DFOG抑制卵巢癌A2780细胞系球形成细胞自我更新与活化FoxO3a相关

目的:研究7-二氟甲氧基-5,4’-二正辛烷氧基金雀异黄素(DFOG)抑制人卵巢癌A2780细胞系球形成细胞自我更新及其作用机制。方法:体外培养A2780细胞,干细胞条件培养基悬浮培养扩增球形成细胞(sphere forming cells,SFCs)。Western blot分析SFCs的CD133和CD44蛋白及磷酸化FoxO3a蛋白表达水平;MTT法测定SFCs增殖活性;肿瘤球形成试验检测SFCs自我更新能力。结果:A2780细胞系SFCs具有自我更新能力。与亲本细胞相比,SFCs高表达CD133及CD44并具有更高的磷酸化FoxO3a蛋白表达水平。DFOG以浓度依赖的方式抑制SFCs增殖与自我更新,并下调SFCs中磷酸化FoxO3a蛋白水平。结论:DFOG抑制人卵巢癌A2780细胞系球形成细胞自我更新与其活化FoxO3a蛋白相关。     

TWIST1基因敲低对DFOG抑制OVCAR3源性球细胞自我更新和FoxM1表达的影响

目的:探讨7-二氟甲氧基-5,4'-二-正辛烷氧基金雀异黄素通过下调Twist1/FoxM1表达抑制OVCAR3源性球细胞自我更新作用分子机制.方法:表达TWIST1 shRNA腺病毒感染OVCAR3源性球细胞敲低TWIST1基因表达.肿瘤球形成试验检查细胞自我更新能力.蛋白质印迹法检测细胞Twist1和FoxM1蛋白表达水平.结果:与OVCAR3细胞比较,OVCAR3源性球细胞具有更强自我更新能力以及高水平表达Twist1和FoxM1蛋白.TWIST1 shRNA有效抑制OVCAR3源性球细胞肿瘤球形成和下调Twist1和FoxM1蛋白表达.TWIST1 shRNA协作DFOG(5μM)抑制OVCAR3源性球细胞肿瘤球形成和Twist1和FoxM1蛋白表达.结论:DFOG可能通过调控Twist1表达抑制FoxM1表达,进而抑制OVCAR3源性球细胞自我更新.     

DFOG对卵巢癌OVCAR3源性球细胞迁移和Twist1/FoxM1表达的影响

目的 :检查金雀异黄素(genistein,GEN)及其新型合成类似物7-二氟甲氧基-5,4'-二-正辛烷氧基金雀异黄素(7-difluoromethoxyl-5,4'-di-n-octyl genistein,DFOG)对人卵巢癌OVCAR3源性球细胞迁移和Twist1/FoxM1蛋白表达的作用.方法 :Transwell小室细胞迁移试验检测细胞迁移率.蛋白质印迹分析细胞Twist1和FoxM1蛋白表达水平.结果 :与OVCAR3细胞相比,OVCAR3源性球细胞迁移率更高.GEN(40μM)或DFOG(5μM和10μM)抑制OVCAR3源性球细胞迁移.此外,GEN(40μM)或DFOG(5μM和10μM)平行地下调Twist1和FoxM1蛋白表达.结论 :GEN及其类似物DFOG抑制OVCAR3源性球细胞体外迁移与其抑制Twist1和FoxM1蛋白表达相关.     

