hAPG12-EGFP融合基因真核表达载体的构建及其在酵母中的表达

目的本研究旨在构建大肠杆菌-酿酒酵母真核表达载体pESC-URA-EGFP-hAPG12,并将构建好的载体转化到酵母。方法从pEGFP-C2中扩增出增强绿色荧光蛋白EGFP基因,定向亚克隆到真核表达载体pESC-URA;hAPG12插入到EGFP基因氨基末端;构建的载体转化到酵母。结果EGFP和hAPG12基因正确亚克隆到pESC-URA中,EGFP-hAPG12融合蛋白在酵母中表达。结论构建了具有报告基因及hAPG12的重组真核表达载体pESC-URA-EGFP-hAPG12。     

人自噬基因hATG12转染对酿酒酵母自噬过程的作用

目的 探讨人自噬基因ATG12(hATG12)在酵母自噬过程中的作用. 方法 转化重组质粒pESC-URA-EGFP-hATG12(实验组)或pESC-URA-EGFP(对照组)的酵母用不同方法诱导自噬后,以荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(EGFP)和含hAtg12的融合蛋白(EGFP-hATG12)在酵母中的表达与定位;以透射电镜观察前自噬体结构、自噬体和自噬小体的分布及结构特点. 结果 2组酵母细胞质内均见荧光,液泡内未见荧光,实验组荧光呈小点状分布;电镜下见自噬体由双层膜囊结构延伸而来,该双层膜囊结构靠近细胞膜.液泡内自噬小体由单层膜包裹. 结论 hATG12参与酵母自噬体最初的形成过程,定位于自噬体外膜上,在自噬体形成后脱离自噬体.自噬体膜最初可能来源于细胞膜.     

EST3-EGFP融合蛋白重组体的构建和表达

目的 构建EST3一EGFP融合蛋白穿梭载体并检测其表达。方法 重叠延伸PCR获取EST3一EGFP融合基因,克隆至pTriEx-4穿梭载体中,重组体转化至细菌Rosetta（De3）pLacI,诱导蛋白的表达,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定表达的融合蛋白;免疫印迹法检测重组蛋白的免疫学活性;荧光显微镜观察转化宿主细菌的发光活性。结果 成功构建了EST3EGFP重组体;融合蛋白主要分布于表达菌细胞质中;免疫印迹杂交检测表明重组蛋白具有EST3的免疫原性;诱导后的菌体在荧光显微镜下可见强烈的绿色荧光。结论 成功构建的EST3一EGFP穿梭表达载体具有EST3免疫原性和GFP发光特性。     

人自噬基因hAPG_(12)的克隆及其重组真核表达载体的构建

目的:探讨克隆人自噬基因h APG12 ,构建重组真核表达载体p EGFP- C2 -h APG12 ,为进一步研究h APG12 的功能奠定基础。方法:从正常人外周血单个核细胞中提取总RNA,采用两步法RT- PCR,首先把RNA逆转录为c DNA,而后通过一对h APG12 的特异性引物扩增出目的基因,PCR产物与测序载体p UC18连接后转化到大肠杆菌DH5 α,而后对单菌落进行菌落PCR、酶切和测序鉴定。将测序正确的h APG12 亚克隆入真核表达载体p EGFP-C2 ,该重组载体转化到大肠杆菌DH5 α后进行菌落PCR和酶切鉴定。结果:测序结果表明从正常人外周血单个核细胞中所获得的h APG12 c DNAs含有2 2 5个碱基,与Genbank( BC0 1 1 0 33)序列完全一致。构建的重组真核表达载体经鉴定证实h APG12 基因已完全正确亚克隆到p EGFP- C2 。结论:成功克隆了人自噬基因h APG12 并构建了具有报告基因-增强绿色荧光蛋白( EGFP)基因的重组真核表达载体p EGFP- C2 - h APG12 ,为以后研究h APG12 的功能奠定基础     

