腺病毒介导野生型p53基因诱导膀胱癌细胞凋亡

p53基因是一种抑癌基因,它在肿瘤发生过程中有重要作用.p53基因的突变可引起细胞增殖,导致悼瘤的发生.迄今已在许多恶性肿瘤细胞中发现p53基因的突变.将外源野生型p53基因导入p53基因突变的肿瘤细胞,能抑制其恶性增殖,逆转其恶性表型.这些研究为肿瘤的基因治疗奠定了基础;值得注意的是,至今大多数研究均用有p53基因缺失或突变的肿瘤细胞,但并非所有的肿瘤细胞都发生p53基因突变;本文将外源野生型p53基因导入表达内源野生型p53基因的膀胱癌细胞株EJ,观察其抑制效应及凋亡的诱导作用.     

重组腺病毒载体介导的人野生型p53基因增强肝癌细胞对化疗药物的敏感性

目的： 观察表达人野生型p53,GM-CSF和B7-1基因的重组腺病毒载体（BB-102）提高肝癌细胞对化疗药物的敏感性。方法： BEL-7402,HLE和HuH-7 3株肝癌细胞被50 MOI的BB-102转染后,Western blot检测p53基因的表达,MTT方法检测肝癌细胞对化疗药物的敏感性。结果： 当MOI为50 pfu/细胞时,腺病毒载体对3株肝癌细胞的转染效率均达到80％以上。转染BB-102后,HLE和HuH-7细胞对顺铂的敏感性分别提高11倍和28倍,对丝裂霉素-C的敏感性分别提高3.75倍和20倍。而BB-102的转染对BEL-7402细胞的化疗敏感性没有影响。结论： BB-102腺病毒载体转染后能显著提高p53基因突变的HLE和HuH-7细胞对顺铂和丝裂霉素-C的敏感性,因而增强顺铂和丝裂霉素-C对HLE和HuH-7细胞的杀伤作用。     

重组腺病毒载体介导的人野生型p53基因增强肝癌细胞对化疗药物的敏感

目的：观察表达人野生型和p53,GM－CSF和B7－1基因的重组腺病毒载体（BB－102）提高肝癌细胞对化疗药物的敏感。方法：BEL－7402,HLE和HuH-73株肝癌细胞被50MOI的BB－102转染后,Western blot检测p53基因的表达,MTT方法检测肝癌细胞对化疗药物的敏感性。结果：当MOI为50pfu／细胞时,腺病毒载体对3株肝癌细胞的转染的效率均达到80％以上。转染BB－102后,LHE和HuH-7细胞对顺铂的敏感性分别提高11倍和28倍,对丝裂霉素－3的敏感性分别提高3．75倍和20倍,而BB－102的转染对BEL－7402细胞的化疗敏感性没有影响。结论：BB－102腺病毒载体转染后能显著提高p53基因突变的HEL和HuH-7细胞对顺铂和丝裂霉素－C的敏感性,因而增强顺铂和丝裂霉素－C对HLE和HuH-7细胞的杀伤作用。     

重组腺病毒p53基因治疗肝癌研究进展

目的：探讨重组腺病毒p53基因（recombinant humanAd—p53,rAd—p53）治疗肝癌的抗肿瘤机制及临床应用。方法：应用PubMed、万方和CNKI数据库,以“肝癌、重组腺病毒p53基因、基因治疗、实验研究和临床应用”为关键词,检索1994—06—01—2013—11—31文献739篇,纳入标准：1）p53基因与肝癌发生的相关性;2）重组腺病毒p53基因抗肿瘤机制;3）重组腺病毒p53治疗肝癌的实验研究;4）重组腺病毒p53治疗肝癌的临床应用研究。根据纳入标准选择符合分析的文献36篇。结果：p53基因是公认的肿瘤抑制基因,具有促使肿瘤细胞自杀和帮助缺陷细胞修复的作用。rAd—p53是复制缺陷型5型腺病毒载体与人p53基因重组的肿瘤基因治疗制品。rAd-p53通过多种途径发挥抗肿瘤作用,包括使肿瘤的细胞周期阻滞和发生程序性死亡,促进放射线对肿瘤细胞引起的细胞周期阻滞和凋亡,刺激机体产生抗肿瘤免疫反应,抑制肿瘤血管内皮生长因子,控制肿瘤的血管生成,使注射部位瘤组织产生局部血供障碍和坏死。此外,还能增加肝癌细胞的放化疗敏感性,间接增强抗肿瘤疗效。rAd-p53基因疗法为肝癌治疗开辟了崭新的途径,多项-l盘床研究疗效良好。结论：rAd—p53基因对肿瘤的作用机制体现了在抗肿瘤治疗方面的有效性,并在基础研究及临床应用中均取得了显著进展,再肝癌的防治中将取得更大的突破。     

