名贵动物药材穿山甲的DNA条形码分子鉴定研究

利用COI序列作为DNA条形码对名贵珍稀动物药材穿山甲及其混伪品进行鉴定,为穿山甲药材分子鉴定提供科学依据。该实验采用试剂盒法提取穿山甲及其混伪品的基因组DNA,通过PCR扩增和双向测序,应用CodonCode Aligner软件进行校对拼接,采用MEGA 6.0软件对所有7个物种的56份样品进行序列比对,构建邻接（NJ）树。结果表明穿山甲药材COI序列扩增成功,所构建的NJ树结果显示穿山甲及其混伪品均可明显区分。因此,基于COI序列,应用DNA条形码技术可有效鉴定名贵动物药材穿山甲及其混伪品,为其市场监管提供了新的技术手段。     

中药材蜈蚣及其混伪品DNA条形码鉴别研究

利用DNA条形码技术对蜈蚣药材进行鉴别,为蜈蚣药材鉴定提供新的方法。该研究以COI条形码序列为基础,对蜈蚣实验样品进行DNA提取,PCR扩增和双向测序,用MEGA6.0软件对所有5个物种的50份样品进行序列比对和邻接（NJ）树构建。结果显示实验样品均可以获得COI序列,蜈蚣药材与其混伪品COI序列种间平均K2P距离为0.222,种间最小K2P 距离为0.190,基于COI序列构建的邻接（NJ）树中少棘巨蜈蚣单独聚在一枝,与其混伪品可以相互区分。因此基于COI条形码序列可以准确鉴定蜈蚣及其混伪品。     

基于COI序列的紫河车药材及其混伪品的DNA条形码鉴定研究

利用COI序列对紫河车及其常见混伪品进行DNA条形码分子鉴定,探究准确、快速鉴定紫河车及其混伪品的方法。该研究共收集6个种41份样品,以COI作为条形码序列,对紫河车的正品及其混伪品提取基因组DNA,通过PCR扩增和双向测序,运用CodonCode Aligner进行序列拼接后,采用 MEGA6.0 软件进行序列比对,分析比较种内、种间序列差异,并构建正品紫河车及其混伪品的NJ树。结果表明紫河车COI序列种内平均K2P距离为0.001,种内最大K2P距离为0.008,紫河车的正品来源人与其混伪品种间存在较多变异位点。由所构建的NJ 树显示紫河车与其混伪品均可明显区分。基于COI序列的DNA条形码技术可以鉴定紫河车及其混伪品,为紫河车的鉴别提供了新的工具。     

《中国药典》收载动物药材DNA条形码鉴定研究策略与方法

动物药材应用历史悠久,是中药资源的重要组成部分。近年来动物药材混伪品、替代品不断出现,严重影响了动物药材临床应用效果和用药安全。DNA条形码技术作为一种新兴的生物鉴定方法,可对《中华人民共和国药典》收载动物药材进行快速、准确的鉴定。本文就以COI为主体、ITS2为补充的动物药材DNA条形码鉴定体系的建立、动物药材DNA条形码鉴定中的关键技术和动物药材DNA条形码鉴定数据库进行介绍,为《中华人民共和国药典》收载动物药材DNA条形码鉴定研究提供参考。     

基于COI条形码序列的《中国药典》动物药材鉴定研究

药用动物是我国中药资源的重要组成部分,线粒体COI 基因被公认为动物界中标准的DNA 条形码基因,但利用此技术系统研究药用动物或动物药材鉴定的报道不多。本研究选取药典中45 个动物药材,涉及基原物种51 种,分析样品COI 序列的种内种间变异情况,barcoding gap,鉴定效率等,考察COI 序列鉴定动物药材的有效性和准确性。结果表明,种间变异最小值远大于种内变异最大值,barcoding gap 图显示种间变异和种内变异重合较少,鉴定效率较高,除节肢动物门外,在物种水平和属水平上,鉴定效率均为100%,所构建的动物药材及其混伪品的NJ 树能很好地区分正品来源与其混伪品。因此COI 序列作为DNA 条形码适用于药典中动物药材的鉴定。本研究为COI 条形码准确鉴定药典中动物药材提供了分子依据,扩充了DNA 条形码数据库中药用动物序列,并建立了利用此技术鉴定动物药材的具体技术流程。     

