一种简捷的质粒DNA提取及纯化方法

介绍一种快速获取高纯度质粒ＤＮＡ方法,在碱裂解法快速获取质粒ＤＮＡ粗制品的基础上,利用一种不溶解蛋白质而溶解ＤＮＡ的溶液ＴＥＳ纯化质粒ＤＮＡ,同时对本法所提取的质粒的ＤＮＡ的回收率、纯度及可能的用途进行验证。此法简易,所得样品纯度高,可以直接用于转化、酶切和基因克隆。     

微波炉加热质粒DNA快速提取法

介绍一种以微波炉加热快速提取质粒的方法，所提取的ＤＮＡ纯度，重复性均好，操作简便，整个提取过程不超过２０ｍｉｎ，省时省力，适用于规模筛选重组克隆子，也可直接用于转化、酶切及ＤＮＡ序列测定。     

一种高效快速的质粒DNA小规模提取新方法

在传统碱裂法抽的质粒ＤＮＡ的基础上，该文所提出了去掉了苯酚气仿抽提过程，缩短了碱作用时间，并对其他操作步骤加以适当改进，使从细菌中抽提质粒ＤＮＡ的过程变得简单，快速，高效。     

一种改良的质粒DNA的快速提取方法

目的：建立一种确实有效的更实用的小量质粒ＤＮＡ的提取方法。方法：将一含有目的质粒的大肠杆菌扩增后采用改良后的方法提取质粒ＤＮＡ，然后采用紫外分光光度计测定含量，并且进行酶切。结果：每毫升原细菌培养物质粒ＤＮＡ的产量明显增高，且酶切效果极好。结论：改良后的质粒ＤＮＡ提取法具有速度快、收获量多、纯度高、经济又方便等优点，适合于应用与推广。     

碱裂解法提取质粒DNA的研究

目的对碱裂解法提取质粒DNA中主要试剂的作用进行研究.方法采用不同的溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ分别进行质粒DNA的提取.结果方法3得到质粒DNA的量明显偏少,方法4得到的质粒DNA含蛋白质较多.结论溶液Ⅰ对实验结果影响不大,溶液Ⅱ中的NaOH关系到所提取质粒DNA量的多少,溶液Ⅲ中的醋酸钾是蛋白质能否去除的一个重要因素.     

pcDNA3-内皮抑素质粒的大规模纯化

目的：探索pcDNA3-内皮抑素质粒的大规模纯化工艺。方法：碱裂解法提取质粒后，用0．4mol／L CaCl2沉淀除去RNA,再用Q-Sepharose XL进行初纯，SOURCE 15Q精纯。所得纯化物以1％琼脂糖凝胶电泳鉴定超螺旋质粒的含量。结果：经此方法纯化的pcDNA3-内皮抑素质粒中超螺旋质粒的含量可达95％以上，且无RNA检出。结论：该法可以实现pcDNA3-内皮抑素质粒的大规模纯化。     

氯化锂用于质粒DNA的提纯

在分子生物学实验中常常涉及到小量质粒 DNA的提取和纯化。用质粒 DNA提纯试剂盒 ,虽然能得到高纯度的质粒DNA,但成本过高 ,不适合大量使用。用常规的苯酚氯仿提纯法 ,步骤繁琐 ,而且得到的产物中常残留有苯酚或其它杂质而影响后续的酶切分析等工作。再者 ,苯酚有害人体健康 ,而且废弃的苯酚又可造成环境污染。在本实验中 ,已摸索出一种可用于替代苯酚氯仿提纯质粒 DNA的氯化锂质粒 DNA提纯法。该方法简便易行 ,安全经济 ,所获结果稳定性好。1　材料与方法1.1　材料1.1.1　菌株　 p BR32 2 / C6 0 0 ,RP4/ 1485为本室保存的菌株 ;p …     

人HCCR蛋白表达载体的构建、表达及其蛋白纯化

目的:构建人HCCR蛋白表达载体,并探讨其体外表达及表达产物的纯化。方法:培养人肝癌细胞,提取总RNA,反转录合成cDNA第一链,以此cDNA为模板经PCR合成插入片段,连接至载体pMBP-C,转化到大肠杆菌Top10F′中,进行诱导表达。表达产物通过Ni-NTA螯合层析进行纯化。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,Westernblot和电喷雾电离串联飞行时间质谱(ESI-TOFMS)鉴定表达产物。结果:构建的表达载体经限制性内切酶酶切分析和DNA测序,证明所构建的质粒含有HCCR基因。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳发现该重组质粒经IPTG诱导后表达一种新的蛋白,这种蛋白不存在于诱导后的空载体表达产物中,表达产物经Westernblot和蛋白质谱鉴定含有HCCR蛋白的部分肽段。结论:成功构建了HCCR蛋白表达载体并进行体外表达及纯化。     