重组人p53基因腺病毒注射液在原发性肝癌介入治疗中的临床研究

目的:研究重组人p53腺病毒注射液（商品名:今又生）在原发性肝癌介入治疗中的安全性及有效性。方法:61例中晚期原发性肝癌患者,分两组介入治疗:对照组:碘油+化疗药（5-FU+EPI+DDP）;治疗组:碘油+化疗药（5-FU+EPI+DDP）+重组人p53基因腺病毒注射液;每4周一次,连用3次。结果:不论是对照组还是治疗组,毒副反应不大,耐受性良好,生活质量均有一定的提高;治疗后两组均能使原发性肝癌的肿瘤标志物AFP下降,但治疗组下降明显;治疗组的有效率（82.76%）明显高于对照组（59.38%）,统计学检验差异显著。结论:今又生介入治疗原发性肝癌安全有效,值得推广。     

重组人p53腺病毒治疗原发性肝癌的血清p53蛋白检测及其临床意义

目的:初步观察重组人p53腺病毒注射液(recombinant adenovirus-p53,rAd-p53)治疗肝癌临床疗效,和治疗前后血清p53蛋白的变化及其临床意义。方法:对38例原发性肝癌患者,采用瘤内注射、血管介入和静脉滴注rAd-p53联合化疗和放疗,行至少1个疗程以上的治疗,治疗结束一个月后评价疗效。应用ELISA检测患者治疗前和治疗后血清p53蛋白。结果:38例患者总的疾病控制率为94.74%,其中CR7例,PR11例,SD18例,PD2例。38例肝癌患者经人p53腺病毒注射液治疗后血清p53蛋白含量比治疗前明显升高(P<0.01)。治疗前血清p53蛋白较高的患者比p53蛋白低的对人p53腺病毒注射液的治疗反应较好。结论:人p53腺病毒注射液治疗对肝癌具有一定疗效,临床应用安全;治疗前血清p53蛋白含量以及动态变化可能是预测rAd-p53治疗肝癌疗效的有价值指标,并对人p53腺病毒注射液的临床应用具有一定的指导作用。     

重组腺病毒介导人野生型p53,GM-CSF和B7-1基因对肿瘤化疗耐药细胞生物学行为的影响

目的：探讨重组腺病毒介导人野生型p５３,ＧＭ－ＣＳＦ和Ｂ７－１基因对肿瘤化疗耐药 细胞生物学行为的影响,为临床使用该重组腺病毒治疗多药耐药的肿瘤提供实验基础。方法：选用p５３异常的ＫＢ-s（ＶＣＲ敏感）和ＫＢv２００（ＶＣＲ耐药）细胞作为肿瘤化疗药物敏感和耐药的模式细胞,感染携带人野生型p５３,ＧＭ－ＣＳＦ和Ｂ７－１基因的重 组腺病毒后,观察这两种转基因癌细胞的生物学行为（包括药物敏感性０的变化,结果：药     

重组人p53腺病毒治疗结肠腺癌腹壁转移1例

患者,男,65岁。2002年11月行乙状结肠癌根治术术后病理:腺癌,Ⅱ级,侵及深度不详,淋巴结1/3转移。     

腺病毒介导人p53、B7-1、GM-CSF、IL-2基因在肝癌细胞中的表达

我们以Ｅ1、Ｅ3区缺失的血清 5型腺病毒为载体 ,构建了同时含人ｐ5 3、Ｂ7 1、ＧＭ ＣＳＦ、ＩＬ 2基因的重组腺病毒载体 ,并研究其在肝癌细胞中的表达。一、材料与方法1 细胞培养和构建单、双顺反子重组腺病毒载体 :肝细胞癌细胞系ＨｅｐＧ2、ＢＥＬ740 2、ＳＭＭＣ772 1,含 5型腺病毒Ｅ1片段的人胚肾细胞系 2 93细胞 ,正常人肝细胞系Ｌ0 2和大鼠癌肉瘤Ｗａｌｋｅｒ 2 5 6细胞 ,分别培养于含 10 %胎牛血清的高糖型ＤＭＥＭ或ＲＰＭＩ 16 40中。所有目的基因均被克隆到质粒ｐＸＣＪＬ1[1] 中 ,再与重组质粒ｐＪＭ17通过脂质体ＤＯＴＡＰ介导…     