自噬相关基因LC3B真核表达载体构建及胃癌细胞自噬的观察

目的:构建人自噬相关基因微管相关蛋白1轻链3B(microtubule associated protein 1 light chain 3B,LC3B)真核表达载体,并鉴定其生物学功能.方法:通过RT-PCR方法扩增得到人LC3B cDNA,应用基因重组技术构建pEGFP-C1-LC3B真核表达载体,通过酶切和测序进行鉴定.将pEGFP-N1-LC3B表达载体转染胃癌细胞MKN1,倒置荧光显微镜观察饥饿诱导后细胞中EGFP-LC3B的表达及分布变化.结果:通过测序鉴定,pEGFP-N1-LC3B真核表达载体序列正确,编码框正确.转染后的MKN1细胞经饥饿诱导后,检测发现EGFP-LC3B由散在分布向点状分布改变,即生成细胞自噬体.结论:成功构建了人自噬相关基因LC3B真核表达载体,并证实饥饿诱导胃癌细胞自噬的发生,为进一步研究自噬在肿瘤中的作用机制奠定了基础.     

增强型绿色荧光蛋白原核表达载体的构建及表达

目的 构建以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为标记的原核表达栽体,并观察EGFP基因在大肠杆菌中的表达情况.方法 据已知的EGFP基因序列,设计引物,并引入Nde Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点.采用PCR技术从含有EGFP的质粒pEGFP-C1中克隆EGFP编码序列;将其亚克隆入表达载体pTWIN1,得到以EGFP为标记的原核表达载体pTWIN-EGFP.转化大肠杆菌ER2566菌株,IPTG诱导EGFP基因表达.结果 经过IPTG诱导后,细菌培养物在长波紫外线的照射下,发出明亮的绿色荧光.结论 成功构建了原核表达载体pTWIN-EGFP,为应用EGFP作为报告基因和筛选标记奠定了实验基础.     

抗NI-35重组单链抗体表达载体的构建与融合表达

目的：重新设计并人工合成抗NI-35重组单链抗体(anti-NI-35-scFv)的cDNA克隆，构建其表达载体，在原核系统中实现初步表达。方法：根据抗NI-35抗体的轻链重链序列，重新设计适于在大肠杆菌中表达的基因片段，经退火、复性连接成目的片段后，克隆到克隆栽体pUC—18中，经全自动序列分析仪测序证实，再亚克隆至表达栽体pET-28a( )，转化大肠杆菌BL21，诱导表达。结果：合成的基因序列与设计的仅差一个碱基，目的基因连接方向及阅读框架正确；SDS-PAGE检测显示，表达出相对分子量31kDa的融合蛋白，并得到了良好的生物活性。结论：抗NI-35重组单链抗体基因表达载体的构建和表达，为深入研究其应用于神经系统的损伤和修复奠定了基础。     

致病性大肠杆菌绿色荧光蛋白标记

目的:用增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)标记致病性大肠杆菌(enteropathogenic escherichia coli,EPEC),以方便研究细菌的黏附。方法:以真核表达载体p EGFP-C1为模板设计引物,采用PCR方法扩增EGFP基因并测序后,克隆入原核表达质粒载体p Trc99a,转染EPEC,用荧光显微镜观察IPTG诱导后EPEC对Hep-2细胞的黏附及荧光表达情况。结果:成功构建原核表达质粒p Trc99a-EGFP和菌株EPEC/EGFP,黏附到Hep-2细胞表面的细菌克隆能够表达绿色荧光蛋白。结论:对EPEC进行了EGFP标记,为计数细菌的黏附提供方便。     

人生长激素的酵母/哺乳动物穿梭载体的构建

目的酿酒酵母已被证实可作为载体应用于口服基因治疗及免疫中。为研究人生长激素(HGH)以酿酒酵母作为运送载体的口服基因药物,需要构建一种能够在酵母中复制而在哺乳动物细胞表达的HGH穿梭载体。方法利用ECHO克隆系统先构建出HGH的哺乳动物表达载体,使HGH处于CMV启动子的调控下;然后设计引物扩增CMV-HGH片段,连接到酿酒酵母表达载体pESC-URA中,构建HGH的酵母/哺乳动物穿梭载体。结果经EcoRI单酶切、EcoRI/SpeI双酶切、菌落PCR以及序列测定鉴定,确认所构建的确为酵母/哺乳动物穿梭载体pESC-CMV-HGH。结论成功构建的穿梭载体可在酿酒酵母中复制,在哺乳动物中受CMV启动子的调控进行表达,为HGH的口服基因药物研制打下了基础。     

