人MCHR2基因shRNA真核表达载体构建及鉴定

目的 构建针对人黑色素浓集激素受体2(MCHR2)的shRNA真核表达载体,并在人胚肾293(HEK293)细胞中观察其对MCHR2基因表达的影响.方法 根据MCHR2基因序列,设计并合成特异性的小干扰片段,并将其定向克隆到带有卡那霉素抗性和增强绿色荧光蛋白的真核表达载体pGenesil-1中,对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定.用脂质体将重组质粒转染到HEK293细胞中,观察其在mRNA和蛋白水平对MCHR2的影响.结果 通过酶切鉴定和序列测定,成功构建四条表达短发夹RNA的质粒及其阴性对照质粒,并成功转染到HEK293细胞株中.四条shRNA真核表达载体在mRNA水平对MCHR2抑制率分别为54.9%、66.4%、56.9%、45.8%;在蛋白水平对MCHR2抑制率分别为62.0%、81.0%、73.3%、44.2%.结论 针对人MCHR2的shRNA真核表达载体成功构建及鉴定为进一步研究MCHR2功能奠定了良好的基础.     

强力霉素对恶性肿瘤细胞金属蛋白酶表达和分泌的调节及其意义

目的 :揭示金属蛋白酶表达和分泌与恶性肿瘤侵袭转移的关系 ,并探索强力霉素应用于恶性肿瘤侵袭转移治疗的可能。方法 :用免疫组织化学方法和明胶电泳酶谱法研究强力霉素作用后PC - 3细胞和SAcc83细胞中MMP - 2表达和分泌的变化及其侵袭转移能力的变化。结果 :经强力霉素处理后的PC - 3细胞和SAcc83细胞MMP - 2的表达和分泌明显减少 ,侵袭能力下降 (P <0 .0 1)。结论 :MMP - 2的表达和分泌与恶性肿瘤的侵袭与转移能力有关。强力霉素有可能应用于恶性肿瘤侵袭转移的治疗。     

基质金属蛋白酶-9在腰椎间盘髓核组织中的表达

目的 检测腰椎间盘髓核组织中基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的表达，进一步阐明椎间盘退变的机制。方法 利用RT-PCR和Western-Blot技术，对20例正常腰椎间盘髓核、45例退变腰椎间盘髓核的MMP-9进行了检测。结果 正常腰椎间盘组髓核内有一定量的MMP-9表达，退变腰椎间盘组髓核MMP-9mRNA、蛋白质表达水平升高，分别是正常组的1．86和1．65倍，存在差异（P〈0．05）。结论 MMP-9与腰椎间盘髓核退变关系密切。     

胃癌组织中膜型1-基质金属蛋白酶的表达

目的 探讨膜型1－金属蛋白酶在胃癌组织的表达以及与胃癌侵袭和转移的关系。方法 采用免疫组织化学SP方法检测了47例胃癌组织MT1－MMP的表达，采用秩和T检测进行临床病理资料分析。结果 MT1－MMP在正常胃组织中几乎不表达（1／15），而在胃癌组织中高表达（42／47）。进展期胃癌表达（41／42）明显高于早期胃癌（1／5）（P＜0．01），肠型胃癌（24／28）和弥漫型胃癌（12／12）均高表达MT1－MMP，但弥漫型胃部的表达更显著（P＜0．01），浆膜侵袭组表达（32／33）与非浆膜侵袭组（10／14）的差别有非常显著的意义（P＜0．01），淋巴结转移组（31／32）与非淋巴结转移组（11／15）的差别有非常显著的意义（P＜0．01）。MT1－MMP表达定位在胃癌侵袭生长的边缘区，其中以瘤细胞为主，部分基质细胞也表达。分布形式主要有两种。带状分布主要见于肠型胃癌的粘膜，粘膜下层以及肠型胃癌和弥漫型胃癌的肌层侵袭。弥漫性分布多见于弥漫型胃癌的全层侵袭。结论 MT1－MMP表达促进胃癌的的胃壁侵袭和淋巴结转移，可作为判断胃癌恶性表型有有用指标。     