DFOG下调CD44表达抑制SKOV3卵巢癌干样细胞体外侵袭和迁移

目的 ：研究金雀异黄素类似物7-二氟甲氧基-5,4’-二正辛基金雀异黄素（7-difluoromethoxyl-5,4’-di-n-octyl genistein,DFOG）能否通过下调肿瘤干细胞表面标志蛋白CD44表达抑制SKOV3源性卵巢癌干样细胞（OCSLCs）体外侵袭和迁移能力。方法 ：慢病毒递送系统敲低CD44基因表达（Lent-shCD44）、DFOG(0.1、1.0和10.0μM)或DFOG(10μM)联合Lent-shCD44处理OCSLCs细胞。免疫蛋白印迹法分析OCSLCs细胞CD44蛋白的表达水平。Transwell小室侵袭试验检测OCSLCs细胞体外侵袭能力以及伤口愈合法检测OCSLCs体外迁移能力。结果 ：Lent-shCD44有效降低SKOV3源性OCSLCs细胞侵袭率和迁移能力。DFOG以剂量依赖方式下调OCSLCs细胞肿瘤干细胞标志物蛋白CD44表达和降低侵袭能力和迁移能力。此外,Lent-shCD44协作DFOG抑制OCSLCs细胞侵袭能力和迁移能力。结论 ：DFOG通过下调CD44蛋白表达抑制细胞OCSLCs细胞侵袭能力和迁移能力。     

白介素-8对SKOV3细胞系卵巢癌干样细胞特性的影响

目的:研究白介素-8(IL-8)能否促成人卵巢癌SKOV3细胞系细胞肿瘤干细胞样细胞特性.方法:用添加或未添加重组人IL-8(rhIL-8:10.0 ng/mL)的干细胞条件培养基处理SKOV3细胞.肿瘤球形成和琼脂集落形成试验测定球形成率和集落形成率.蛋白质印迹分析肿瘤干细胞标志蛋白CD133和CD44表达水平.结果:rhIL-8(10.0 ng/mL)显著地增高SKOV3细胞肿瘤球形成率和琼脂集落形成率.此外,rhIL-8(10.0 ng/mL)上调SKOV3细胞CD133和CD44蛋白表达.结论:rhIL-8具有促进SKOV3细胞肿瘤干细胞样细胞特性作用.     

7-二氟甲氧基-5,4'-二-正辛烷氧基金雀异黄素下调FOXM1抑制卵巢癌细胞生长

目的:研究新型金雀异黄素衍生物7-二氟甲氧基-5,4'-二正辛烷氧基金雀异黄素(DFOG)抑制人卵巢癌SKOV3细胞生长作用及其分子机制。方法:采用MTT法和集落形成法分析金雀异黄素以及DFOG对人卵巢癌SKOV3细胞生长的抑制作用。采用多种分子生物学技术如RT-PCR、Western blot、siRNA以及cDNA转染等探索分子机制。结果:金雀异黄素的9种衍生物抑制SKOV3细胞增殖活性作用均比金雀异黄素强,其中DFOG的抑制作用最强。DFOG和金雀异黄素导致SKOV3细胞生长抑制。DFOG能有效降低FOXM1和它下游基因(CDC25B,cyclin B)表达,上调p27KIP1表达。siRNA下调FOXM1后,再用DFOG处理,增强DFOG的细胞生长抑制作用。cDNA转染上调FOXM1能削弱DFOG诱导细胞生长抑制作用。结论:FOXM1介导金雀异黄素和DFOG抑制卵巢癌细胞生长作用,提示FOXM1可能成为治疗人卵巢癌的一个新靶标。     

8-溴-7-甲氧基白杨素对Huh-7细胞系肝癌干细胞样细胞自我更新的影响

目的:研究8-溴-7-甲氧基白杨素(BrMC)抑制源自人肝细胞癌Huh-7细胞系细胞肿瘤球形成细胞即肝癌干细胞样细胞(LCSLCs)自我更新作用。方法:体外培养人肝癌Huh-7细胞系细胞,干细胞条件培养基悬浮培养法富集和扩增LCSLCs。MTT比色法测定细胞活性;肿瘤球形成法检测自我更新能力;FITC-CD133标记FCM分析CD133表达。结果:干细胞条件培养基悬浮培养6天,Huh-7细胞形成非粘附、三维生长的肝癌球体细胞即LCSLCs。与Huh-7细胞相比,BrMC抑制LCSLCs细胞活性作用更强(P<0.05),并以浓度依赖性方式减少肿瘤球数目(P<0.05),降低CD133蛋白表达(P<0.05)。结论:干细胞条件培养基悬浮培养能分离和富集LC-SLCs;BrMC具有抑制LCSLCs细胞自我更新能力作用,其作用机制与降低干细胞标记物CD133蛋白的表达相关。     

