人高迁移率族蛋白1基因的克隆和表达

目的：克隆人高迁移率族蛋白1(HMG—1)编码基因，构建重组表达载体并对其诱导表达．方法：通过RT—PCR方法扩增出人外周血单个核细胞中HMG—1的编码基因，克隆于载体pGEM—T easy，测序分析后亚克隆于表达载体pGEx—4T—2，测序证实序列正确后转化大肠杆菌DH5α，经IPTG诱导4h后可表达M，约56000的融合蛋白GST—HMGl．结果：克隆了人HMG—1的编码基因，构建了融合蛋白的重组表达质粒pGEx—HMGl，表达的融合蛋白产物经凝胶薄层扫描检测，占全菌总蛋白的0．23．结论：获得了人HMG—1编码基因及其原核表达产物，对研究人HMG—1的生物学功能及其mAb的制备具有重要意义．     

大鼠釉原蛋白（Am）成熟肽基因的克隆和序列分析

对大鼠釉原蛋白（Ａｍ）成熟肽基因进行克隆，为Ａｍ进一步在大肠杆菌中表达、检测以及Ａｍ的纯化、功能研究和未来的临床应用奠定基础。用ＲＴ－ＰＣＲ的方法克隆大鼠Ａｍ的基因片段，用琼脂糖凝胶电泳对ＰＣＲ产物进行检测并进行ＤＮＡ序列测定，结果ＤＮＡ测序结果与Ｇｅｎｇｂａｎｋ一致。结论：ＰＣＲ产物即为目的基因，使Ａｍ成熟肽基因的克隆在国内第一次获得成功。     

Ets－1在颌骨软骨肉瘤和骨软骨瘤中的表达及意义

目的：分析Ｅｔｓ－１在颌骨软骨肉瘤和骨软骨瘤中的表达及意义。方法：利用免疫组化法检测Ｅｔｓ－１在２０例颌骨软骨肉瘤和８例骨软骨瘤中的表达。结果：６０％（１２／２０）的软骨肉瘤中Ｅｔｓ－１呈阳性表达,Ⅱ、Ⅲ级患者的阳性表达率明显高于Ｉ级（Ｐ＜０．０５）;复发组的阳性表达率明显高于原发组（Ｐ＜０．０５）;Ｅｔｓ－１在骨软骨瘤中的阳性表率为１２．５％（１／８）,与软骨肉瘤有显著性差异（Ｐ＜０．０５）。结     

人白细胞介素－6受体cDNA的克隆

应用ＲＴ－ＰＣＲ技术，从人的外周血单个核细胞中扩增出人ＩＬ－６受体的特异性ｃＤＮＡ片段，经琼脂糖电泳证实扩增片段大约为１４００碱基对。运用ＤＮＡ重组技术，将获得的片段连接到ＰＵＣ１８质粒中，经转化、筛选、酶切鉴定构建出重组质粒ｐＵＣＩＬ－６受体；经序列分析证实为编码人ＩＬ－６受体的ｃＤＮＡ片段。     

CDMP1诱导成纤维细胞向成软骨细胞表型分化的实验研究

目的应用软骨形态发生蛋白-1(CDMPI)生长因子,体外诱导真皮成纤维细胞向成软骨细胞表型分化,探讨其作为组织工程化软骨种子细胞的可行性.方法取成人真皮成纤维细胞,体外扩增至第2代,以加入CDMPl生长因子(100ng/mL)的含10%胎牛血清的F-12培养液诱导,每3 d换液1次,进行单层培养,对照组为不加CDMPl培养的成纤维细胞.7 d后,免疫荧光检测Ⅱ型胶原分泌,RT-PCR检测Aggrecan、Ⅱ型胶原mRNA表达.结果诱导后成纤维细胞细胞形态由梭形向软骨细胞样多角形、多边形转变.Ⅱ型胶原免疫荧光检测表达阳性,RT-PCR检测Aggrecan、Ⅱ型胶原mRNA表达阳性.结论成纤维细胞在CDMPI生长因子诱导下能向成软骨细胞表型分化,并能分泌软骨细胞特异性基质,有可能成为软骨组织工程新的种子细胞来源.     

