污蝇杆菌荧光定量PCR快速检测方法建立

目的 污蝇杆菌(Wohlfahrtiimonas chitiniclastica bacilli)是近年新发现的条件致病菌,临床上曾引起爆发性脓毒血症,本文拟建立污蝇杆菌荧光定量PCR的快速检测方法。方法 根据污蝇杆菌W.chitiniclastica SH04的全基因组DNA序列,采用Primer Express 3.0设计引物和Taqman荧光探针,建立实时荧光定量PCR的快速检测方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行验证。结果 污蝇杆菌荧光定量PCR快速检测方法具有良好的特异性,重复性试验的变异系数均<2%,灵敏度为19 CFU/反应(20μL反应体系),使用该方法检测6份人为污染的样品,结果均为阳性,6份阴性对照及空白对照均为阴性。结论 本研究建立的荧光定量PCR方法可以快速、准确地检测污蝇杆菌。     

实时荧光定量PCR快速鉴定短乳杆菌

目的:建立鉴定短乳杆菌的实时荧光定量PCR法。方法:根据GanBank登录的乳酸杆菌序列,以gyrB基因为靶目标设计引物和探针,对啤酒中分离到的6株乳酸杆菌进行实验,并对其中一个短乳杆菌样本作定量检测。结果:实时荧光定量PCR对短乳杆菌可产生特异扩增信号,对其他乳酸杆菌无响应。标准曲线的相关系数为0.97739,测得短乳杆菌样本浓度为15635拷贝/m l。结论:实时荧光定量PCR是一种快速、特异、灵敏检测短乳杆菌的方法。     

脑膜炎奈瑟菌荧光定量PCR法检测

目的 评价新型水解探针(TaqMan-MGB探针)荧光定量PCR法在检测脑膜炎奈瑟菌中的应用价值.方法 分别采用TaqMan-MGB探针荧光定量PCR法、常规PCR法和传统分离培养法检测230例无症状者咽拭子标本,比较3种方法的检出率.结果 3种方法的阳性检出率分别为10.43%,6.52%和3.48%;TaqMan-MGB探针荧光定量PCR法的检出率高于常规PCR法和传统分离培养法(P<0.001).结论 TaqMan-MGB探针荧光定量PCR法检测脑膜炎奈瑟菌具有灵敏、特异、快速方便的特点,可为流脑流行病学调查提供一种快速、方便的病原学诊断手段,具有实用价值.     

荧光定量PCR在孕妇HCMV感染检测中的应用研究

目的使用荧光定量PCR检测孕妇尿液中HCMV-DNA,提高该人群中病毒检出率。方法对广西南宁和桂林两地共600名孕妇进行尿液HCMV-DNA检测,同时进行血清HCMV-IgG和HCMV-IgM检测,对比以上两种方法在产前诊断中的应用价值。结果尿液HCMV-DNA阳性率为8.50%(51/600),血清HCMV-IgG阳性率为98.8%(593/600),HCMV-IgM阳性率为1.83%(11/600)。结论相对于传统的酶联免疫检测法,荧光定量PCR可明显提高孕妇病毒检出率,并且提供定量数据,同时使用荧光定量PCR和ELISA将为临床提供更加准确的实验室诊断结果。     

饮用水大肠菌群Taqman-MGB荧光定量PCR检测方法研究

[目的]建立快速、灵敏、特异的饮用水大肠菌群荧光定量PCR定量检测方法.[方法]以大肠菌群的lacZ基因为检测靶基因,设计荧光定量PER引物和Taqman-MGB探针,建立荧光定量PER定量反应体系,并评价荧光定量PER方法的灵敏度、特异性、重复性.[结果]建立大肠菌群的荧光定量PER检测方法.25μl荧光定量PER反应体系主要成分浓度分别为Mg2+5.0 mmol/L,dNTPs 0.2 mmol/L,引物0.2μmol/L,探针0.5μmol/L,4xROX参比荧光染料0.5μl,Taq DNA聚合酶2.0 U,模板5μl.方法可检出每微升单个拷贝大肠菌群模板,方法的特异性、重复性良好.[结论]荧光定量PER方法可快速、灵敏、特异地检出水质中大肠菌群,可为饮用水大肠菌群快速检测标准方法的建立提供参考.     