CD90作为卵巢癌干细胞标志物的相关研究

目的 研究 CD90 作为分选卵巢癌干细胞标志物的可行性。方法 选择笔者实验室制备的人卵巢癌顺铂耐药细胞株 SKOV3-MD3,采用 CD90 单抗染色,应用流式细胞仪分选获得 CD90⁺ 细胞及 CD90-细胞。体外实验检测两个不同亚群细胞的体外悬浮球形成能力(自我更新能力)、分化潜能、表达干细胞标志物的差异,体内动物实验检测不同亚群细胞皮下成瘤能力是否有差异。结果 人卵巢癌细胞 SKOV3-MD3 中存在具有干性特征的 CD90⁺ 细胞,CD90⁺ 细胞比CD90- 细胞具有更高的体外悬浮球形成能力(自我更新能力)及分化潜能,表达更高水平的干细胞标志物,以及具有更强的皮下成瘤能力,差异有统计学意义。结论 CD90 可能是分选卵巢癌干细胞的分子学标志物。     

DFOG对A549细胞生长及FoxM1表达的影响

目的:研究7-二氟甲氧基-5,4′-二-正辛烷氧基金雀异黄素(DFOG)抑制人肺癌细胞生长作用及机制.方法:用不同浓度DFOG处理体外培养A549细胞后,流式细胞术(FCM)检测细胞周期分布;平皿集落形成法测定细胞生长;Western blot分析FoxM1蛋白表达.结果:DFOG处理24 h导致A549细胞系G2期细...     

紫花牡荆素对卵巢癌OVCAR-3细胞系肿瘤球形成的影响

目的:研究紫花牡荆素(casticin,CAS)是否抑制卵巢癌OVCAR-3细胞系肿瘤球形成能力。方法:肿瘤球形成法检测不同浓度CAS(1.0、3.0、10.0μmol/L)对OVCAR-3细胞系肿瘤球形成能力的影响。Western Blot分析探讨CAS影响OVCAR-3细胞系肿瘤球形成机制是否涉及其下调干细胞标志物CD44蛋白表达。结果:CAS以浓度依赖方式抑制OVCAR-3细胞系肿瘤球形成能力。与亲本细胞相比,OVCAR-3细胞系球形成细胞高表达CD44蛋白。CAS显著下调OVCAR-3细胞系球形成细胞CD44蛋白表达。结论:CAS抑制卵巢癌OVCAR-3细胞系肿瘤球形成与其下调干细胞标志物CD44蛋白表达相关。     

小鼠白介素-12在人卵巢癌SKOV3中的抗肿瘤作用

目的观察转染至SKOV3卵巢癌细胞中小鼠IL-12全长基因的质粒能稳定表达相关细胞因子基础上,在脾细胞存在的情况下对SKOV3肿瘤细胞的杀伤作用.方法MTT方法检测对SKOV3卵巢癌细胞增殖的影响,免疫组化法检测SKOV3卵巢癌细胞表面IL-12蛋白的表达.结果转染后癌细胞免疫组化可见IL-12表达,在脾细胞的作用下,MTT结果显示IL-12对SKOV3卵巢癌细胞有抑制其增殖的作用,P＜0.05.结论成功地将IL-12基因转染至SKOV3卵巢癌细胞中并稳定表达相关细胞因子,在脾细胞存在情况下对SKOV3细胞有抑制其增殖作用,从而杀伤卵巢癌细胞,具有抗肿瘤作用.     