HO—1基因的亚克隆及策略

目的：为了获得血红素氧化酶－1基因的cDNA片段表达载体。方法：从正常鼠脾细胞提总RNA进行RT－PCR、分子克隆，并进行自动测序。结果：分离并鉴定了该cDNA重组子，成功的将血红素氧化酶－1基因亚克隆到pcDNA3.1真核表达载体上。结论：建立了一个编码血红素氧化酶－1基因cDNA重组子（762bp)的真核表达载体。     

Ets－1在颌骨软骨肉瘤和骨软骨瘤中的表达及意义

目的 分析Ets－1在颌骨软骨肉瘤和骨软骨瘤中的表达及意义。方法 利用免疫组化法检测 Ets－1在20例颌骨软骨肉瘤和8例骨软骨瘤中的表达。结果 60％(12／20)的软骨肉瘤中Ets－1呈阳性表达,Ⅱ、Ⅲ级患者的阳性表达率明显高于Ⅰ级(P<0．05);复发组的阳性表达率明显高于原发组(P<0．05);Ets－1在骨软骨瘤中的阳性表达率为12．5％(1／8),与软骨肉瘤有显著性差异(P<0．05)。结论Ets－1在颌骨软骨肉瘤中有过表达,并与其病理学分级和复发密切相关。     

CDMP1诱导大鼠脂肪干细胞体外成软骨细胞的实验研究

目的:应用软骨形态发生蛋白(CDMP1)体外诱导SD 大鼠脂肪干细胞向软骨方向分化,探讨其作为软骨组织工程种子细胞的可行性以及CDMP1诱导的最佳剂量.方法:无菌取8只SD大鼠腹股沟脂肪组织,脂肪干细胞体外培养至第二代,以1×104/孔密度接种于24孔培养板里,12 h 后加入诱导液(10 mL/L新生牛血清-DMEM培养液, CDMP1),分ABCD四组(A组:50 μg/L CDMP1 基础培养液; B组:100 μg/L CDMP1 基础培养液;C组:150 μg/L CDMP1 基础培养液;D组:基础培养液 ),以D组为阴性对照组.诱导14 d,倒置显微镜观察细胞形态的变化,MTT法测定CDMP1对其增殖分化能力的影响,行甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原免疫组化染色.结果:诱导后可见脂肪干细胞形态由长梭型明显向软骨细胞的多角形方向转变.MTT法测定CDMP1对脂肪干细胞的增殖能力提高,其中以C组为最,但ABC三组之间两两比较无统计学意义,故提示CDMP1诱导的最佳浓度约为50 μg/L .甲苯胺蓝染色法示糖胺聚糖(GAG)均匀分布于基质中,免疫组化示诱导组Ⅱ型胶原表达阳性,对照组未见阳性表达.结论:CDMP1诱导大鼠脂肪干细胞可以分泌软骨特异性基质糖胺聚糖(GAG)和Ⅱ型胶原,并使其向软骨方向增殖分化,以50 μg/L 为CDMP1诱导的最佳浓度,并有望成为软骨组织工程种子细胞的新来源的方法之一.     

人硫氧还原蛋白cDNA的克隆及序列测定

目的 克隆人硫氧还原蛋白（Human Thioredoxin,hTRX)cDNA序列并进行序列测定。方法 应用RT－PCR技术，以143（TK^-）人骨肉瘤细胞RNA为模板，扩增出hTRX成熟蛋白的cDNA基因，并克隆至pGEM－T Easy载体中进行基因序列测定。结果 将所得序列与GenBanK(J04026)提供的序列比较，其酶活性中心（Trp-Cys-Gly-Pro-Cys)和基序与已知序列一致，第180、284位碱基与已知序列不同，编码的氨基酸也发生了改变。结论 克隆得编码hTRX成熟蛋白的cDNA基因，为进一步探讨hTRX的生物活性的应用奠定了基础。     

CDMP1诱导成纤维细胞向成软骨细胞表型分化的实验研究

目的 应用软骨形态发生蛋白-1(CDMP1)生长因子，体外诱导真皮成纤维细胞向成软骨细胞表型分化，探讨其作为组织工程化软骨种子细胞的可行性方法取成人真皮成纤维细胞，体外扩增至第2代，以加入cDMP1生长因子(100ng／mL)的含10％胎牛血清的F-12培养液诱导，每3d换液1次，进行单层培养，对照组为不加CDMP1培养的成纤维细胞-7d后，免疫荧光检测Ⅱ型胶原分泌，RT-PCR检测Aggrecan、Ⅱ型胶原mRNA表达。结果 诱导后成纤维细胞细胞形态由梭形向软骨细胞样多角形、多边形转变。Ⅱ型胶原免疫荧光检测表达阳性，RT-PCR检测Aggrecan、Ⅱ型胶原mRNA表达阳性。结论 成纤维细胞在CDMP1生长因子诱导下能向成软骨细胞表型分化，并能分泌软骨细胞特异性基质，有可能成为软骨组织工程新的种子细胞来源。     