增强型绿色荧光蛋白原核表达纯化与多克隆抗体的制备

目的：进行增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的克隆、原核表达和纯化以及多克隆抗体的制备，为以后纯化EGFP融合蛋白奠定基础。方法：构建pGEX-4T3—EGFP重组质粒，在大肠杆菌BL21中进行原核表达，用亲和层析法纯化GST—EGFP，免疫BAB／c小鼠制备EGFP多克隆抗体。结果：①目的蛋白GST—EGFP表达量为8g／L。②获得纯抗体溶液5m1。浓度为0．4g／L。③EGFP抗体在1：100000稀释度时，Western blot检测条带清晰，背景干净。结论：通过优化诱导条件，利用大肠杆菌可低成本获得大量GST—EGFP。直接使用GST—EGFP融合蛋白免疫BAB／c小鼠，可在较短时间内大量制备EGFP多克隆抗体。     

Nar1基因酵母表达载体的构建及表达鉴定

目的:构建Nar1基因的酵母表达载体,并纯化His-Nar1融合蛋白,为进一步研究Nar1的相互作用蛋白及其功能奠定基础。方法:通过PCR扩增Nar1全长基因;通过定向克隆的方法将Nar1片段与载体pYES2/NTC连接;通过乙酸锂转化法把重组质粒转化入野生型酵母菌株INVSc1;再通过免疫沉淀的方法纯化His-Nar1融合蛋白;通过Western blot检测靶蛋白。结果:DNA测序验证穿梭表达质粒pYES2/NTC-Nar1构建成功,Western blot检测到融合蛋白His-Nar1的表达。结论:成功构建Nar1酵母过表达载体,并且可以有效表达融合蛋白His-Nar1。     

NP9蛋白的原核表达及纯化

目的构建表达人NP9融合蛋白的重组体并进行融合蛋白的原核表达及NP9蛋白的分离和纯化。方法通过聚合酶链反应（PCR）得到NP9基因的编码区序列，克隆到原核表达载体pGEX-6P-3上构建重组NP9原核表达质粒。转化大肠杆菌后通过SDS-PAGE电泳和Western blotting鉴定融合蛋白表达。使用GSTFF层析柱分离纯化NP9蛋白。结果得到序列正确的NP9基因及重组原核表达质粒pGEX-6P-3-Np9，SDS-PAGE电泳和Western blotting证实重组质粒能够在大肠杆菌内受IPTG诱导表达，层析分离得到分子量为大约14kDa单一的NP9蛋白。结论成功构建了表达NP9融合蛋白的原核表达载体，该栽体能在细菌内表达出GST—NP9融合蛋白．有效分离得到NP9蛋白．     

Ag85a-卡介苗重组疫苗的构建及鉴定

目的 构建结核分枝杆菌ag85a-卡介苗重组疫苗,研究其免疫原性及抗结核作用,以期获得结核病预防性或治疗性疫苗.方法 通过基因工程重组技术将结核分枝杆菌保护性抗原Ag85a的编码基因与穿梭质粒载体pYUB295重组,通过电穿孔技术导入卡介苗中,应用PCR扩增、PAGE电泳鉴定重组卡介苗.结果 通过PCR扩增获得约800 bp的ag85a基因,与穿梭表达载体pYUB295重组后,通过PCR扩增、限制性内切酶酶切、DNA测序鉴定表明ag85a基因正确插入到pYUB295质粒中.将重组质粒通过电穿孔导入卡介苗,重组卡介苗在抗性培养基上生长良好.pYUB295-ag85a重组卡介苗基因组DNA的PCR扩增以及培养上清液的PAGE电泳表明:ag85a-卡介苗重组疫苗构建正确,Ag85a蛋白在卡介苗中分泌表达.结论 成功构建了ag85a-卡介苗重组疫苗.     