重组腺病毒介导的人野生型p53、GM—CSF和B7—1基因在肝癌细胞中的表达

目的：观察腺病毒载体对肝癌细胞的转染效率及其介导的人野生型p53，GM－CSF和B7－1基因在肝癌细胞中的表达。方法：不同MOI的Ad-GFP感染肝癌细胞，48h后计算感染效率；BB－102以50MOI感染肝癌细胞，48h后免疫组化法及western blot检测p53表达，ELISA检测GM0CSF的含量，FACS测定B7－1的表达。结果MOI为50pfu/细胞时对肝癌细胞的转染效率达80％以上，目的基因均可在肝癌细胞中高效表达。结论：腺病毒载体对肝癌细胞具有较高的转染效率，目的基因均可在肝癌细胞中高效表达，为进一步研究BB－102在肝癌治疗中的应用奠定了基础。     

p53基因对食管癌细胞的作用

目的 观察野生型p53基因对不同放射敏感性食管癌细胞的作用，探索p53基因治疗与放射治疗联合应用的价值。方法 以人食管癌细胞株TE－13及经反复照射后改变了放射敏感性的细胞TE－13R50为实验对象，将载有人野生型p53cDNA并含巨细胞病毒（CMV)启动子的重组腺病毒（Ad5CMV-p53）感染上述两种细胞及肿瘤组织并加用放射，在体、离体实验比较观察Ad5CMV-p53对不同放射敏感性食管癌细胞的影响。结果 TE－13细胞及TE－13R50细胞的放射敏感性明显不同（D0值分别为1.38、2.48Gy）；当联合应用Ad5CMV-p53时明显增加了它们的放射敏感性，TE－13R50细胞的提高幅度较大，接近了亲代细胞的水平（D0值分别为0.97、1.14Gy）。放射合并瘤内注射Ad5CMV-p53与单纯放射相比，荷瘤裸鼠的肿瘤生长速度明显受到抑制，对TE－13R50细胞的作用更大。结论 Ad5CMV-p53可提高食管癌细胞的放射敏感性，在一定程度上消除了食管癌细胞的放射抗拒性。     

Effect on biological behavior of chemotherapy-resistant tumor cells by human wild-type p53, GM-CSF and B7-1 genes via recombinant adenovirus

　Objective To explore the effect on biological behavior of chemotherapy-resistant tumor cells by human wild-type p53, GM-CSF and B7-1 genes mediated via recombinant adenovirus. Methods p53-abnormal KB-v200 (VCR resistant) and KB-s (VCR sensitive) cell lines were used as model tumor cells, which are resistant and sensitive to chemotherapeutic drugs respectively. After infected with recombinant adenovirus carrying human wild-type p53, GM-CSF and B7-1 genes, changes in biological behavior (including drug sensitivity) of these two kinds of gene-transduced cancer cells were observed. Results Both of the cell lines were susceptible to adenovirus, all of three exogenous genes (p53, GM-CSF and B7-1) could be effectively expressed in these cell lines, their growth was suppressed, and apoptosis was induced. The drug-pumping-out function of Pgp glycoprotein on the cytomembrane of drug-resistant KB-v200 cells was markedly affected 48h after transfection of the recombinant adenovirus, revealed by increase of the amount of rhodamine 123 accumulation in the cells. The MTT assay also indicated the reversal of their sensitivity to VCR drugs. In vivo experiment in nude mice it was demonstrated reduction of tumorigenicity of the KB-v200 cells or KB-s cells infected with the recombinant adenovirus, and increase of their sensitivity to VCR. Conclusion The clinical application of this recombinant adenovirus carrying agents might be more effective in treatment of tumors with multidrug resistance (MDR).     

重组腺病毒介导入野生型p53,GM-CSF和B7-1基因对肿瘤化疗耐药细胞生物学行为的影响

目的：探讨重组腺病毒分导入野生型ｐ５３,ＧＭ－ＣＳＦ和Ｂ７－１基因对肿瘤化疗耐药细胞生物学行为的影响,为临床使用该重组腺病毒治疗多药耐药的肿瘤提供实验基础。方法：选用ｐ５３异常的ＫＢ－ｓ（ＶＣＲ敏感）和ＫＢ－ｖ２００（ＶＣＲ耐药）细胞作为肿瘤化疗药物敏感和耐药的模式细胞,感染携带人野生型ｐ５３,ＧＭ－ＣＳＦ和Ｂ７－１基因的重组腺病毒后,观察这两种转基因癌细胞的生物学行为（包括药物敏感性）的变化。结果：药物敏感和耐药细胞都对腺病毒易感,重组腺病毒携带的三个外源基因（ｐ５３、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｂ７－１基因）在两种细胞中都能得到有效表达,并且能抑制它们的生长及诱导其凋亡。耐药细胞 ＫＢ－ｖ２００在转染该重组腺病毒 ４８ｈ后,其细胞膜上 Ｐｇｐ糖蛋白的泵出药物的功能却受到显著影响,表现为罗丹明１２３在其细胞内的积累增加。ＭＴＦ的实验结果也显示出其对ＶＣＲ药物敏感性的增加,裸鼠体内实验证实了感染上述重组腺病毒的ＫＢ－ｖ２００细胞的致瘤性降低,同时能增加对化疗药物ＶＣＲ的敏感性。结论：实验研究结果提示,使用该重组腺病毒并结合化疗药物,对临床治疗多药耐药的肿瘤可能会更有效。     