Gx加速度对家兔肺组织基质金属蛋白酶9和基质金属蛋白酶抑制剂1水平的影响

目的 通过离体实验的方法,观察-Gx加速度作用对家兔肺脏组织基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)9和基质金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP）1表达水平的影响,探索-Gx致肺损伤的作用机制。方法 选取1月龄的雄性新西兰家兔20只,随机分为实验组和对照组,每组10只。实验组动物采用水平加速度试验平台进行-Gx加速度作用,加速度作用峰值3.6 G,持续时间为2 s,每天进行加速度作用20 次,间隔5 min,连续30 d。对照组动物不进行加速度作用,其他处理同实验组。采用免疫组化方法检测各组动物肺组织MMP9和TIMP1蛋白含量变化情况。结果 ①对照组动物肺组织每高倍镜视野MMP9阳性细胞数为（13.7±7.2）,-Gx暴露组动物每高倍镜视野阳性细胞数为（28.3±12.5）,与对照组相比,-Gx暴露组动物肺组织的MMP9表达水平显著增高（P<0.05）;②对照组动物肺组织每高倍镜视野TIMP1阳性细胞数为（17.4±10.2）,-Gx暴露组动物每高倍镜视野阳性细胞数为（8.6±5.9）,与对照组相比,-Gx暴露组动物肺组织的TIMP1表达水平显著降低（P<0.05）。结论 -Gx水平加速度作用可导致家兔肺组织MMP9和TIMP1表达水平的改变,其可能参与了-Gx加速度作用致肺损伤的发生发展过程。     

基质金属蛋白酶-1在创伤性骨关节炎软骨及滑膜中的表达

目的　观察基质金属蛋白酶 - 1(MMP - 1)在兔前交叉韧带切断 (ACLT)创伤性骨关节炎 (OA)软骨及滑膜中的表达和分布 ,探讨MMP - 1表达与创伤性软骨退变之间的关系。　方法大耳白兔 2 0只行单侧ACLT术 ,术后 4周及 8周各处死 10只 ,另选 10只行单侧膝关节切开术作为假手术对照 ,于术后 8周处死。于解剖显微镜下行股骨关节面软骨退变大体评分 ,用免疫组化的方法检测MMP - 1在软骨及滑膜中的表达及分布。　结果　大体评分显示ACLT组软骨退变明显重于对照组 (P <0 .0 1) ,其中 8周组软骨退变程度又明显高于 4周组 (P <0 .0 5 )。MMP - 1主要在软骨表层及中上层、滑膜衬里层表达 ,其表达量随OA进展逐渐增高 (P <0 .0 5 )。OA早期 ,MMP - 1在滑膜中的增长滞后于它在软骨中的增长。　结论　MMP - 1与创伤性OA软骨退变关系密切 ,早期软骨退变主要源于软骨自身代谢改变 ,其后滑膜亦参与软骨退变。     

携载人基质金属蛋白酶组织抑制剂-2基因重组腺病毒载体的构建

目的　构建携载人基质金属蛋白酶组织抑制剂 2 (hTIMP 2 )基因的重组腺病毒载体 ,为基因治疗提供实验基础。方法　利用基因重组技术将腺病毒骨架质粒 pAdEasy 1以及线性化的重组穿梭质粒 pTrack CMV hTIMP 2共转化BJ5 183受体菌并在其中发生同源重组 ,利用重组前后抗性的改变筛选出重组子 ,重组腺病毒质粒AdhTIMP 2经过 2 93细胞的包装 ,扩增和纯化后 ,测定病毒滴度。一步法提取细胞总RNA ,RT PCR检测hTIMP 2的mRNA。收集细胞上清 ,进行Western杂交检测TIMP 2蛋白。结果　得到了携带hTIMP 2基因的重组腺病毒 ,纯化后滴度为 4× 10 11pfu/ml,应用RT PCR和Westernblot方法 ,在转染 2 93细胞后 2 4h即可检测到hTIMP 2的表达。结论　成功地构建了携带hTIMP 2的重组腺病毒载体 ,为下一步的基因治疗提供了基础。     

直肠癌患者手术前后血清基质金属蛋白酶9、瘦素及基质金属蛋白酶抑制剂1的变化

目的 探讨直肠癌患者手术前后血清基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）9、瘦素（leptin）和基质金属蛋白酶抑制剂（tissue inhibitor of metallopro teinases,TIMP）1表达情况及其与结直肠癌局部复发及预后的相关性。方法 收集绵阳市中心医院接受手术治疗的直肠癌患者150例的临床资料,所有患者术前、术后10 d均测定MMP9、leptin、TIMP1水平,且完成术后3年随访调查,分析MMP9、leptin、TIMP1表达与直肠癌临床病理及预后的关系。结果 术后10 d,所有直肠癌患者MMP9、leptin、TIMP1水平均降低（P<0.05）;Dukes分期为C期+D期、肿瘤侵犯浆膜层、合并淋巴结转移、术后未接受辅助治疗、术后复发/转移及术后3年死亡患者MMP9、leptin、TIMP1水平分别高于Dukes分期为A期+B期、肿瘤未侵犯浆膜层、无淋巴结转移、术后接受辅助治疗、术后未复发/转移及术后3年生存患者（P<0.05）;MMP9、leptin、TIMP1 3者表达均互呈正相关,3者与直肠癌Dukes分期、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、术后复发/转移呈正相关（P<0.05）,与术后辅助治疗及患者术后3年生存率呈负相关（P<0.05）。结论 直肠癌患者血清MMP9、leptin、TIMP1均呈过度表达,术后上述各因子水平均降低,3者表达均与直肠癌肿瘤恶性生物学行为及患者预后均存在密切关联,可作为评估手术疗效及患者预后的依据。     