分枝杆菌融合表达ICL-GFP穿梭质粒的构建及鉴定

目的:构建融合表达ICL-GFP的E.coli-分枝杆菌穿梭载体,在耻垢分枝杆菌(MS)中融合表达结核分枝杆菌(MTB)潜伏感染相关蛋白异柠檬酸裂合酶(ICL)及绿色荧光蛋白(GFP),为抗MTB ICL的表达及抗MTB潜伏感染的药物筛选奠定基础. 方法:采用PCR法从MTB H37Rv基因组DNA中扩增出icl基因,克隆入pcDNA3.1( ), 构建重组质粒pcDNA-icl. 用PCR法自pUV15中扩增出gfp基因,克隆入pcDNA-icl中icl基因片段的下游,构建重组质粒pCDIG. 鉴定无误后,将icl-gfp融合基因从pCDIG中亚克隆入pUV15,构建融合表达ICL-GFP的穿梭质粒pUVIG. 将pUVIG电转化MS,经潮霉素B筛选后,抽提质粒用PCR法鉴定. 培养MS的阳性转化子,在荧光显微镜下观察GFP的表达,Western-blot法检测ICL的表达并检测ICL-GFP融合蛋白的ICL活性. 结果:所克隆的icl序列出现一个碱基突变,为无义突变. gfp序列完全正确. 重组质粒pUVIG能在E.coli-MS间进行穿梭,并在MS中表达ICL-GFP融合蛋白. 该融合蛋白同时具有GFP的自发荧光功能和ICL的酶活性. 结论:成功构建能在MS中表达ICL-GFP融合蛋白的E.coli-分枝杆菌穿梭质粒.     

细菌-酵母穿梭表达质粒pGBKT7-LMP1 的构建与鉴定

[目的]构建能在酵母中表达EBV潜伏膜蛋白1(LMPl)的穿梭表达质粒pGBKT7-LMP1.[方法]RT-PCR方法扩增EB病毒LMP1全外显子片段,利用DNA重组技术将其定向插人细菌-酵母穿梭质粒pGBKT7的T7启动子下游.[结果]限制性内切酶酶切和DNA测序分析证实RT-PCR获得的LMP1 cDNA片段与GenBank中的数据完全吻合;LMP1准确克隆人pGBKT7的多克隆位点,未改变读码框架.[结论]成功构建了穿梭质粒pGBKT7-LMP1.     

促血管生成素-1腺病毒表达载体构建及鉴定

目的构建表达促血管生成素-1（Ang-1）的腺病毒载体,为研究Ang-1防治慢性缺血性疾病提供前期基础。方法通过PCR从pMD18-Ang-1质粒中扩增Ang-1基因,酶切连接入载体pDC315-GFP并转化大肠杆菌感受态细胞,PCR鉴定测序分析;借助AdMax腺病毒包装系统实现重组,提取质粒DNA并转染HEK293细胞,观察GFP荧光并以Western Blot检测目的蛋白的表达,以终点稀释法测定病毒滴度。结果重组质粒pDC315-GFP-Ang-1经PCR鉴定阳性克隆,测序分析比对正确,重组腺病毒转染HEK293细胞后可观察到GFP-Ang-1融合蛋白,病毒滴度1×1011PFU/ml。结论成功构建了表达Ang-1基因的腺病毒载体。     

克隆大鼠内皮素B受体基因重组腺病毒穿梭质粒的构建及鉴定

目的克隆大鼠内皮素B受体（EDNRB）基因，构建含有EDNRB基因的重组腺病毒载体，为转染神经干细胞和基因治疗先天性巨结肠（HD）奠定基础。方法从大鼠心脏组织中提取总RNA，用RT—PCR方法扩增出约1580bp的片段，并将该片段克隆到载体pAdtrack—CMV中，进行酶切鉴定和序列分析。结果证实成功构建了含有EDNPd3基因的重组腺病毒质粒。结论克隆到正确的大鼠EDNPd3基因，并构建出重组质粒pAd—EDNRB，为下一步重组腺病毒颗粒和基因治疗打下基础。