荧光定量PCR检测结核杆菌PncA基因突变研究

目的运用实时荧光定量PCR方法检测结核分支杆菌耐吡嗪酰胺(PZA)分离株PncA基因突变情况,从而探讨其水平与结核病的临床转归的相关性。方法用荧光定量PCR Taqman探针技术,以PncA基因片段设计引物,以突变发生率最高的47位(Thr→Ala)(PncA139)和85位(Leu→Pro)(PncA254)设计探针,10倍系列稀释含有目的基因的质粒,进行实时荧光定量PCR反应,建立标准曲线。并用于检测临床105份标本(TB-DNA>103)pncA基因突变表达量。结果①63例PncA139点突变表达量>102,占60%;②31例PncA254点突变表达量>102,占30%;③PncA139位突变表达量>103的患者同时也出现PncA254位突变表现,且TB-DNA表达量均>106;④PncA139位突变的高拷贝组与低拷贝组突变率比较χ2为50.44,85位点χ2为20.97,P值均<0.005,比较差异亦有明显统计意义。结论 TB-DNA高拷贝且PncA基因突变是临床结核病患者病情反复,以致迁延不愈的原因之一。     

荧光定量PCR法与ELISA法检测乙肝病毒感染相关性探讨

目的分别采用荧光定量PCR法和ELISA法检测乙肝病毒标志物,探讨两种方法的相关性。方法采集490份乙肝表面抗原呈阳性的体检者的血清,采用ELISA法和FQ-PCR两种方法进行HBV DNA定量检测,比较分析其结果。结果 HBs Ag(+),HBe Ag(+),HBc Ab(+)阳性组血清中HBV DNA阳性检出率为95.6%,HBs Ag(+),HBe Ag(+)组阳性检出率为100.0%,HBs Ag(+),HBe Ab(+),HBc Ab(+)组阳性检出率为20.6%,HBs Ag(+),HBc Ab(+)组阳性检出率为36.4%。第1组、第2组、第3组相比较,差异具有显著性(P<0.05);第3组和第4组相比差异也具有显著性(P<0.05)。不同性别感染者HBV DNA阳性检出率无显著性差异(P>0.05),但男性感染者的阳性均值略高于女性感染者。结论荧光定量PCR和ELISA两种方法在检测乙肝病毒标志物中有密切相关性,荧光定量PCR法结果更为科学可靠。     

实时荧光定量PCR法与常规PCR法检测沙门菌的比较

目的:比较实时荧光定量PCR法、常规PCR法检测沙门菌的灵敏度与特异性。方法:采用建立的实时荧光定量PCR、常规PCR方法,同时对沙门菌等细菌进行检测。结果:实时荧光定量PCR检测的灵敏度可达33 cfu/m l,且有很高的特异性,对金黄色葡萄球菌等10种相关细菌均无交叉反应,从细菌核酸提取至完成检测仅需3 h左右。结论:实时荧光定量PCR检测由于在密封环境中进行,避免了产物与环境间的交叉污染,且是2种方法中最为快速敏感的方法,适用于临床实验室的快速诊断。     

500例乙肝PCR荧光定量检测结果分析

目的分析乙肝病毒核酸(HBV-DNA)含量检测的结果与乙肝血清标志物检测结果的关系。方法用荧光定量PCR和ELISA两种方法检测500份乙肝病毒感染者血清,并对其结果进行分析。结果500例HBV-DNA定量检测阳性283例,阴性217例;52例HBsAg、HBeAg、HBcAb、HBeAb组阳性患者(大三阳)检出HBV-DNA阳性51例,66例HBsAg、HBeAg、HBcAb、HBeAb组阳性患者(小三阳)检出HBV-DNA阳性39例。结论大、小三阳两组患者检出HBV-DNA差异有非常显著性(P<0.001),联合运用乙肝标志物与HBV-DNA检测有助于乙肝的早期诊断、疗效观察和预后判断。     

嗜酸氧化亚铁硫杆菌实时荧光定量PCR检测方法的建立

〔目的〕建立一种检测进出境环保用微生物菌剂中嗜酸氧化亚铁硫杆菌(acidithiobacillus ferrooxidans,A.ferrooxidans)的实时荧光定量PCR方法。〔方法〕用9K培养基培养A.ferrooxidans标准菌株A.ferrooxidans ATCC23270,并提取基因组DNA作模板;根据GenBank中嗜酸氧化亚铁硫杆菌的16S基因序列设计合成引物和探针,用含有101 bp扩增目标产物的pGEM誖-T Easy载体质粒为阳性对照,构建标准曲线,建立荧光定量PCR检测方法,并进行方法学的评估。〔结果〕成功建立了嗜酸氧化亚铁硫杆菌的荧光定量PCR检测方法,该方法对嗜酸硫杆菌属中嗜酸氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans,A.thiooxidans)和嗜酸喜温硫杆菌(Acidithiobacillus caldus,A.caldus)无交叉反应;最少可检测到100个阳性质粒,说明有很好的敏感性;试验内变异系数为0.32%,具有很好的重复性。〔结论〕建立的嗜酸氧化亚铁硫杆菌的TaqMan探针荧光定量PCR检测方法特异性和灵敏度高、重复性好,可作为嗜酸氧化亚铁硫杆菌高通量的快速检测方法。     

