喉鳞状细胞癌的治疗作用.方法:根据hTERT cDNA序列构建表达hTERT mRNA特异的、含荧光素基因的shRNA真核表达质粒pshRNA1、pshRNA2.将shRNA质粒分别转染人喉癌Hep-2细胞株及荷瘤裸鼠瘤体内.以激光共聚焦显微镜观察质粒在Hep-2细胞及瘤体内的表达;以MTT法观察质粒对Hep-2细胞增殖的抑制作用;以蛋白印迹法(Western blot法)检测Hep-2细胞中hTERT蛋白的表达;以免疫组化SP法检测裸鼠瘤体内hTERT蛋白的表达.结果:pshRNA1、pshRNA2转染Hep-2细胞及pshRNA1转染瘤体后,共聚焦显微镜下见大量的癌细胞表达绿色荧光,hTERT蛋白表达明显下降.细胞受pshRNA1、pshRNA2转染后,其生长活性受到明显抑制.体内抑瘤实验表明,与空质粒载体组(pshRNA4)和生理盐水组相比,pshRNA1组移植瘤生长明显受到抑制.结论:表达shRNA的、hTERT基因特异的真核表达质粒能有效转染体内、外喉鳞癌细胞,并可有效抑制人喉鳞癌细胞的生长,为今后应用RNA干扰基因治疗喉癌提供重要的实验参考.     

K-ras和IGF-IR反义寡核苷酸联合转染对人胰腺癌Patu8988细胞增殖和凋亡的影响

背景与目的:已有研究表明K-ras基因点突变及胰岛素样生长因子Ⅰ受体(insulin-like growth factor receptor type1,IGF-IR)过表达在胰腺癌的发生发展过程中起着重要作用,针对K-ras mRNA和IGF-IR mRNA的反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)均可抑制胰腺癌细胞的增殖。本研究旨在探讨针对K-ras基因12密码子点突变的硫代反义寡核苷酸(K-ras ASODN)联合IGF-IR硫代反义寡核苷酸(IGF-IR ASODN)对人胰腺癌Patu8988细胞体内外增殖和凋亡的影响。方法:顺序特异引物聚合酶链反应(polymerase chain reaction using special sequence primers,PCR-SSP)法和基因测序检测Patu8988细胞K-ras点突变形式,根据点突变形式设计并合成K-ras ASODN。K-ras ASODN和IGF-IR ASODN分别单独和联合作用Patu8988细胞后,通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、克隆形成实验及透射电镜观察其对Patu8988细胞增殖及形态结构的影响;流式细胞术(FCM)检测K-ras和IGF-IR蛋白表达和细胞凋亡;RT-PCR检测K-ras和IGF-IR mRNA表达水平;以Patu8988细胞建立裸鼠人胰腺癌模型,观察K-ras ASODN与IGF-IR ASODN联合应用在体内的抗肿瘤效果。结果:PCR-SSP法和基因测序检测表明Patu8988细胞存在K-ras基因第12密码子点突变,其突变方式为GGT→GTT。2～32mg/L的K-ras ASODN和2～32mg/L的IGF-IR ASODN单独应用均能一定程度抑制Patu8988细胞增殖、诱导细胞凋亡,两者联合应用较单独应用抑制作用更为显著(P<0.01)。体内实验表明,K-ras ASODN与IGF-IR ASODN联合应用较单独应用能更有效地抑制BALB/c裸鼠胰腺癌的生长(P<0.01)。结论:K-ras ASODN和IGF-IF ASODN两种反义寡核苷酸对人胰腺癌Patu8988细胞增殖的抑制具有协同作用,其机制可能是联合下调K-ras、IGF-IR蛋白及K-ras、IGF-IR mRNA表达水平。     

Notch2在喉鳞状细胞癌中的表达及意义

目的 探讨Notch2在喉癌组织及体外培养的喉鳞癌细胞Hep-2中的表达及与喉癌患者临床病理资料之间的关系.方法 应用量子点超敏免疫荧光染色法检测95例喉癌组织标本中Notch2蛋白的表达,同时选取31例声带息肉标本作为对照组,结合患者临床病理资料进行分析;制作细胞爬片并进行量子点(QDs)免疫荧光染色检测Notch2蛋白在喉鳞癌细胞Hep-2中的表达.结果 95例喉癌组织中Notch2阳性表达率为92.6％ (88/95),其阳性率与声带息肉中的阳性率(32.3％)相比差异均有统计学意义(P＜0.01),其表达主要定位于细胞核.Notch2在喉癌组织中的表达与临床分期显著相关(P＜0.05):临床分期越高,表达率越高.Notch2在喉癌组织细胞核中表达阳性与T分级、临床分期、病理分级和淋巴结转移显著相关(P＜0.05).喉癌细胞Hep-2中Notch2表达阳性,其表达主要定位于细胞质和胞膜中.结论 Notch2在喉癌的发生发展中起着重要作用,其可能成为治疗喉癌的分子靶点.     