不同p53状态的肝癌细胞系DNA损伤修复能力的比较

目的 观察不同p53状态的肝癌细胞在DNA损伤因素存在下，探讨p53在肝细胞癌发生过程中的作用。方法 选用内源性表达野生型p53、突变型p53、p53全基因缺失的HepG2、PLC／PRF／5、Hep3B肝癌细胞系，将含有p53结合序列的CAT报告基因质粒分别转染各细胞，通过ELISA方法检测报告基因CAT活化情况，观察p53功能状态；用细胞生长曲线比较不同p53状态的细胞生长速度的差异；给予一定剂量的紫外线照射，检测各细胞程序外DNA损伤修复(UDS)能力；观察紫外线照射后细胞克隆形成情况，反映不同细胞系在紫外线照射后细胞存活率的不同。结果 报告基因CAT在HepG2细胞表达最强，而在PLC／PRF／5、Hep3B肝癌细胞均处于较低水平，说明HepG2细胞具有功能性的p53表达；HepG2细胞生长速度明显慢于其他两种细胞；紫外线照射后，HepG2具有较好的DNA损伤修复能力以及较高的细胞生存率。结论 野生型p53具有抑制肝癌细胞生长、保持细胞良好的DNA损伤修复的功能。     

重组人p53腺病毒注射液联合顺铂对卵巢癌细胞生长及凋亡的影响

目的:探讨重组人p53基因腺病毒(recombinant adenovirus-p53,rAd-p53)注射液联合顺铂(cisplatin, DDP)对卵巢癌细胞株生长及细胞凋亡的影响.方法:利用MTT、FCM和Western 印迹法比较单独采用rAd-p53、DDP及2者联合用药对卵巢癌细胞株SKOV-3和CAOV-3细胞生长抑制、细胞周期、细胞凋亡以及p53蛋白表达的影响.结果: rAd-p53注射液对卵巢癌细胞株的生长有抑制作用,并呈时间、剂量依赖性关系;联合用药对卵巢癌细胞株生长抑制作用更显著(P<0.01),联合用药时不同的用药顺序对卵巢癌细胞株生长抑制无明显差异(P>0.05).联合用药72 h后,卵巢癌细胞株细胞周期明显阻滞于G0/G1期,S期比例明显减少,且细胞凋亡率显著升高(P<0.01).rAd-p53作用于卵巢癌细胞株72 h后,有明显的p53蛋白表达.结论:rAd-p53能将外源性野生型p53基因导入卵巢癌细胞基因组,使之表达p53蛋白,从而使肿瘤细胞的细胞周期阻滞于G0/G1期,抑制细胞生长,并促进细胞凋亡.rAd-p53与DDP联合应用,其抗肿瘤效应较单药用药更加显著.     

Recombinant adenoviral vector expressing human wild-type p53, GM-CSF,and B7-1 genes suppresses the growth of glioma in vivo

Malignant gliomas are the most common of primary brain tumors and have been proven incurable with conventional treatments. Evidence have shown that a recombinant adenoviral vector expressing human wild-type p53, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), and B7-1 genes (BB-102) may have antitumor effects in vitro. In this study, we investigated the effects of BB-102-based vaccine on glioma in vivo. An animal model using nonobese diabetic/severe combined immunodeficiency (NOD/SCID) mice with human immune system was established. The mice were vaccinated with inactivated U251 glioma cells transduced with BB-102 or adenoviral vector expressing green fluorescence protein (Ad-GFP) as a control and followed by the challenge of live U251 glioma cells. Tumor growth and antitumor responses were measured. Data showed that mice vaccinated with BB-102 had significantly reduced local tumor growth compared to mice with Ad-GFP vaccination or the control group. Histopathological analysis displayed low tumor cell density and significant infiltration of human peripheral blood lymphocytes (HuPBLs) in the tumor tissues of mice transduced with BB-102. Immunohistochemical analysis showed that mutant p53 was not expressed in tumor tissues of mice with BB-102 vaccination, and the expression level of Ki67 was significantly lower in the tumor tissues of the BB-102 group than those in the Ad-GFP group or the control group. Further study demonstrated that mice with BB-102 vaccination had significantly increased total T cell numbers, total T cell proportion, CD4+ T cell proportion, and CD8+ T cell proportion in spleens, as well as higher value of IgG, IgA, and IgE in sera. These data suggest that the recombinant adenoviral vector expressing human wild-type p53, GM-CSF, and B7-1 genes could suppress glioma in NOD/SCID mice model and might be considered as a novel strategy for glioma therapy.     