腺病毒荧光定量PCR快速检测方法建立

目的 建立腺病毒双链嵌合荧光染色(SYBR Green)实时定量PCR快速检测方法,用于腺病毒感染的早期诊断及病毒核酸定量分析.方法 建立并优化SYBR Green荧光定量PCR反应体系和反应条件,评价该方法的特异性、灵敏度和重复性,同时进行熔解益线分析,构建定量分析模型,并对84份临床样本进行检测.结果 该方法与其他呼吸道病毒无交叉反应,检测灵敏度10~2拷贝/μL,熔解曲线显示单一的峰,熔解温度为(84.9±0.1)℃,临床样本检测阳性率达30.95%.结论 建立了快速、敏感、特异的腺病毒SYSR Green荧光定量PCR检测方法,适用于腺病毒的早期快速诊断.     

建立染料法荧光定量PCR检测恙虫病东方体

目的建立染料法荧光定量PCR检测恙虫病东方体。方法根据恙虫病东方体56kD外膜蛋白基因序列设计特异性引物,建立染料法(SYBR green I)实时荧光定量PCR,评估其灵敏性及特异性;并对恙虫病东方体鸡胚培养物、东方体感染小白鼠脏器标本以及恙虫病病人血样等多种样本进行检测。结果建立的荧光定量PCR标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r2=0.99),灵敏性评估显示20μl体系单PCR反应管靶基因大于28个拷贝即可被有效检测,最低检出浓度为2拷贝/μl,比普通PCR检测方法提高1~2个数量级,并且具有较好的重复性;建立的SYBR I染料法具有良好的特异性,与立氏立克次体R株等其他5种立克次体,以及被检测的其他几种病原菌DNA模板均不发生特异性扩增;用建立的染料法对东方体鸡胚培养物、东方体感染动物脏器,以及采集的现场恙虫病病人血样共59份标本进行检测,其中57份检出阳性。用该定量PCR检测恙虫病东方体实验感染小鼠的血、脾脏、肾脏、肝脏标本,结果脾脏中东方体检出量最多,肝脏和肾脏次之,血中的恙虫病东方体量较低。结论本研究建立荧光定量PCR方法均具有很高的特异性和敏感性,适合各种样本中东方体的快速检测,可用于实验室的快速诊断。     

几种甲型H1N1流感病毒SYBRGreenI荧光RT—PCR检测方法的验证

目的比较和验证5种甲型H1N1流感病毒SYBRGreenI荧光RT—PCR检测方法。方法首先使用美国NCBI网站的Primer—BLAST程序验证5种甲型H1N1流感病毒SYBRGreenI荧光RT—PCR检测方法引物的理论特异性,然后使用猪流感H1N1病毒核酸、2009年新甲型H1N1流感病毒核酸、H5N1禽流感核酸、能力验证样品作为试验样品验证方法的实验特异性。结果理论验证结果显示5对来源于文献的引物均适合于猪流感的检测,前3对可用于新型甲型H1Nl流感的检测,但只限于个别来源的毒株,与预期略有差别。实验验证结果显示,方法l可正确检出甲型流感病毒;方法2可正确检出猪流感H1N1亚型病毒、新甲型H1N1流感病毒核酸;方法3检测新甲型H1N1流感核酸时未获得阳性结果;方法4可以正确检测出猪流感H1病毒核酸;方法5可以正确检测出猪流感H1N1病毒核酸,但检测新甲型H1N1流感核酸、禽流感H5N1核酸时也为阳性。结论方法1可用于猪甲型流感和新甲型H1N1流感病毒的初筛;方法2可用于猪流感H1N1亚型病毒和新甲型H1N1流感病毒核酸的初筛;方法3不适合新甲型H1N1流感病毒核酸的检测;方法4可用于猪流感H1亚型的检测;方法5不适合于猪流感H1N1亚型病毒的检测。采用SYBRGreenI荧光RT—PCR方法检测甲型H1N1流感病毒核酸,特异性普遍不十分理想,只能用于初筛检测。     

SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测西尼罗病毒

目的建立快速、敏感和特异的检测西尼罗病毒的SYBRGreenⅠ荧光定量PCR法，用于西尼罗病毒（WNV）疾病的早期诊断。方法采用RT—PCR扩增WNV基因片段，将其克隆至T载体，重组质粒测序并进行同源性分析；阳性质粒用于替代WNV，以阳性质粒为模板，建立SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测方法，并进行敏感性和特异性检测。结果经测序证实扩增片段属于WNV，所建立的SYBRGreenⅠ荧光定量PCR法可检测到10拷贝的西尼罗病毒RNA，而对其他黄病毒科成员日本脑炎病毒及登革热病毒的检测则为阴性，表明该方法特异。结论SYBRGreenⅠ荧光定量PCR简便快速，具有较高的敏感性和特异性，可以成为一种早期检测西尼罗病毒的新方法。     

HBV cccDNA SYBR GreenⅠ荧光定量检测方法的建立及初步应用

目的 建立一种稳定、特异、敏感的乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA (cccDNA) SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法.方法 根据乙肝病毒松弛环状DNA (HBVrcDNA)与cccDNA的结构差异,设计跨越双缺口的特殊引物,并利用一种ATP依赖不降解质粒的DNA酶(Plasmid-SafeTMATP dependent DNase,PSAD)提高反应的特异性;建立荧光定量PCR标准曲线,并进行特异性、敏感性和重复性检验.应用所建立的方法评价拉米夫定和阿德福韦酯对HBVcccDNA的抑制效果.结果 该方法能特异性检测到HBV cccDNA,在2.68×1082.68×103 copies/μl检测范围之间有良好的线性关系,相关系数为-1.00,扩增效率为102％;最低检测限为2.68×101 copies/μl.拉米夫定和阿德福韦酯对HBVcccDNA均有很好的抑制效果.结论 该实验所建立的方法稳定性强、特异性好、灵敏度高,可快速定量检测HBVcccDNA,用于抗HBV药物的评价.     

食品过敏原荞麦的实时荧光PCR检测

目的:荞麦是日本法规要求强制性标识的食品过敏原,我国需要建立出口日本食品中过敏原荞麦成分的标准方法。方法:参考现有文献,采用实时PCR方法建立食品过敏原荞麦成分的检测方法。结果:研究表明建立的检测方法具有特异性,灵敏度高,检测限为1 mg/kg。结论:本方法适用于食品中过敏原荞麦成分检测。     

基于TaqMan探针双重荧光PCR检测食品中鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌

目的建立基于TaqMan探针双重荧光PCR检测鼠伤寒沙门菌和(Salmonella typhimurium,ST)和肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis,SE)的方法。方法根据ST的STM4599序列(GenBank:AERV01000023.1)和SE特异序列(GenBank:AF370707.1),分别设计引物和探针,ST探针的5'端标记FAM、SE探针的5'端标记VIC,建立基于TaqMan探针双重荧光PCR检测方法。结果 ST和SE的引物和探针分别特异性地扩增出16株ST和15株SE,而28种不同血清型沙门菌和17株变形杆菌等扩增结果均为阴性。ST和SE的双重荧光PCR扩增效率均为94.2%,R2分别为0.998和0.995,最低检测浓度分别达到300 CFU/ml、260 CFU/ml。结论建立的方法特异性好、灵敏度高,整个试验可在31h完成,是快速检测ST和SE的有效方法,可用于食品中ST和SE的特异性检测。     

实时荧光PCR检测沙门菌特异基因

目的：建立一种灵敏、快速检测沙门菌的实时荧光PCR方法.方法：针对沙门菌特异性基因invA设计引物、探针,在实时荧光PCR仪上进行扩增、检测和结果分析.结果：应用该实时荧光PCR方法,30株沙门菌检测结果均为阳性,19株非沙门菌结果均为阴性,96个肛门拭子样本增菌前后的PCR结果一致;检测灵敏度达到4 cfu/test,定量结果与培养计数无显著差异.结论：该方法检测沙门菌具有灵敏度高、快速方便的特点,且可用于定量检测.     

2011年北京市顺义区应用实时荧光PCR检测肺炎支原体检测结果分析

目的:通过对北京市顺义区2011年肺炎支原体(mycoplasma pneumonia,MP)实时荧光PCR检测数据进行分析,为支原体肺炎早期诊断及防控工作提供科学依据。方法:采用实时荧光PCR法对肺炎病例鼻咽拭子进行MP核酸检测。采用SPSS13.0对检测结果进行统计学分析。结果:117例肺炎病例中共检出MP核酸阳性18例,阳性率为15.38%。各季节、性别之间MP阳性率差异无统计学意义。分年龄组对MP阳性率进行比较,主要感染人群在35岁以下,差异具有统计学意义。结论:青少年为MP检测阳性的重点人群。MP感染与性别、发病季节无明显关系。实时荧光PCR检测对支原体肺炎的早期诊断和临床用药具有重要意义。