骨形态发生蛋白-2对软骨寡聚基质蛋白在软骨细胞内表达的影响

目的 :定量研究骨形态发生蛋白 (BMP 2 )对软骨寡聚基质蛋白 (COMP)基因在人软骨细胞及ATDC5 5细胞内表达的影响。方法 :原代培养成人及胚胎的关节软骨细胞 ,经BMP 2刺激后 ,利用real timeRT PCR定量分析COMP基因的表达情况 ;采用静息期不表达COMP基因的鼠源性成软骨细胞株ATDC5 5作为研究对象 ,给以BMP 2刺激 ,通过RT PCR检测COMP表达的变化 ;将COMP基因的全长启动子克隆到报告基因Luciferase的上游并转染入ATDC5 5细胞 ,分别给以 5 0 0 μg·L-1的BMP 2和 /或 10 μg·L-1的Noggin刺激 ,测定其对Luciferase活性的影响。结果 :BMP 2使成人软骨细胞内的COMP基因表达提高近 3倍 ,而对胚胎软骨细胞的作用较弱 ,提高了1.5倍 ;COMP基因在胚胎软骨细胞内的基础表达量约是在成人软骨细胞内的 2倍 ;经BMP 2刺激后ATDC5 5细胞株明显表达COMP基因 ,并且BMP 2的这种效应能够被其拮抗剂Noggin所抑制 ;BMP 2明显促进了Luciferase的活性 ,约提高了 5倍 ,且Noggin特异性的抑制了BMP 2的这种作用。 结论 :BMP 2能够明显促进COMP基因在人关节软骨细胞及鼠源性成软骨细胞株ATDC5 5内的表达。     

WIF－1 基因甲基化及Wnt－5a 蛋白在软骨肉瘤病人中表达的临床意义

目的: 研究WIF－1 基因甲基化及Wnt－5a 蛋白在软骨肉瘤病人中的表达情况,探讨二者在软骨肉瘤
病人中的临床意义。方法: 选取我院病理科2008－06 ～ 2012－06 收治的软骨肉瘤病人43 例,另选取软骨瘤病人
43 例作为对照。收集病人的病历资料及临床病理表现,通过甲基化特异性PCR检测法及免疫组织化学方法,监
测两组病人WIF－1 基因和Wnt－5a 蛋白表达情况。结果: 软骨肉瘤WIF－1 基因甲基化阳性率高于软骨瘤,比较
差异具有统计学意义( χ2 = 5． 658,#P= 0． 003) ; 软骨肉瘤Wnt－5a 蛋白表达阳性率高于软骨瘤,比较差异具有统
计学意义( χ2 = 4． 656,* P= 0． 006) 。黏液型软骨肉瘤Wnt－5a 蛋白表达阳性率明显高于普通型软骨肉瘤,差异
具有统计学意义( χ2 = 4． 941,#P= 0． 002) 。发生浸润转移的软骨肉瘤病人Wnt－5a 蛋白表达阳性率高于未发生
浸润转移的病人( χ2 = 4． 681,P= 0． 003) 。结论: WIF－l 基因的甲基化可能导致Wif－l 蛋白表达下降,在软骨肉瘤
早期作用; Wnt－5a 蛋白表达可能使肿瘤更具有侵袭性,二者可能存在协同作用。     