娑罗子基原物种的DNA条形码鉴定研究

目的 筛选出适用于鉴定七叶树属药用植物的条形码序列。方法 考察了七叶树属10个物种42份样品的核ITS、ITS2与叶绿体psbA-trnH、rbcL、matK序列的PCR扩增和测序效率、种内及种间变异、鉴定效率,对初筛后的序列进行barcoding gap检验及NJ树聚类分析。结果 psbA-trnH序列的PCR扩增和测序效率均为100%,种间最小变异大于其种内最大变异,且鉴定效率为候选序列中最高,barcoding gap检验结果表明该序列在种间、种内变异重合比例较小,且NJ树聚类分析结果也表明psbA-trnH序列能够提供充分的辨析效果。结论 psbA-trnH序列能准确鉴定七叶树属药用植物,可作为七叶树属药用植物条形码序列。     

细小种子类毒性药材天仙子的DNA 条形码鉴定

目的：毒性中药的误用滥用对人类健康造成了严重危害。本研究应用DNA条形码技术对细小种子类毒性药材天仙子及其混淆品进行鉴定,为中药材的安全使用提供保障。方法：使用试剂盒提取61份样本的总DNA,通过聚合酶链式反应（PCR）扩增其ITS2序列并双向测序,应用Codon Code Aligner v 4.25对测序峰图进行校对拼接,去除低质量序列及引物区获得ITS2 序列。用MEGA 6.0 软件计算物种种内和种间Kimura2-Parameter（K2P）遗传距离,分析变异位点并构建邻接（NJ）系统聚类树。结果：天仙子的基原植物莨菪种内最大K2P遗传距离为0.005,远小于其与混淆品之间的种间最小K2P遗传距离（0.360）;NJ树结果显示莨菪独自聚为一支,表现出良好的单系性,与混淆品明显区分开。结论：ITS2序列能准确鉴别毒性药材天仙子及其混淆品,为保障临床用药的安全提供了有效的技术手段。     

动物药材分子鉴定研究策略

作者对动物药材分子鉴定研究的现状及问题进行了总结和分析,在此基础上,提出全国范围内相关单位联合攻关,扩大研究品种,加快动物药材分子鉴定试剂盒的研制和推广,全面启动中国动物药材DNA条形码研究计划,建立动物药材分子鉴定标准数据库等研究策略.     

基于DNA条形码的藤类药材鉴定

目的:对《中国药典》中记载的14种藤类药材进行分子鉴定。方法:以核基因ITS2片段作为DNA条形码,对研究材料进行PCR扩增并双向测序,所得序列经CodonCode Aligner拼接后,用软件MEGA4.0进行相关数据分析,并构建NJ(邻接)树。结果:14种藤类药材的ITS2序列长度为190-284 bp;各药材种内K2P遗传距离为0-0.053,远远小于种间K2P遗传距离(平均值为0.852,最小值为0.309);由所构建的系统聚类树图可以看出,本研究中具有不同产地来源样品的药材均表现出了单系性,同时又与其它药材明显分开。结论:ITS2序列作为条形码适用于鉴定《中国药典》中藤类药材,在中药材的鉴定领域具有重要的应用前景。     