金雀异黄素抑制肝癌干细胞样细胞的特性及对氟尿嘧啶耐药性的影响

目的：研究金雀异黄素对SMMC-7721细胞系肝癌干细胞样细胞特性以及氟尿嘧啶敏感性的影响。方法不同浓度金雀异黄素处理SMMC-7721细胞系球形成细胞。肿瘤球形成法检测自我更新能力。MTT比色法测定氟尿嘧啶药物敏感性。Western blot分析干细胞标志物CD133、CD44、Gli1和ABCG2蛋白表达。结果金雀异黄素显著抑制SMMC-7721细胞肿瘤球形成,并优先抑制球形成细胞增殖活性(P<0.05)。金雀异黄素(10μmol/L)有效逆转球形成细胞对氟尿嘧啶的耐药性。金雀异黄素降低CD133、CD44、Gli1和ABCG2蛋白表达水平。结论金雀异黄素抑制肝癌干细胞样细胞特性和氟尿嘧啶耐药性,其作用机制与抑制干细胞标志物蛋白表达和阻断Hedgehog信号传导有关。     

结肠癌细胞株SW480中CD133~+的分选及Bmi-1基因的表达

目的:观察结肠癌细胞株SW480中CD133+和CD133-细胞的肿瘤干细胞样生物学特性,并分析CD133+和CD133-细胞中Bmi-1基因的表达量的差异。方法:采用流式细胞仪分选出CD133+和CD133-细胞,观察对比CD133+和CD133-细胞体外成球能力及增殖能力。用Real-time PCR检测CD133+和CD133-细胞中Bmi-1基因的表达量。结果:(1)SW480细胞中CD133+细胞所占比例为7.02%。(2)CD133+细胞体外无血清培养4 d后可成球且速度生长;CD133-细胞在干细胞培养基中不能形成细胞球,但在含血清的培养基中能贴壁分化,连续传代。无血清培养基中,CD133+细胞增殖能力强于CD133-细胞。(3)Bmi-1 m RNA在CD133+细胞的中表达显著高于CD133-细胞。结论:结肠癌细胞株SW480中CD133+所占比例很少,但其增殖能力强,Bmi-1 m RNA在CD133+细胞的中高表达,可能与肿瘤的发生发展有关。     

人HCT116结肠癌细胞系中CD133+结肠癌干细胞分离及鉴定

目的 从人结肠癌细胞系(HCT116)中分离鉴定结肠癌干细胞,并观察其体外生物学特性.方法 利用RT-PCR、免疫荧光、流式细胞等技术检测HCT116细胞中CD133的表达情况;利用免疫磁珠分选技术分选CD133+细胞;采用无血清培养基培养分选后的CD133+细胞鉴定其体外增殖特性;采用含血清培养基诱导干细胞克隆球分化并采用免疫组化检测CK20表达情况鉴定其分化特性.结果 HCT116细胞系中存住CD133+细胞,免疫磁珠能有效的分选CD133+细胞,分选后的阳性含量为91.92%,分选后的阳性细胞具有典型干细胞的体外增殖、分化特性.结论 CD133+结肠癌干细胞在体外具有和普通干细胞类似的无限增殖、自我更新和分化能力,同时它们也表达ABCG2等耐药相火蛋白.     