福氏志贺菌毒力蛋白IpaC的表达与纯化

目的表达和纯化福氏志贺菌毒力蛋白IpaC,研究福氏志贺菌的致病机制。方法将含有ipaC基因的pET32a-i-paC表达质粒载体转化大肠杆菌BL21(λDE3),在异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导下表达,对诱导后的表达产物进行SDS-PAGE鉴定,并采用QIA expressionistTM蛋白纯化系统来纯化目的蛋白。结果诱导后的表达产物经SDS-PAGE发现有一相对分子质量约为63 000的条带,其含量约占总蛋白量的11%,以350 mmol/L咪唑洗脱液洗脱,目的蛋白纯度可达90%以上。结论pET32a-ipaC重组表达质粒转入大肠杆菌后,可稳定、高效地表达目的蛋白,QIA-expressionistTM蛋白纯化系统是一种简便、高效的纯化系统,可获得高纯度的目的蛋白。     

小鼠腹水中抗人食管癌单克隆抗体的纯化

研究目的从小鼠腹水中纯化抗人食管癌单克隆抗体。处理方法小鼠腹水通过羟基磷灰石柱层析后(层析环境温度15℃,起始缓冲液pH6.8,0.01MPB。流速1ml/min,线性梯度洗脱液500ml,0.1～0.5MPB)。由酶联免疫过滤法(EIF)鉴别出抗体活性部分。然后以SDS-PAGE鉴定所得抗体的分子量及其纯度(10％聚丙烯酰胺凝胶,电极缓冲液pH8.3,上样量约50/μg,电流3.5mA/管,考马斯亮兰R-250染色)。研究结果层析洗脱液经紫外监测A_(280nm)得出三个吸收峰;由EIF作抗体活性鉴定,确证第3个峰为活性部分;SDS-PAGE中于分子量约75KD及30KD处显示两个单一色带,相当于该单抗的重链和轻链。结论本法纯化所得抗人食管癌单克隆抗体纯度良好。     

福氏志贺菌毒力蛋白IpaC的表达与纯化

目的：表达和纯化福氏志贺菌毒力蛋白IpaC，研究福氏志贺菌的致病机制。方法：将含有ipaC基因的pET32a-i-paC表达质粒载体转化大肠杆菌BL21（λDE3），在异丙基硫代－β－D半乳糖苷（IPTG）诱导下表达，对诱导后的表达产物进行SDS－PAGE鉴定，并采用QIA expressionist^TM蛋白纯化系统来纯化目的蛋白。结果：诱导后的表达产物经SDS－PAGE发现有一相对分子质量约为63000的条带，其含量约占总蛋白量的11％，以350mmol/L咪唑洗脱液洗脱，目的蛋白纯度可达90％以上，结论：pET32a-ipaC重组表达质粒转入大肠杆菌后，可稳定，高效地表达目的蛋白，QIA－expressionistTM蛋白纯化系统是一种简便，高效的纯化系统，可获得高纯度的目的蛋白。     

HtsA表达质粒克隆和蛋白质的纯化

目的克隆HtsA重组表达质粒以获得HtsA表达蛋白。方法通过PCR方法扩增获得A组链球菌HtsA基因完整的序列,将此片段定向克隆到表达载体pET21d质粒中,在E.coli BL21(DE3)中表达融合蛋白,并运用离子交换层析和疏水层析分离纯化HtsA蛋白。结果经琼脂糖电泳证实成功克隆了重组表达质粒pET21d-HtsA,pET21d-HtsA融合蛋白在E.coli BL21(DE3)中得到表达,SDS-PAGE分析表明纯化的HtsA纯度较高。结论成功构建了A族链球菌HtsA基因重组表达质粒,并纯化获得了目的蛋白HtsA。     

聚酰胺对紫锥菊提取物中菊苣酸的分离纯化研究

目的采用聚酰胺柱色谱分离纯化紫锥菊提取物中菊苣酸。方法采用50%乙醇溶液洗脱,HPLC法对产品中菊苣酸进行检测分析。结果该法能把紫锥菊提取物中菊苣酸的质量分数(4.9%)提高10倍左右,回收率达到98%以上。结论该法操作简单,可用于紫锥菊提取物中菊苣酸的分离纯化。     

大孔吸附树脂法分离纯化山茱萸总皂苷

目的 :研究并优化大孔树脂法分离纯化山茱萸总皂苷 .方法 :70 0mL·L-1乙醇提取后 ,上HPD 3 0 0型大孔吸附树脂 ,水洗后分别用 3 0 0mL·L-1,5 0 0mL·L-1,70 0mL·L-1乙醇洗脱 ,考察大孔树脂富集、纯化山茱萸总皂苷的吸附性能和洗脱参数 ,并与常规溶剂提取法相对照 .结果 :山茱萸总皂苷富集于 5 0 0mL·L-1乙醇洗脱液部分 ,洗脱剂用量为上柱样品液的 8倍 ,洗脱率达 81 8% .大孔树脂法与常规溶剂法提取山茱萸总皂苷的得率分别为 2 4 9% ,2 19% .结论 :采用大孔吸附树脂可较好地纯化山茱萸总皂苷