基质金属蛋白酶-9及其组织抑制物-1与子宫内膜异位症的相关性研究

目的研究基质金属蛋白酶-9（MMP-9）及其组织抑制物-1（TIMP-1）是否与子宫内膜异位症（EMs）有关。方法将11例EMs轻度和32例重度患者分别作为观察组1和2,41例卵巢畸胎瘤患者作为对照组。通过ELISA法测定腹水中MMP-9及TIMP-1值,比较各组两者及其比值的差异。结果与对照组比较,EMs轻度组MMP-9、TIMP-1差异无统计学意义（P〉0.05）,EMs重度组MMP-9、TIMP-1差异有统计学意义（P〈0.05）;3组的MMP-9/TIMP-1差异均有统计学意义（P〈0.05）;EMs轻度组与重度组相比较,MMP-9差异有统计学意义（P〈0.05）,TIMP-1差异无统计学意义（P〉0.05）。结论随着疾病的加重,MMP-9升高、TIMP-1降低、MMP-9/TIMP-1比值升高,MMP-9、TIMP-1与子宫内膜异位症发生、发展有相关性,特别是两者的比值,具有重要诊断价值。     

基质金属蛋白酶-2,-9及金属蛋白酶组织抑制物-1基因在病变肝脏的表达

目的 了解不同肝病时肝内基质金属蛋白酶的变化及其与肝脏纤维化的关系.方法 应用聚合酶链反应方法,对不同肝病时肝内基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-9和金属蛋白酶组织抑制物-1的基因表达进行研究.结果 在正常肝脏,基质金属蛋白酶-2和金属蛋白酶组织抑制物-1的表达很弱,而基质金属蛋白酶-9的表达较强,提示基质金属蛋白酶-9可能是正常肝脏Ⅳ型胶原代谢的主要降解酶.急性肝损伤时,基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-9和金属蛋白酶组织抑制物-1的表达均较强,这可能与正常肝脏内基底膜样结构的降解及损伤后的修复有关.在慢性肝炎和肝硬变的肝组织内,基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9的表达较弱,而金属蛋白酶组织抑制物-1的表达较强,进一步抑制了基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9的活性,使肝内的Ⅳ型胶原的降解减少,促进了肝纤维化的形成和发展.在肝转移癌的癌旁组织内,基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9的表达较强,可能促进转移灶周围组织基底膜的破坏,与转移灶进一步扩散有关;而金属蛋白酶组织抑制物-1表达增加,可减少基底膜的破坏,可能对转移灶扩散有一定抑制作用.结论 急性肝损伤肝内胶原代谢活跃,慢性肝损伤胶原降解活性减低,在癌旁肝组织内胶原降解增加.     

人中性粒细胞多肽1真核表达载体的构建与表达

目的 构建人中性粒细胞多肽1(HNPl)基因真核表达载体,为探讨HNP1基因工程生产的可能性奠定基础。方法 从健康人中性粒细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出HNPl基因cDNA片段,将纯化PCR产物与pMD18-T载体连接,经酶切鉴定及测序确证,将其亚克隆入真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO中．用脂质体转染CA3S-7细胞,用BA-ELISA法检测转染细胞上清中HNP1的表达。结果 从人中性粒细胞中克隆出人HNP1基因,经测序分析与GenBank公布的人HNP1核苷酸序列完全一致,并在COS-7细胞中获高效瞬时表达。结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO／HNP1,为后续哺乳动物工程细胞株的建立奠定了实验基础。     

MARCH1真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建MARCH1真核表达载体并进行鉴定和纯化,为研究MARCH1在小鼠树突细胞(DCs)中的生物学作用奠定基础.方法 从小鼠尾部提取cDNA作为模板,采用特异的引物,通过聚合酶链反应(PCR)扩增MARCH1cDNA片段,经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切,连接于载体pMB-HA质粒上,构建重组载体,经双酶切和DNA测序分析检测重组载体构建结果,转化大肠埃希菌DH5α感受态菌、筛选阳性克隆、抽提质粒并进行纯化.结果 PCR获得与预期大小一致(约3900bp)的cDNA片段,成功构建重组载体pMB-HA-MARCH1,双酶切及测序鉴定证实MARCH1 cDNA片段正确插入该真核表达载体中.结论 成功构建含有MARCH1的真核表达载体,为进一步研究提供了实验基础.     