人卵巢癌SKOV3细胞筛选获得的肿瘤干细胞样细胞在血管生成拟态形成中的作用

目的探讨卵巢癌SKOV3细胞中分离肿瘤干细胞样细胞的生物学特性及其在血管生成拟态（VM）形成中的作用。方法 采用无血清悬浮培养法对SKOV3细胞培养传代至第7代;流式细胞术测定亲代SKOV3细胞及第1、3、5、7代分选细胞CD133、 CD117阳性细胞比例;平板克隆形成和小鼠体内成瘤实验鉴定分选细胞（第7代,下同）生物学特性;三维立体培养比较分选细 胞与亲代SKOV3细胞形成VM的能力。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)方法及Western blot法检测分选细胞与亲 代SKOV3细胞的基质金属蛋白酶2,9的表达水平。结果SKOV3部分细胞能在无血清培养基中形成悬浮生长的细胞球,可连 续传代至第7代;流式细胞术结果显示CD133、CD117阳性细胞比例随传代递增。分选细胞克隆形成率高于亲代SKOV3细胞 （P<0.01）。小鼠体内成瘤实验显示第7代悬浮细胞的成瘤率（6/6）明显高于亲代细胞的成瘤率（0/6）。三维立体培养发现分选 细胞比亲代SKOV3细胞VM形成能力强。第7代分选细胞基质金属蛋白酶2,9基因和蛋白表达较SKOV3细胞均增高,差异均 具有统计学意义（P<0.01）。结论采用无血清悬浮培养法培养的SKOV3分选细胞具有肿瘤干细胞的生物学特性,具有较强的 VM形成能力,可能在VM形成中发挥作用。     

5,4’-二-正辛烷氧基-7-二氟亚甲基异黄酮体外抗人卵巢癌作用研究

目的:研究5,4’-二-正辛烷氧基-7-二氟亚甲基异黄酮(DOdFMG)体外抗人卵巢癌作用。方法:体外培养CoC1细胞,MTT比色法测定DOdFMG对CoC1细胞增殖的影响;台盼蓝染色细胞计数法评价DodFMG对CoC1细胞的生长抑制作用;AO/EB染色法荧光显微镜观察DOdFMG诱导CoC1凋亡细胞的形态学改变;Western blotting法分析DOdFMG对CoC1细胞NF-κB蛋白表达和活性的影响。结果:MTT比色法结果显示,DOdFMG有效抑制CoC1细胞增殖活性,呈剂量依赖性;其IC50值为11.9μM。DOdFMG显著抑制CoC1细胞的生长,DOdFMG(10.0μM)使CoC1细胞群体倍增时间从37.8 h(溶媒对照组)延长到50.6 h;AO/EB染色荧光显微镜观察DOdFMG处理后,部分CoC1细胞呈现典型凋亡细胞形态特征;Western blotting分析结果表明:DOdFMG抑制NF-κB/p65表达,呈浓度和时间依赖性。结论:DOdFMG具有抑制体外培养人卵巢癌CoC1细胞增殖、生长和诱导细胞凋亡作用;其作用与抑制NF-κB/p65表达有关。     

片仔癀对肝癌干细胞增殖及凋亡的影响

目的利用克隆球培养法富集肝癌干细胞,研究片仔癀对肝癌干细胞增殖及凋亡的影响。方法采用克隆球培养法对肝癌干细胞进行富集,采用RT-PCR检测肝癌细胞及肝癌干细胞中自我更新基因Oct-4m RNA的表达;利用流式细胞仪检测肝癌细胞及肝癌干细胞表面标记蛋白CD133、CD90表达;采用台盼蓝计数方法检测片仔癀对肝癌干细胞增殖的影响;利用Hoechst33342染色法检测片仔癀对肝癌干细胞凋亡的影响。结果采用克隆球培养法可富集成球生长的肝癌干细胞;与肝癌细胞比较,肝癌干细胞Oct-4、CD133、CD90高表达（P<0.05）;片仔癀给药后可显著抑制肝癌干细胞的增殖（P<0.05）,并增加肝癌干细胞中凋亡的细胞。结论片仔癀具有抑制肝癌干细胞增殖及诱导其凋亡的作用。     

