天然免疫细胞NK、NKT细胞在肝损伤中的调节作用

肝脏内存在着一群独特的细胞群——天然免疫细胞，包括枯否细胞、NK细胞、NKT细胞等，它们作为机体面对危害的第一道防线，能快速的对刺激作出应答，它们除了抵御许多病原体的作用，目前亦发现它们存在于外在特殊物质介导的肝损伤中。本文综述了肝脏天然免疫最新的观点，以及NK细胞和NKT细胞在各种特定物质介导的肝损伤中的作用回顾。这些研究成果将有助于理解肝损伤的免疫学机制，并最终为各种病因导致的肝损伤寻找到新的免疫学治疗途径。     

天然免疫与非酒精性脂肪性肝病

非酒精性脂肪性肝病发病机制尚未完全阐明,近年来研究表明天然免疫在其发病中起一定作用,肝脏天然免疫细胞主要为NKT细胞、枯否细胞、NK细胞。肝脏天然免疫通过调节细胞因子产生及炎症信号传递参与非酒精性脂肪性肝病的病程发展,在非酒精性脂肪性肝病的发病中起着重要作用。     

天然免疫细胞NK、NKT细胞在肝损伤中的调节作用

肝脏内存在着一群独特的细胞群——天然免疫细胞,包括枯否细胞、NK细胞、NKT细胞等,它们作为机体面对危害的第一道防线,能快速的对刺激作出应答,它们除了抵御许多病原体的作用,目前亦发现它们存在于外在特殊物质介导的肝损伤中。本文综述了肝脏天然免疫最新的观点,以及NK细胞和     

肝脏持续过表达IL-15对NK/NKT细胞和T细胞数目和活化状态的影响

目的研究靶向肝脏过表达细胞因子IL-15对机体免疫系统的影响。方法构建IL-15重组表达质粒pLIVE-IL-15,采用高压注射的方式尾静脉注射C57BL/6小鼠,ELISA检测小鼠血清中IL-15的表达水平,流式检测小鼠脾脏和肝脏淋巴细胞亚群变化。结果成功构建pLIVE-IL-15质粒,pLIVE-IL-15质粒高压注射小鼠后血清中能检测到IL-15持续表达。与pLIVE-EGFP对照组相比,pLIVE-IL-15质粒注射鼠天然免疫系统NK细胞和NKT细胞以及获得性免疫系统的CD4+T细胞和CD8+T细胞数目均显著增加(P<0.05)。体内过表达IL-15促进NK细胞高表达CD69和IFN-γ,而NKT细胞活化状态改变不明显,IL-15能显著诱导CD8+T细胞高分泌IFN-γ(P<0.05),而对CD4+T细胞IFN-γ分泌影响较小。结论 pLIVE-IL-15靶向肝脏后能在体内持续表达,并且能调节天然免疫系统和获得性免疫系统反应。     

肺结核患者外周血NKT细胞、NK细胞、T淋巴细胞亚群的变化及意义

目的了解肺结核患者外周血NKT细胞、NK细胞和T淋巴细胞亚群的变化及其意义。方法采用流式细胞仪抗体双标法检测472例肺结核和非结核患者外周血NKT细胞（CD3＋CD16＋CD56＋）、NK细胞（CD3-CD16＋CD56＋）及T淋巴细胞亚群（CD3、CD4、CD8及CD4/CD8）的表达率,并进行分析。结果肺结核患者的NK细胞和NKT细胞的表达水平显著低于非结核患者,T细胞亚群CD4在肺结核患者中的表达显著高于非结核患者。肺结核患者不耐药组NK细胞和NKT细胞的表达率明显高于耐药组（F值分别为7.926、5.689,P〈0.001）。初治病例CD4、CD4/CD8显著高于复治病例（t值为-2.179、-2.402;P值为0.030、0.017）,初治病例CD8低于复治病例（t=3.257,P=0.001）。NKT细胞、NK细胞在初治和复治病例中的分布差异无统计学意义。NKT细胞、NK细胞和T淋巴细胞亚群在不同病灶范围分组之间分布差异无统计学意义。NK细胞、NKT细胞、CD4、CD8以及CD4/CD8在肺部有无空洞及空洞数量分组之间分布差异有统计学意义,即NK细胞、NKT细胞数、CD4/CD8、CD8随着空洞累及范围的增加而降低,CD4则随空洞累及范围的增加而升高。结论肺结核患者NKT细胞和NK细胞的表达受到了抑制,且NK细胞和NKT细胞的表达率随着耐药及耐药程度的加重而降低,随着肺结核空洞累及范围的增加机体免疫进一步失衡,提示结核病尤其是耐药结核病采用免疫调节剂辅助治疗的必要性。     