基于psbA-trnH序列的辽宁省黄精药材DNA条形码研究

目的 基于psbA-trnH序列,运用DNA条形码技术对辽宁省12个地区及省外2个地区黄精药材样本进行鉴别分析,为辽宁省黄精药材的鉴别和遗传多样性分析提供参考。方法 利用DNA试剂盒提取法,从38个黄精样本的药用部位中提取DNA,对psbA-trnH部分进行聚合酶链式反应（PCR）扩增及双向测序,并从GenBank下载药用植物黄精的不同来源和外群序列,运用SeqMan软件对测序结果进行拼接,使用MEGA软件对数据进行分析比对,计算K2P（Kimura 2-parameter）遗传距离,并采用邻接法（NJ）建立系统发育树进行分析。结果 根据NJ系统发育树结果可知,不同来源的所有黄精样品聚为一大支,外群猪牙花聚为一支,区别较明显;辽宁省、湖北省及贵州省黄精与美国国家生物技术信息中心（NCBI）所下载的黄精聚为一支,并且结合变异位点与遗传距离可知,辽宁省、湖北省及贵州省的黄精物种为黄精Polygonatum sibiricum Red.,种间差异较小,辽宁省所收集的黄精有4个样品出现了变异位点,其余样本碱基序列均相同。结论 使用psbA-trnH序列DNA条形码技术能够对黄精药材不同的基原植物进行区分鉴别且成功率较高,可用于对黄精属物种进行种内和种间鉴别,为保障辽宁省黄精药材来源的准确鉴定提供参考。     

塞隆骨形态鉴别研究

塞隆骨是青藏高原特有的仓鼠科动物高原鼢鼠Myospalax baileyi的干燥全架骨骼,国家食品药品监督管理局一类新药材。在药材检验工作中,缺少高原鼢鼠骨骼形态学研究,难以鉴定塞隆骨。为更好执行并完善塞隆骨质量标准,该文使用啮齿动物学,中国鼢鼠研究文献及药材鉴定学对塞隆骨生药及各部分粉末显微形态特征进行研究,同时对其详细观察、记述并用标号标出特征部位,应用研究结果能够更有效鉴别塞隆骨药材。     

忍冬科药用植物DNA条形码通用序列的筛选

目的:从4条DNA片段(psbA-trnH,matK,rbcL,和ITS2)中筛选可用于忍冬科药用植物鉴定的DNA条形码通用序列。方法:通过比较各序列的PCR扩增成功率、测序效率、种内和种间变异、barcoding gap和鉴定成功率等指标评价不同序列在忍冬科植物中的鉴定能力。结果:对忍冬科13个属,33个物种,58个样本进行分析,ITS2序列在属水平上的鉴定成功率为100.0%,物种水平上的鉴定成功率为96.6%。结论:ITS2序列可以作为忍冬科植物的DNA条形码候选序列,同时推荐psbA-trnH序列作为ITS2序列的补充序列。     

数种蜥蜴亚目药用动物DNA条形码分类探讨

该研究选取数种蜥蜴亚目药用动物为研究对象,应用DNA条形码通用引物扩增测序,并与GenBank收录的共3科7属12种59个体的同源序列(564 bp)进行比对分析,采用邻接法、最大简约法和贝叶斯推断法分别构建分子系统发育树.结果表明,该片段的G+C平均量为46.5％,低于A+T平均量(53.5％).基于Kimura双参数模型计算,所有个体的种内遗传距离平均值为1.7％,种间遗传距离平均值为35.5％,种间平均遗传距离是种内的21倍.无疣壁虎、疣尾蜥虎和大壁虎的种内平均遗传距离均大于2％,进一步分析表明这些种的地理群体间的遗传分化可能均已达到亚种甚至种的水平,当然还需要结合形态、更多分子标记等分析才能定论.基于COI基因片段序列构建的系统发育树表明,DNA条形码在科、属和种水平的分类鉴定与传统方法所得结果一致.因此,DNA条形码用于蜥蜴亚目药用动物物种间的鉴定是可行的,特别是对于非专业人员鉴定相关类群药材真伪具有一定应用价值.     