小鼠AFPcDNA真核表达载体的构建、表达及体外抗肝癌免疫活性的检测

背景与目的:探索肝癌细胞的突变基因产物——具有潜在抗原性的异常蛋白质而无法形成有效免疫原的机理,寻找肝癌的特异性抗原,并在此基础上研制出治疗肝癌的DNA疫苗将对肝癌的免疫学治疗产生积极的影响。本实验构建BALB/c小鼠具有分泌性信号肽的AFP1cDNA和去掉信号肽的AFP2cDNA真核表达载体,分别在小鼠树突细胞(dendriticcells,DCs)中表达,并观察其在体外抗肝癌免疫中的作用。方法:采用RT-PCR方法自小鼠肝癌细胞株H22中扩增出具有分泌性信号肽的AFP1cDNA和去掉分泌性信号肽的AFP2cDNA,将该基因定向插入真核表达载体PEGF-N3中;同时培养经rmGM-CSF、rmIL-4诱导的小鼠骨髓细胞,体外获取大量DCs,脂质体转染PEGF-N3/AFP1、PEGF-N3/AFP2至DCs进行表达、鉴定。将DCs疫苗与同源小鼠脾淋巴细胞混合培养,ELISA方法测定脾细胞γ-干扰素(IFN-γ)分泌活性,51Cr释放法测定脾淋巴细胞的特异性杀伤活性。结果:从H22中克隆到AFP1cDNA和AFP2cDNA,经测序完全正确,所构建的真核表达质粒PEGF-N3/AFP1和PEGF-N3/AFP2在小鼠DCs中获得稳定高效表达,其中PEGF-N3/AFP2明显刺激T细胞增殖,刺激指数(SI)为5.12±1.46,明显高于空质粒组(1.42±0.73)。AFP2/DC疫苗对H22细胞的特异性杀伤活性[(88.15±16.47)%]明显高于空质粒组[(12.72±5.45)%]。结论:成功地构建了真核表达载体PEGF-N3/AFP1和PEGF-N3/AFP2,编码去掉分泌性信号肽的PEGF-N3/AFP2转染的DC,能够诱导较强的特异性抗肝癌免疫效应。其机制可能为诱导肝癌细胞凋亡。     

应用组织芯片检测肝细胞癌组织中8种p53相关基因的表达

背景及目的:肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)的发生是一个多步骤、多基因参与的过程。目前已知与HCC相关的癌基因和抑癌基因有十余种,其中p53基因家族的功能变化是HCC发生发展过程中的重要分子事件。本研究利用组织芯片高通量的优点,探讨肝细胞癌及癌旁肝组织中p53基因家族及相关基因中8种癌基因及抑癌基因的表达差异。方法:应用Instrumedics公司生产的组织芯片制作仪,取样针直径2mm,制作成3个肝细胞癌组织芯片蜡块,包括273例肝细胞癌组织、144例癌旁肝组织及10例非肝病死亡的尸检正常肝组织。应用免疫组织化学方法检测了p16INK4a、p21WAF1、p33ING1b、p53、p57KIP2、p73、mdm2和ATM8种基因在HCC及癌旁肝组织中的表达率,同时观察乙肝病毒(hapatitisBvirus,HBV)感染与这8种基因表达间的关系。结果:3个肝癌组织芯片分别含有136、143和148个位点。8种基因在HCC和癌旁肝组织中的阳性表达率分别为p16INK4a35.9%和9.0%、p21WAF141.8%和11.1%、p33ING1b43.65%和14.6%、p5346.2%和12.5%、p57KIP239.2%和16.7%、p739.5%和2.8%、mdm241.4%、9.0%和ATM6.6%和1.4%。在癌组织中上述基因的表达强于癌旁肝组织(P<0.05);不同分化程度的HCC组织中8种基因的阳性表达率差异均不显著(P>0.05);除了p16INK4a、p21WAF1、