CD146过表达对SKOV3细胞在裸鼠体内成瘤能力的影响

目的：研究 CD146基因在卵巢癌细胞 SKOV3中过表达对其接种裸鼠皮下生成肿瘤能力的影响。方法:以脂质体介 导的CD146基因转染卵巢癌细胞SKOV3,G418筛选阳性克隆细胞,并经Western blot鉴定其过表达CD146蛋白。分别应用MTT 与软琼脂克隆形成试验评价过表达 CD146克隆细胞对细胞增殖与体外集落形成能力的影响,并将这些细胞接种裸鼠皮下组 织,每周观察、记录肿瘤的生长状况至裸鼠处死,称量肿瘤重量并对肿瘤组织进行免疫组织化学染色观察。结果:SKOV3细胞经 脂质体转染与 G418筛选后,可获得过表达 CD146的阳性克隆细胞。CD146过表达明显抑制了 SKOV3细胞的体外增殖能力与 集落形成能力,亦明显抑制了裸鼠皮下的肿瘤生成能力,其肿瘤重量与体积明显比对照组小（P < 0.05）。免疫组织化学染色结 果表明过表达CD146的SKOV3细胞接种裸鼠生成的肿瘤组织仍可高表达CD146蛋白分子。结论:CD146过表达明显抑制卵巢 癌细胞SKOV3的体外增殖能力与裸鼠体内的致瘤性,可能是卵巢癌预后的一个潜在分子标记。     

曲古菌素A抑制乳腺肿瘤干细胞的自我更新

目的研究组蛋白乙酰化酶抑制剂曲古菌素A对乳腺肿瘤干细胞自我更新的影响;初步研究其抑制乳腺肿瘤干细胞自我更新的机制。方法悬浮培养乳腺癌细胞系MDA-MB-468、MDA-MB-231、MCF-7和SKBR3,用不同浓度曲古菌素A处理悬浮培养乳腺癌细胞7 d,用0.1%DMSO作对照;用次级细胞球形成率和乳腺癌细胞初级细胞球细胞中肿瘤干细胞即CD44+/CD24-细胞群的百分比评价曲古菌素A对乳腺癌干细胞自我更新的影响;乳腺癌细胞初级细胞球细胞中CD44+/CD24-细胞群的百分比用流式细胞仪检测,凋亡细胞百分比用Annexin-V法在流式细胞仪检测,Nanog、Sox2和Oct4 mRNA的表达用定量PCR法检测。结果100 nmol/L和500 nmol/L曲古菌素A均能部分抑制4个乳腺癌细胞系中肿瘤干细胞的自我更新,但10 nmol/L不行;500 nmol/L曲古菌素A诱导乳腺癌细胞初级细胞球细胞凋亡;曲古菌素A能下调乳腺癌细胞初级细胞球细胞Nanog和Sox2 mRNA的表达。结论曲古菌素A能部分抑制乳腺癌干细胞的自我更新,其机制与其能下调乳腺癌初级细胞球细胞Nanog和Sox2表达相关联,提示临床可用低浓度组蛋白乙酰化酶抑制剂和其他抗癌药物联用以便获得较好的乳腺肿瘤干细胞自我更新抑制效果,胚胎干细胞核心转录因子Nanog和Sox2可能作为肿瘤治疗的新靶标。     

hsa-miR-877-3p通过靶向MCM10调控卵巢癌细胞迁移和活性氧产生

目的 探讨has-miR-877-3p调控卵巢癌细胞迁移和活性氧（ROS）产生的作用机制。方法 运用生物信息学分析hsa-miR-877-3p在卵巢癌组织中表达,RT-qPCR检测卵巢癌细胞株中hsa-miR-877-3p表达。构建hsa-miR-877-3p过表达及抑制SKOV3细胞,RNA干扰技术敲低SKOV3细胞中MCM10基因,划痕实验及流式细胞术分别检测细胞迁移、ROS水平。结果 hsa-miR-877-3p在卵巢癌中表达低于正常组织（P<0.01）,其在卵巢癌细胞株SKOV3、A2780、A1847和8910中表达也降低（P<0.01）。hsa-miR-877-3p过表达抑制SKOV3细胞迁移、增加ROS水平（P<0.01）,而抑制hsa-miR-877-3p表达增加SKOV3细胞迁移（P<0.01）。MCM10基因沉默抑制SKOV3细胞迁移、促进ROS表达（P<0.01）。结论hsa-miR-877-3p可以通过调控MCM10基因抑制SKOV3细胞迁移并提高其活性氧水平。