鲤科鲌属药用鱼类线粒体COI基因的DNA条形码研究

目的:采用线粒体COI基因序列研究我国长江流域不同地区鲤科鲌属药用鱼类的遗传特征,探讨利用该基因片段作为鲌属药用鱼类鉴定条形码的适用性.方法:扩增鲌属药用鱼类的线粒体COI基因序列5′端并进行测序,分析不同药用鱼类种内和种间的遗传变异,构建聚类树,探讨该序列片段在鲌属药用鱼类中进行鉴定的可行性.结果:鲌属药用鱼类COI基因片段的碱基组成中A+T碱基量明显高于G+C量,96％的遗传变异均发生在编码区密码子第3位点,但所有翻译后氨基酸组成均相同,表明COI基因编码在鲌属鱼类中的保守性;鲌属药用鱼类的种内遗传距离均小于1％,种间遗传距离大于10倍的种内距离;NJ聚类树显示所有鲌属鱼类聚成独立的一支,其属内不同鱼种的个体又分别聚成独立的分支,不同分支具有较高的节点支持率.结论:鲌属4种药用鱼类的DNA分类与形态学分类结果一致,COI条形码序列能够对鲌属鱼类进行有效的区分.     

应用DNA条形码技术鉴定中药材灯心草

目的:应用植物类药材通用条形码ITS2鉴定中药材灯心草。方法:对灯心草药材及其密切相关种进行PCR扩增和测序,运用CodonCode Aligner对所获ITS2序列进行拼接。应用MEGA5.0软件计算Kimura 2-parameter(K2P)遗传距离。采用相似性搜索法、最近距离法、PWG距离法及构建NJ(邻接)系统聚类树等方法进行鉴定分析。结果:灯心草药材种内K2P遗传距离在0～0.005,远远小于灯心草与其他密切相关种之间的K2P遗传距离(0.215～0.614);4种鉴定方法均表明ITS2序列可以有效区分灯心草与其密切相关种。结论:植物类药材通用条形码ITS2适用于鉴定中药材灯心草,进一步证明了ITS2对中药材的鉴定能力。     

中药材骨碎补及其混淆品的显微鉴定方法研究

目的:为中药材骨碎补正品及其混淆品提供科学可行的显微鉴定方法。方法:通过光学显微镜、扫描电子显微镜及石蜡切片方法对骨碎补正品的来源植物槲蕨Drynaria roosii及其混淆品来源植物川滇槲蕨D.delavayi、栎叶槲蕨D.quer-cifolia和崖姜Pseudodrynaria coronans的根状茎鳞片的形态特征进行观察、测定并进行数据分析。结果:槲蕨、川滇槲蕨和崖姜之间在鳞片长度方面两两比较均出现显著性差异;川滇槲蕨鳞片锯齿呈不均匀分布且多发生弯曲,有重锯齿现象;槲蕨、栎叶槲蕨和崖姜的鳞片基均着生于表皮凹陷处,而川滇槲蕨鳞片基着生于表皮凸起处。结论:几种材料的根状茎鳞片有显著差异,可以作为鉴别骨碎补正品槲蕨及其混淆品的依据。     

基于居群DNA条形码的药用植物黄芩的产地鉴别研究

目的:利用居群DNA条形码阐明不同产地(居群)黄芩的遗传分化程度,对其进行产地鉴别。方法:应用进化速率快和母系遗传的叶绿体DNA基因间序列,基于分子谱系地理学理论筛选出居群间遗传分化明显的片段,构建单倍型网状进化树,根据单倍型在网状进化树中的位置、出现的频率和地理分布范围的大小,划分出不同层次的居群DNA条形码,以用于地理分布范围宽窄不同的产地鉴别。结果:本实验筛选出3个叶绿体DNA基因间序列atpB-rbcL,trnL-trnF和psbA-trnH对17个黄芩野生居群进行分子谱系地理学分析,得到13个多态位点,共20个单倍型,其中3个分布最广、频率最高的单倍型可用于较广地域的产地鉴别,称为区域居群DNA条形码;3个分布次之、只存在于2～3个邻近居群的单倍型可用于较窄地域的产地鉴别,称为地区居群DNA条形码;另有8个仅局限在某一个居群的单倍型可用于特定居群的鉴别,称为居群特有DNA条形码。结论:叶绿体基因间序列在居群间存在明显遗传分化,可用于地理分布范围宽窄不同的黄芩产地鉴别。