凋亡抑制蛋白FLIP在喉部病变组织中的表达及意义

目的:检测凋亡抑制蛋白FLIP在人喉部常见病变组织中的表达并揭示其在喉癌等病变发生发展中的意义。方法:采用免疫组织化学EliVision法检测38例喉鳞状细胞癌标本,30例声带息肉组织标本,26例喉乳头状瘤标本,15例正常喉黏膜组织标本,喉癌Hep-2细胞系10个细胞爬片样本中FLIP蛋白的表达并进行统计学分析比较。结果:凋亡抑制蛋白FLIP在38例喉癌标本中有32例阳性表达(84.2%),在喉癌Hep-2细胞系10个细胞爬片样本中全部阳性表达(100%),26例喉乳头状瘤中5例阳性表达(19.2%),30例声带息肉标本中仅2例阳性表达(6.7%),而正常喉黏膜组织中均为阴性。凋亡抑制蛋白FLIP在喉癌组织中表达水平与喉部良性肿瘤和良性病变组织中的表达水平有显著差异(P<0.01)。结论:凋亡抑制蛋白FLIP的表达水平与喉部病变组织的良恶性程度密切相关,提示其可能与喉癌的发生相关。     

凋亡抑制蛋白FLIP在喉部病变组织中的表达及意义

目的：检测凋亡抑制蛋白FLIP在人喉部常见病变组织中的表达并揭示其在喉癌等病变发生发展中的意义。方法：采用免疫组织化学EliVision法检测38例喉鳞状细胞癌标本,30例声带息肉组织标本,26例喉乳头状瘤标本,15例正常喉黏膜组织标本,喉癌Hep-2细胞系10个细胞爬片样本中FLIP蛋白的表达并进行统计学分析比较。结果：凋亡抑制蛋白FLIP在38例喉癌标本中有32例阳性表达（84.2%）,在喉癌Hep-2细胞系10个细胞爬片样本中全部阳性表达（100%）,26例喉乳头状瘤中5例阳性表达（19.2%）,30例声带息肉标本中仅2例阳性表达（6.7%）,而正常喉黏膜组织中均为阴性。凋亡抑制蛋白FLIP在喉癌组织中表达水平与喉部良性肿瘤和良性病变组织中的表达水平有显著差异（P〈0.01）。结论：凋亡抑制蛋白FLIP的表达水平与喉部病变组织的良恶性程度密切相关,提示其可能与喉癌的发生相关。     

K-ras基因点突变的反义寡脱氧核苷酸对体外培养的人胰腺癌细胞PC-2凋亡的影响

目的观察针对于胰腺癌K-ras基因点突变的反义寡脱氧核苷酸对体外培养人胰腺癌细胞株PC-2凋亡的影响。方法脂质体将人工合成的针对于K-ras基因第12位密码子点突变的反义寡脱氧核苷酸转染体外培养的人胰腺癌细胞株PC-2,流式细胞仪、凋亡细胞原位末端标记（TUNEL）、倒置相差显微镜检测反义寡脱氧核苷酸对人胰腺癌细胞PC-2凋亡的影响。结果转染48小时后,流式细胞仪：实验组有明显的凋亡峰,细胞大部分被阻滞于G1期,S期比例减少。TUNEL：实验组凋亡细胞明显增多。倒置相差显微镜：实验组凋亡小体明显增多。结论针对于K-ras基因点突变的反义寡脱氧核苷酸作用于体外培养的胰腺癌细胞PC-2,对癌细胞的凋亡有明显的促进作用。     