软骨形态发生蛋白1诱导真皮成纤维细胞表达软骨细胞表型的实验研究

目的应用软骨形态发生蛋白(CDMP)生长因子,体外诱导真皮成纤维细胞向成软骨细胞表型分化,探讨其作为组织工程化软骨种子细胞的可行性.方法取包皮环切术后丢弃真皮组织共3例,成纤维细胞体外培养扩增至第二代,以1×104/cm2密度接种,12 h后加入细胞诱导液(10%胎牛血清F-12培养液,CDMP1终浓度为100 ng/ml)单层培养,未加的成纤维细胞培养用CDMP1为对照.诱导7 d后观察细胞形态变化,Image Plus图像分析软件计算细胞长宽比例.激光共聚焦显微镜分别观察诱导前后细胞内Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原表达及分布,Western印迹检测诱导前后细胞Ⅱ型胶原蛋白表达.反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测诱导后成软骨相关的Sox9、聚集蛋白聚糖与Ⅱ、Ⅸ型胶原mRNA表达;同时检测与成骨相关的X型胶原、碱性磷酸酶(AKP)mRNA表达.培养第二代细胞以2×107个细胞/ml细胞密度进行离心管法培养,诱导14 d后行阿辛蓝与Ⅱ型胶原免疫组化染色.结果诱导后可见单层培养的成纤维细胞形态由长梭形向软骨细胞样多角形转变,Image Plus图像分析软件计算细胞诱导后的长宽比例为(1.40±0.15),较诱导前(7.40±1.30)差异有显著意义(P＜0.05);与正常软骨细胞(1.29±0.24)差异无显著意义.免疫荧光激光共聚焦观察发现诱导后细胞内出现Ⅱ型胶原表达,Ⅰ、Ⅲ型胶原表达呈阳性.RT-PCR检测成软骨相关的Sox9,聚集蛋白聚糖,Ⅱ、Ⅸ型胶原mRNA表达阳性;X型胶原、AKP未检测到mRNA阳性表达.Western印迹检测细胞诱导后Ⅱ型胶原蛋白表达阳性.离心管培养诱导7 d后阿辛蓝染色示糖胺聚糖(GAG)均匀分布于基质中,免疫组化染色示基质中Ⅱ型胶原表达阳性.结论第二代成人真皮成纤维细胞在CDMP1生长因子诱导下可向成软骨细胞表型分化,并能分泌软骨细胞特异性基质,有望成为软骨组织工程新的种子细胞来源.     

RT—PCR检测人烧伤愈合中TGF—β1的表达

目的 通过对烧伤愈合不同阶段人皮肤组织中转化生长因子β１（ＴＧＦ－β１）ｍＲＮＡ表达变化的研究,阐明ＴＧＦ０－β１对促进愈合的调节作用。方法 取入深Ⅱ度烧伤后５ｄ、７ｄ、１２ｄ手术切除的烧伤区组织,采用ＲＴ－ＰＣＲ后电泳扫措求积方法,检测各时相烧伤皮肤组织ＴＧＦβ１ｍＲＮＡ表达量的变化。结果 人深Ⅱ度烧伤皮肤ＴＧＦβ１ｍＲＮＡ在伤后７ｄ出现表达高峰,５ｄ与１２ｄ也有表达增强。结论 ＴＧＦβ１结烧伤     

重组人骨形态发生蛋白-2和Pluronic F-127修复兔全厚关节软骨缺损的实验研究

目的：研究重组人骨形态发生蛋白－2（rhBMP-2)/Pluronic复合物对兔全厚关节软骨缺损的修复作用。方法：选用健康成年新西兰大白兔27只。在每只兔双侧股骨的髌股关节面中心各造成一直径为3．5mm的软骨缺损，深度以穿透软骨至刚好出现渗出血为宜。随机将兔分为A、B、C三组。A组（18膝）；注入Pluronic凝胶，B组（18膝）：注入rhBMP-2/Pluronic复合物。C组（18膝）：空白对照组，不作任何处理，术后4、8、12周分批处死动物，取材，对修复组织进行大体，组织学和扫描电镜观察。结果：B组组织修复，质量好，4周缺损区完全填充，8周、12周与周围正常软骨组织的外观相近；光镜下见近乎正常关节软骨组织；扫描电镜下见形态成熟的透明软骨细胞和Ⅱ型胶原。A组和C组的修复质量差，4周缺损仍有浅表凹陷，8周、12周再生组织韧，缺乏弹性，表面粗糙，不规则；光镜下以纤维组织修复为主，扫描电镜下多为纤维软骨和纤维组织。Pluronic平均降解时间为6－8周，与正常软骨的再生速度基本一致。A组和C组的组织学评分在各个时期无显著性差异（P＞0．05）。而B组和C组在各个时期均存在显著性差异（P≤0．001）。结论：rhBMP-2能促进和改善关节软骨的修复。Pluronic可作为rhBMP-2安全有效的载体，二者复合体的应用为治疗大面积，不规则的关节软骨缺损提供了一种无创伤性的新方法。     

重组人骨形态发生蛋白诱导气管软骨再生的剂量效应

目的:观察重组人骨形态发生蛋白(rhBMP) 2诱导犬自体原位气管移植段软骨再生过程中的剂量效应.方法:4组小鼠气 管移植段各环间软组织中植入rhBMP 2胶原缓释系统,其rhBMP 2含量分别为1,2,5和10mg.将移植段气管原位移植,4wk后 观察标本大体和组织学改变,并将测得的新生软骨面积进行比较.结果:rhBMP 2植入组移植段环间均有不同程度的软骨再生 随植入物中rhBMP 2含量的增加,新生软骨面积分别为:(1768.1±449.0),(2364.1±444.3),(3000.7±488.3),(3188.3± 388.3)pixel.4组新生软骨面积差异有显著性(F=5.246,P<0.01).结论:rhBMP-2诱导气管移植段软骨再生的作用具有剂 量效应.     