NKT细胞和慢性乙肝的关系

人类肝脏含有大量的大然的自然杀伤T细胞(NKT细胞)。NKT细胞是具有NK细胞特征的T细胞。存CDld限制下识别糖脂。NKT细胞的显特征是快速产生大量的细胞因子，可以调节特异性免疫反应。最近的研究发现NKT细胞与α—Galcer配基结合可以治疗实体瘤、抑制HBV复制并阻止1型糖尿病的发生。α-GalCer抑制HBV复制是通过直接激活NKT细胞引起的。用激活的NKT细胞治疗可能代表了慢性乙肝治疗的新策略。     

小鼠肝脏淋巴细胞几种分离方法的比较

目的:通过比较几种肝脏淋巴细胞分离方法得到的总淋巴细胞、T细胞、自然杀伤T细胞(NKT cells)及自然杀伤细胞(NK细胞)的比例和细胞绝对数,明确各种方法的适用范围。方法:按照析因设计,将不放血(A法)、摘眼球放血(B法)、体循环灌流(C法)、摘眼球结合体循环灌流(B法+C法)4种肝脏预处理方法和单浓度离心法(Ⅰ法)、非连续密度梯度离心法(Ⅱ法)2种Percoll分离方法进行全面组合,共获得8种组合条件,分离小鼠肝脏淋巴细胞,用流式细胞术检测各类型细胞比例。结果:肝脏预处理方法中B法+C法获得淋巴细胞比例最高,A法获得淋巴细胞绝对数最高,B法获得的NKT细胞和NK细胞比例和细胞绝对数均最高;Ⅱ法获得的淋巴细胞、T细胞、NKT细胞和NK细胞比例和细胞绝对数均高于Ⅰ法。对于NKT细胞比例和NK细胞绝对数,肝脏预处理方法和Percoll浓度之间有交互作用(P<0.01和P<0.05),其他均无交互作用(P>0.05)。结论:采用摘眼球放血结合体循环灌流法,结合Percoll非连续密度梯度法(33%+70%),可获得较高数量和比例的固有免疫细胞,有助于对肝脏固有免疫细胞如NKT细胞、NK细胞等的研究。     

小鼠肝脏天然免疫淋巴细胞分离及其特性研究

目的：建立肝脏淋巴细胞分离方法，并初步观察小鼠肝脏天然免疫淋巴细胞的特性。方法：分别用机械法和酶消化法制备单细胞悬液分离小鼠肝脏淋巴细胞，用二色或三色荧光标记技术检测肝脏天然免疫淋巴细胞的比例及与NK细胞相关的一些特征。结果：大量眼球放血后可提高NK细胞所占的比例，消化酶可显著降低NK1.1^ 和DX5^ 细胞所占的比例；肝脏中存在大量的天然免疫淋巴细胞（NK1.1^ 细胞占35％，γδT细胞占30％）；肝脏NK细胞在发育上存在较多的NK1.1^ DX^5-细胞；Poly(I:C)可刺激肝脏NK细胞产生IFN-γ。结论：成功建立了小鼠肝脏淋巴细胞分离方法；肝脏作为重要的天然免疫器官，在NK细胞再造和发育分化成熟中具有重要作用。     

The impact of autologous CIK cells treatment of cancer on the immune function of patients

目的 观察自体CIK细胞治疗肿瘤患者免疫功能的影响.方法 采用流式细胞仪检测30例健康对照和50例不同类型肿瘤患者自体CIK细胞治疗前后机体免疫状态:包括 Treg细胞、NKT细胞、NK细胞、CD4+/CD8+比值百分率,以及临床症状改善情况.结果 自体CIK治疗前各组肿瘤和健康人相比较,患者Treg细胞、NKT细胞百分率上调,NKT细胞、CD4+/CD8+比值、NK细胞百分率均下降,其差异有统计学意义(P<0.05);自体CIK细胞治疗后和治疗前相比较,患者Treg百分率下调,NKT细胞、CD4+/CD8+比值、NK细胞百分率上升(P<0.05).不同类型肿瘤患者治疗后Kamofsky评分均高于治疗前(P<0.05).结论 自体CIK细胞治疗后可明显增强肿瘤患者细胞免疫功能,提高了生活质量.     