喉鳞癌组织OPN表达及shRNA沉默对Hep-2细胞侵袭转移影响的研究

目的:探讨人喉鳞状细胞癌(LSCC)组织中OPN表达,分析其临床病理学意义,及OPN下调后对喉癌细胞株Hep-2生长和侵袭的生物学行为影响。方法:免疫组织化学SP法检测44例喉鳞状细胞癌及癌旁组织手术切除标本OPN的表达,结合喉癌患者的临床病理学特征进行分析。OPN的RNA干扰慢病毒载体(LV-shOPN)转染Hep-2细胞,蛋白质印迹法检测OPN的表达;MTT法检测Hep-2细胞增殖;Transwell侵袭实验检测Hep-2细胞的侵袭力。结果:44例喉癌和癌旁组织相对正常组织中OPN表达阳性率为75.0%(33例)和13.6%(6例),差异有统计学意义,P=0.000;OPN的表达与颈部淋巴结转移、临床分期、病理组织学分级有关,与性别、年龄、原发部位无相关性;体外构建的LV-shOPN能有效抑制Hep-2细胞中OPN蛋白的表达(P=0.117),抑制Hep-2细胞的增殖(P=0.026)和侵袭力(P=0.135)。结论:OPN可能参与了喉癌的发生、发展和转移,有可能成为判断预后的重要生物学标志;LV-shOPN能够有效抑制Hep-2细胞的生长和侵袭力,可望为喉癌治疗提供一定的理论基础。     

miRNA let-7a 调控HMGA2表达抑制喉癌细胞增殖并促进其凋亡的作用机制

目的:探讨在喉癌细胞株Hep-2中上调miRNA let-7a的表达对高迁移率族蛋白（high mobility group A,HMGA2）的作用机制以及对喉癌细胞增殖的影响。方法:合成miRNA let-7a 模拟体（let-7a mimics）并采用阳离子脂质体法转染入Hep-2内;分别用流式细胞术和MTT法检测let-7a高表达对细胞凋亡和增殖的影响;实时荧光PCR（Real-time qPCR）和Western blot检测上调let-7a后对HMGA2表达的影响。结果:本实验将let-7a mimics成功转染入Hep-2内,流式细胞术及MTT法检测显示Hep-2内let-7a的表达上调会抑制喉癌细胞的增殖,促进喉癌细胞的凋亡。RT-qPCR检测显示:let-7a mRNA在空白组和阴性对照组（NC组）的表达水平明显低于实验组（P<0.05）;HMGA2 mRNA在空白组、NC组的表达水平明显高于实验组（P<0.01）。Western blot检测细胞中HMGA2蛋白的表达显示:实验组HMGA2蛋白的表达量明显低于空白组和NC组（P<0.01）。上述实验中空白组与NC组之间比较均无统计学差异（P>0.05）。结论:let-7a能够显著下调HMGA2基因和蛋白的表达,抑制喉癌细胞的增殖,促进其凋亡,为喉癌基因靶向治疗提供坚实的理论基础。     

沉默HIG2促进NK细胞对喉癌细胞杀伤敏感性的机制探讨

目的:探讨缺氧诱导基因2（HIG2）在喉癌细胞逃逸NK细胞免疫杀伤中的作用机制。方法:免疫组织化学法检测喉癌组织和癌旁组织中HIG2的表达;Western blot检测HIG2、NKG2D配体（MICA、MICB、ULBP1、ULBP2和ULBP3）的蛋白表达;Transwell实验检测Hep-2细胞的侵袭;流式细胞术检测Hep-2细胞的凋亡、CD3-CD56+的NK细胞纯度、NKG2D受体表达及Hep-2细胞NKG2D配体的表达;乳酸脱氢酶释放法检测不同效靶比时,NK细胞对Hep-2细胞的杀伤活性。结果:HIG2在喉癌组织中高表达。CD3-CD56+的NK细胞纯度大于90%。沉默HIG2抑制Hep-2细胞侵袭,促进细胞凋亡,提高NKG2D配体的表达,增强NK细胞对Hep-2细胞的杀伤敏感性。NKG2D抗体抑制NK细胞NKG2D受体表达,减弱NK细胞对沉默HIG2 的Hep-2细胞的杀伤活性。结论:沉默HIG2可抑制喉癌细胞侵袭,促进细胞凋亡,上调NKG2D配体表达,增强NK细胞对喉癌细胞的杀伤敏感性。     

K-ras基因在人喉鳞状细胞癌细胞株(Hep-2)中的表达及其意义

Objective： To investigate the expression of K-ras in human laryngeal squamous cell carcinoma cell lines （Hep-2） and its significance for establishing a solid foundation for further study of the relationship between human laryngeal squamous cell carcinoma and K-ras gene point mutations. Methods： The expression of K-ras in human laryngeal squamous cell carcinoma cell lines （Hep-2） and human pancreatic carcinoma cell lines （MIAPaCa-2） was detected by using RT-PCR. Results： The expression of K-ras mRNA in Hep-2 and MIAPaCa-2 was strong and positive. Conclusion： The expression of K-ras mRNA in human laryngeal squamous cell carcinoma cell lines （Hep-2） is positive. Development of laryngeal carcinoma might be related to the activation of K-ras gene point mutation.     