软骨形态发生蛋白1诱导SD仔鼠脂肪干细胞修复兔膝关节软骨缺损的研究

目的:应用软骨形态发生蛋白1(CDMP1),以诱导SD仔鼠脂肪干细胞(ADSCs)以修复兔膝关节软骨缺损,探讨异种细胞作为软骨组织工程种子细胞的可行性。方法:自SD仔鼠腹股沟脂肪组织分离、培养ADSCs,复合于自制牛松质骨支架上,经CDMP1诱导,体外继续培养2周,免疫组化鉴定后备用。建立兔双侧髌骨关节缺损模型。左侧缺损处植入ADSCs-支架复合物,为实验侧;右侧缺损处植入空支架,为对照侧。术后8、16、24和48周各处死9只兔子,缺损处行H-E染色和番红O染色。结果:实验侧8周时可见缺损周围表面充填有薄层白色半透明组织,与周围软骨的界线清楚;16周时缺损表面界限连接较8周时模糊,但仍可辨,24周时,修复良好,修复区新生软骨细胞与周围正常软骨细胞形态相近,呈球形,可见软骨陷窝,H-E染色和番红O染色阳性;48周时,能较容易分清缺损处与修复区的界限,修复效果不及24周时。对照侧8、16、24和48周4个时期标本基本相同,软骨缺损处与周围正常组织边界清楚,缺损处凹陷空洞,被肉芽组织填充,新生细胞呈长梭形,H-E染色和番红O染色阴性。结论:利用CDMP1诱导SD仔鼠ADSCs复合自制牛松质骨支架可较好修复兔膝关节软...     

软骨源性形态发生蛋白-1对后纵韧带骨化作用

目的 探讨软骨源性形态发生蛋白-1(CDMP-1)对体外培养的SD大鼠后纵韧带细胞的骨化作用.方法 切取SD大鼠的后纵韧带体外培养后总人带细胞,观察体外培养条件下后纵韧带的形态学特征和表型.分别用不同浓度的软骨源性形态发生蛋白-1诱导后纵韧带细胞.对照组:CDMP-1:0ng/ml;诱导组(ng/ml):10、20、50、75、100.检测后纵韧带细胞诱导后的碱性磷酸酶活性,免疫组化染色检测Ⅰ、Ⅱ型胶原表达情况.结果 后纵韧带细胞表达成骨细胞表型,具有高碱性磷酸酶活性.软骨源性形态发生蛋白-1对后纵韧带细胞的骨化作用与浓度密切相关,免疫组织化学染色显示:软骨源性形态发生蛋白-1诱导后纵韧带细胞有Ⅱ胶原表达并随着软骨源性形态发生蛋白-1诱导剂量增加而增多,诱导组与对照组有显著性差异;诱导组Ⅰ型胶原染色深度和强度比对照组减弱,诱导组与对照组有显著性差异.结论 大鼠后纵韧带细胞体外培养可诱导向成骨细胞分化,CDMP-1在后纵韧带骨化的发生中起着重要作用.     

白血病患者RT—PCR检测MDR1和MRP的意义

0引言肿瘤细胞对药物产生多药耐药性（MDR）是导致化疗失败的重要原因卜，“，我们观察了白血病患者骨髓或外周血单个核细胞中mdr基因（mdrl）和MDR相关蛋白（MRP）的基因表达情况，并对临床检测结果作了分析．1方法1．l试剂AMV逆转录酶、TaqDNA聚合酶，原平生物技术公司购人．1．2标本制备白血病患者20例，其中急性淋巴细胞白血病9例，急性非淋巴细胞白血病8例，慢性粒细胞性白血病（CML）3例，取患者骨髓或静脉血3mL，加等体积生理盐水稀释后置等体积淋巴细胞分离液上3000r／min离心20min后吸取单个核细胞．l．3RNA提取IX10’单…