CCR5,CXCR3,CXCR6和CCR7在丙肝患者肝外周血NK和NKT淋巴细胞的表达及其意义

[目的]比较趋化因子受体CCR5,CXCR3,CXCR6和CCR7在丙肝患者肝外周血NK和NKT淋巴细胞上的表达及其意义,了解其与肝组织学炎症反应的关系.[方法]用荧光标记抗趋化因子受体的单克隆抗体对肝及外周血NK和NKT细胞表面的趋化因子受体染色后,用9色11参数流式细胞仪KSRⅡ检测分析.[结果]肝组织中NKT细胞比例18.2±5.8高于外周血的3.7±2.9,P＜0.01;肝组织NK细胞比例7.8±3.3低于外周血中15.1±10.1,P＜0.01.肝组织CCR5 ,CXCR3 或/和CXCR 的NK和NKT细胞频数高于外周血,P＜0.001,CCR7 NK和NKT细胞频数低于外周血,P＜0.001;肝组织学炎症明显组表达趋化因子受体CCR5,CXCR3或CXCR6的NK和NKT细胞频数高于炎症轻微组.[结论]是趋化因子受体CCR5,CXCR3和CXCR6而不是CCR7介导NK和NKT细胞向肝迁徙定植,它们并可能参与肝炎症的病理免疫学反应过程.     

SNL细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞

目的 为便于人胚胎干细胞(ES细胞)的培养和研究,寻找一种建系细胞作为人ES细胞的饲养层细胞.方法 以小鼠成纤维细胞系SNL细胞作为饲养层细胞培养人ES细胞株hES1.传代17代后,检测hES细胞表面特异性标志,包括碱性磷酸酶(AKP)、Oct-4、阶段特异性胚胎抗原(SSEA)-3和SSEA-4的表达;同时观察细胞的多向分化潜能.结果 hES1细胞在SNL细胞饲养层上能持续生长.经多次传代后持续表达人ES细胞表面特异性标志,其注射于重症联合免疫缺陷小鼠皮下仍能形成畸胎瘤组织.结论 SNL细胞能够作为饲养层细胞用于人ES细胞的培养,且操作更方便;该细胞已转染了耐受新霉素的基因,为将来对人ES细胞基因操作时进行药物筛选提供了可能.     

SNL细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞

目的为便于人胚胎干细胞(ES细胞)的培养和研究,寻找一种建系细胞作为人ES细胞的饲养层细胞。方法以小鼠成纤维细胞系SNL细胞作为饲养层细胞培养人ES细胞株hES1。传代17代后,检测hES细胞表面特异性标志,包括碱性磷酸酶(AKP)、Oct-4、阶段特异性胚胎抗原(SSEA)-3和SSEA-4的表达;同时观察细胞的多向分化潜能。结果hES1细胞在SNL细胞饲养层上能持续生长。经多次传代后持续表达人ES细胞表面特异性标志,其注射于重症联合免疫缺陷小鼠皮下仍能形成畸胎瘤组织。结论SNL细胞能够作为饲养层细胞用于人ES细胞的培养,且操作更方便;该细胞已转染了耐受新霉素的基因,为将来对人ES细胞基因操作时进行药物筛选提供了可能。     

干细胞来源的胰岛素分泌细胞的研究进展

Ⅰ型糖尿病是由于胰岛β细胞被自身免疫系统攻击、破坏,不能正常释放胰岛素,导致血糖升高.患者需终生注射胰岛素,由于给药过程缺乏理想的血糖感应系统,常导致糖尿病大血管病变、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、神经病变及糖尿病足等慢性并发症的发生,是糖尿病死亡的主要原因[1].为了有效控制血糖,防止糖尿病并发症的发生,提高糖尿病患者的生存质量,目前主要采用两种治疗策略来改进胰岛素的治疗,一是胰岛素输入方式的改进:临床上广泛应用的胰岛素泵就是通过24 h不停地向患者体内输入微量胰岛素,模拟正常胰岛素分泌模式,控制血糖水平,减少并发症的发生.其次是寻找方法替代被患者自身免疫系统破坏的胰岛素分泌细胞,包括胰腺或胰岛移植、对非β细胞进行基因修饰以及对干细胞的诱导分化.70年代初,Lacy等成功地证明了移植胰岛细胞能够改善糖尿病大鼠的高血糖状态,胰岛细胞移植开始蓬勃开展起来.     

牙周膜干细胞对脐血单个核细胞分化为破骨样细胞的影响

目的研究牙周组织改建过程中,牙周膜干细胞对破骨细胞形成的影响,初步探讨静压力和诱导因子对牙周膜干细胞调控破骨细胞形成的作用机制。方法有限稀释法克隆化培养牙周膜干细胞,密度梯度离心法分离脐血,收集单个核细胞。建立直接共培养和Transwell间接共培养体系。实验分组:A组,对照组(单纯共培养);B组,静压力组,共培养后第2天即对共培养细胞施加120 KPa压力,持续作用1 h后继续培养;C组,诱导因子组,培养液中加入诱导因子1,25二羟基维生素D3(1×10-8mol/L)和前列腺素E2(1×10-6mol/L)。采用倒置相差显微镜及TRAP染色,骨磨片染色等方法检测破骨样细胞(osteoclast-like cells,OLC)的形成及功能。结果各组第3、7天OLC计数比较结果显示,施加静压力后,直接共培养组OLC数量明显多于间接共培养组(P<0.01);而诱导因子组,直接共培养组OLC少于间接共培养组(P<0.01)。结论牙周膜干细胞能够促进脐血单个核细胞分化为破骨样细胞,且在静压力作用下,两种细胞直接接触时,这种调控作用更为明显。     