mTOR siRNA对喉鳞状细胞癌Hep-2细胞生物学行为的影响

目的观察mTOR siRNA对喉鳞状细胞癌Hep-2细胞增殖能力的影响。方法选取45例喉鳞状细胞癌组织和45例正常喉黏膜组织,采用免疫组织化学法检测mTOR蛋白的表达;将喉鳞状细胞癌Hep-2细胞分为空白对照组、空载体组和mTOR siRNA组,及正常对照组、溶剂对照组和雷帕霉素组,分别利用mTOR siRNA和雷帕霉素进行治疗,采用Western bloting法检测不同浓度的mTOR siRNA和雷帕霉素分别处理细胞后对mTOR蛋白表达的影响,并采用CCK-8试剂盒分析mTOR蛋白表达下调对喉鳞状细胞癌Hep-2细胞增殖能力的影响。结果 mTOR蛋白在喉鳞状细胞癌组织中表达的阳性率显著高于正常喉黏膜组织(P<0.05)。3种不同浓度mTOR siRNA分别转染Hep-2细胞24、48、72 h,各组与空白对照组、空载体组相比,mTOR蛋白表达均有所降低(P<0.05),且mTOR蛋白表达随mTOR siRNA浓度的增加、作用时间的延长而降低(P<0.05)。3种不同浓度雷帕霉素处理Hep-2细胞24、48、72 h,各组与溶剂对照组及正常对照组相比,mTOR蛋白表达量均有所降低(P<0.05);且mTOR蛋白表达随雷帕霉素浓度的增加、处理时间的延长而降低(P<0.05)。与空白对照组、空载体组相比,各mTOR siRNA组的Hep-2细胞增殖在转染后24、48、72 h均受到明显抑制(P<0.05)。结论 mTOR siRNA均能降低喉鳞状细胞癌Hep-2细胞中mTOR蛋白的表达,有效抑制细胞的生长,为喉鳞状细胞癌的分子治疗提供了理论依据。     

Gankyrin蛋白在喉鳞癌中表达的实验研究

目的研究Gankyrin蛋白在喉鳞癌组织及喉鳞癌Hep-2细胞系中的表达。方法免疫组织化学方法检测24例喉鳞癌组织、相应癌旁组织及10例正常组织,免疫细胞化学法检测Hep-2细胞系中Gankyrin蛋白的表达与分布,并计算阳性细胞率,进行统计分析。结果喉鳞癌组织及Hep-2细胞系中,Gankyrin蛋白主要表达于细胞核。喉鳞癌组织中Gankyrin蛋白表达阳性细胞率(58.5%)明显高于相应癌旁组织(11.4%)及正常组织(18.1%),且差异有统计学意义(均P0.01)。结论喉鳞癌组织及喉鳞癌Hep-2细胞系中均有Gankyrin蛋白的表达,可为Gankyrin在喉鳞癌中表达的后续相关研究提供理论依据。     

Survivin基因在喉癌中的表达及意义

目的研究Survivin基因在喉癌中的表达及其与各临床病理因素的关系.方法应用RT-PCR法检测2株喉癌细胞株,40例喉癌组织标本及相应的癌旁组织中Survivin基因的表达;应用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶连接SP法检测Survivin基因在120例喉癌组织中的表达情况.结果 RT-PCR显示喉癌细胞株和67.5%(27例)的喉癌组织表达Survivin mRNA,而癌旁组织内无1例阳性表达.SP法显示在Survivin基因在喉癌中阳性表达率为66.7%,其阳性表达率在有无淋巴结转移、复发、临床分期、5年生存率等方面差异有显著性(P＜0.05).结论 Survivin基因与喉癌的自然的发展过程有关,同时可作为判断肿瘤恶性程度,判断预后的有效指标.Survivin基因可能成为喉癌新的诊断标志及基因治疗的靶点.     

S100A4与MMP-9在喉鳞癌中的表达和相关性研究

分析正常喉组织、喉鳞癌组织中S100A4和MMP-9的表达及临床意义,探讨其在喉鳞癌发生发展中的作用及相关性。方法：采用免疫组织化学SP法检测S100A4和MMP-9蛋白的表达并分析二者的相关性及其与临床病理因素的关系;采用Western blot法检测S100A4和MMP-9蛋白的表达。结果：免疫组化结果表明S100A4和MMP-9蛋白在癌旁喉组织和喉鳞癌中的阳性表达率均呈升高趋势,分别为8.6%和14.3%,63.8%和71.3%,并且二者表达均与喉鳞癌淋巴结转移相关。统计学结果显示80例喉鳞癌组织中,S100A4和MMP-9蛋白表达呈正相关（P<0.01,r=0.440）。Western blot结果表明S100A4和MMP-9蛋白在喉鳞癌组织中表达高于癌旁喉组织。在喉癌细胞系Hep-2中干扰S100A4蛋白的表达后,MMP-9的蛋白水平下调。结论：S100A4和MMP-9在喉鳞癌发生发展中均存在异常,并且S100A4基因抑制后能够显著下调MMP-9的表达。     

Growth inhibition of human laryngeal cancer cell with the adenovirus-mediated p53 gene

Mostmalignanciesarediseasegeneratedwithaprocessofgeneticalteration.Basedonthistheory,newapproachestocancertherapyarebeingdevel0ped.Oneoftheseisgenetherapy.Amongthegeneshavingtherapeuticpotentialforcancertreatment,thep53tumorsuppressorgenehasbeenmostextensivelystudied.[l]Wild-typep53hasbeenshownt0beinvolvedintranscirptionalregulation.ItarrestscellsattheGllScheckpoint,blocksDNAreplicati0nandinducesap0ptosis."'Recentstudieshavesh0wnthatwild-typep53genecansuppressthegrowthofsomehumancancercelll…     

尼美舒利对人喉鳞癌Hep-2细胞祼鼠移植瘤CD44和MMP-7表达的影响

目的探讨尼美舒利对喉鳞状细胞癌裸鼠皮下移植模型的抑瘤作用及机制。方法建立人喉鳞癌Hep-2细胞株裸鼠移植瘤模型,应用尼美舒利处理裸鼠,观察肿瘤生长情况并绘制生长曲线,免疫组织化学技术检测移植瘤组织中COX-2、CD44和MMP-7蛋白表达,RT-PCR技术检测移植瘤组织中COX-2、CD44 和MMP-7mRNA表达情况。结果与对照组相比,治疗组肿瘤体积增长较对照组缓慢,体积抑瘤率为63.36%,重量抑瘤率达51.81%,肿瘤体积和重量均明显低于对照组（P均＜0.05）。实验组和对照组治疗前后裸鼠体重增长值差异无统计学意义（P＞0.05）。实验组COX-2、CD44和MMP-7蛋白及mRNA表达明显低于对照组,差异有统计学意义（P均＜0.05）。结论尼美舒利可有效抑制人喉鳞癌细胞系Hep-2裸鼠移植瘤的生长,其机制可能与抑制COX-2、CD44及MMP-7表达有关。     

The involvement of CHD5 hypermethylation in laryngeal squamous cell carcinoma

Chromodomain helicase DNA-binding protein 5 (CHD5) has been found to be a candidate tumor suppressor gene (TSG) in malignant neural tumors. In mice heterozygous for chd5 deficiency, the first tumor observed was pathological squamous cell carcinoma. More than 95% of primary laryngeal cancer is squamous cell carcinoma. Thus, we explored the expression of CHD5 in 65 patients with laryngeal squamous cell carcinoma (LSCC) using real-time PCR, immunohistochemistry and Western blotting. DNA methylation was detected using bisulfate-specific sequencing. The potential function of CHD5 was determined using MTT, apoptosis and transwell migration assays in CHD5-transfected Hep-2 cells. Our results revealed that the mRNA and protein expression levels of CHD5 in LSCC tissues were significantly lower than those in clear surgical margin tissues (p<0.05), and there is a significant correlation between the mRNA and protein expression levels of CHD5 (p<0.01). In addition, there were significant differences in CHD5 mRNA and protein levels with respect to the patient's clinical stage (p<0.05). Aberrant methylation of the CHD5 promoter was frequently found in the Hep-2 cell line and LSCC tumor tissues, especially tumor tissues from advanced TNM (p<0.05) or older patients (p<0.05). Finally, ectopic expression of CHD5 in laryngeal cancer cells led to significant inhibition of growth and invasiveness. Our data suggest that CHD5 is a tumor suppressor gene that is epigenetically downregulated in LSCC.