Periodontal ligament stem cells improve peripheral blood mononuclear cells differentiation into osteoclast-like cells

目的 研究牙周组织改建过程中,牙周膜干细胞对破骨细胞形成的影响,初步探讨静压力和诱导因子对牙周膜干细胞调控破骨细胞形成的作用机制.方法 有限稀释法克隆化培养牙周膜干细胞,密度梯度离心法分离脐血,收集单个核细胞.建立直接共培养和Transwell间接共培养体系.实验分组:A组,对照组(单纯共培养);B组,静压力组,共培养后第2天即对共培养细胞施加120 KPa压力,持续作用1h后继续培养;C组,诱导因子组,培养液中加入诱导因子1,25二羟基维生素D3(1 ×10-8 mol/L)和前列腺素E2(1×10-6 mol/L).采用倒置相差显微镜及TRAP染色,骨磨片染色等方法检测破骨样细胞( osteoclast-like cells,OLC)的形成及功能.结果 各组第3、7天OLC计数比较结果显示,施加静压力后,直接共培养组OLC数量明显多于间接共培养组(P＜0.01);而诱导因子组,直接共培养组OLC少于间接共培养组(P＜0-01).结论 牙周膜干细胞能够促进脐血单个核细胞分化为破骨样细胞,且在静压力作用下,两种细胞直接接触时,这种调控作用更为明显.     

肝干细胞－卵圆细胞的研究进展

卵圆细胞是肝脏干细胞的代表细胞,主要存在于幼肝及成人受损的肝脏中,是一种双潜能的肝脏干细胞,多种因素调节其分化,在此过程中动态表达一系列表面标志物。卵圆细胞的分化异常与肝癌的发生关系密切。在体外大量扩增卵圆细胞并使之分化为成熟的 有功能的肝细胞,为终末期肝病、肝脏的组织工程研究及基因治疗开辟了新的途径。      

Expansive effects of aorta-gonad-mesonephros-derived stromal cells on hematopoietic stem cells from embryonic stem cells

Background Hematopoietic stem cells (HSCs) give rise to all blood and immune cells and are used in clinical transplantation protocols to treat a wide variety of refractory diseases, but the amplification of HSCs has been difficult to achieve in vitro. In the present study, the expansive effects of aorta-gonad-mesonephros (AGM) region derived stromal cells on HSCs were explored, attempting to improve the efficiency of HSC transplantation in clinical practice.Methods The murine stromal cells were isolated from the AGM region of 12 days postcoitum (dpc) murine embryos and bone marrow（BM）of 6 weeks old mice, respectively. After identification with flow cytometry and immunocytochemistry, the stromal cells were co-cultured with ESCs-derived, cytokines-induced HSCs. The maintenance and expansion of ESCs-derived HSCs were evaluated by detecting the population of CD34+ and CD34+Sca-1+cells with flow cytometry and the blast colony-forming cells (BL-CFCs), high proliferative potential colony-forming cells (HPP-CFCs) by using semi-solid medium colonial culture. Finally, the homing and hematopoietic reconstruction abilities of HSCs were evaluated using a murine model of HSC transplantation in vivo.Results AGM and BM-derived stromal cells were morphologically and phenotypically similar, and had the features of stromal cells. When co-cultured with AGM or BM stromal cells, more primitive progenitor cells (HPP-CFCs ) could be detected in ESCs derived hematopoietic precursor cells, but BL-CFC’s expansion could be detected only when co-cultured with AGM-derived stromal cells. The population of CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells were expanded 3 times,but no significant expansion in the population of CD34+Sca-1+ cells was noted when co-cultured with BM stromal cells. While both CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells and CD34+Sca-1+ cells were expanded 4 to 5 times respectively when co-cultured with AGM stromal cells. AGM region-derived stromal cells, like BM-derived stromal cells, could promote hematopoietic reconstruction and HSCs’ homing to BM in vivo.Conclusions AGM-derived stromal cells in comparison with the BM-derived stromal cells could not only support the expansion of HSCs but also maintain the self-renewal and multi-lineage differentiation more effectively. They are promising in HSC transplantation. Chin Med J 2005; 118(23):1979-1986