人血管生成素-1真核表达载体的构建与表达

目的构建人血管生成素-1的真核表达载体,真核表达人血管生成素-1蛋白并进行纯化。方法通过聚合酶链反应（PCR）将人血管生成素-1基因片段插入B7载体中构建真核表达载体,通过转染中国仓鼠卵巢（CHO）细胞进行真核表达。结果成功构建了B7Ang-1真核表达载体,在CHO细胞中进行了稳定表达,获得了纯化的人血管生成素-1蛋白。结论真核系统表达的人血管生成素-1蛋白具有良好的抗原性,为进一步的生物活性研究和临床应用奠定了基础。     

人miR-139高效真核表达载体的构建及其功能初探

目的 构建人miR-139高效真核表达载体,初步探究miR-139在乳腺癌ZR75-1细胞中的功能.方法 设计成熟miR-139的PCR引物,扩增包含miR-139成熟序列的基因组序列.将扩增产物亚克隆到真核表达载体PIRES2-EGFP(IE)上,构建miR-139真核表达载体IE-139.将IE-139转染至乳腺癌ZR75-1细胞中,通过实时定量PCR(qRT-PCR)检测miR-139的表达情况,同时检测过表达miR-139的乳腺癌ZR75-1细胞中癌基因c-Myc、EIF4G2和ZBTB34的mRNA水平.结果 酶切、测序结果表明,人miR-139真核表达载体构建成功;qRT-PCR表明,miR-139能在乳腺癌ZR75-1细胞中高效表达(P<0.01),过表达miR-139的乳腺癌ZR75-1细胞中c-Myc和EIF4G2的mRNA表达水平显著降低(P<0.05),但ZBTB34的下降水平不明显.结论 成功构建了人miR-139真核表达载体IE-139,通过qRT-PCR检测,证明该载体能成功实现miR-139的高效过表达,并且miR-139能明显抑制乳腺癌ZR75-1细胞中癌基因c-Myc和EIF4G2的mRNA表达水平,这为进一步研究miR-139的功能及调控靶基因的分子机制奠定了基础.     

microRNA-7真核表达载体的构建及其对细胞增殖能力的影响

目的构建miR-7真核表达载体,以研究miR-7过表达后对细胞增殖能力的影响。方法以人全血标本基因组为模板,PCR扩增miR-7序列,然后将该序列克隆入pHRS-1cla-CMV-EGFP载体中,构建pHRS-1cla-miR-7-CMV-EGFP慢病毒表达载体。将构建好的载体瞬时转染入293FT细胞中,利用RT-PCR技术对转染前后293FT细胞中miR-7的表达水平进行检测。将pHRS-1cla-miR-7-CMV-EGFP慢病毒表达载体瞬时转染入乳腺癌细胞系MCF-7中,利用CCK-8法以及BrdU增殖实验检测过表达miR-7后细胞增殖能力的变化。结果构建的pHRS-1cla-miR-7-CMV-EGFP慢病毒表达载体质粒酶切和测序鉴定结果正确,实时定量RT-PCR结果表明,与转染pHRS-1cla-CMV-EGFP对照载体细胞相比,转染pHRS-1cla-miR-7-CMV-EGFP慢病毒表达载体72 h后的293FT细胞成功地过表达miR-7达76.8倍。CCK-8法以及BrdU增殖实验检测过表达miR-7后乳腺癌细胞系MCF-7的增殖能力显著性下降（P〈0.05）。结论成功构建了pHRS-1cla-miR-7-CMV-EGFP慢病毒表达载体,瞬时转染后细胞可以有效地高表达miR-7,同时证明过表达miR-7可以使细胞的增殖能力受到明显抑制。     

MRP在人涎腺腺样囊性癌细胞中的表达及意义

目的:通过检测MRP蛋白的表达,探讨人涎腺腺样囊性癌细胞产生多药耐药的机制。方法:用浓度为1μg/ml的顺铂作用于腺样囊性癌细胞,每次作用时间48 h,经6个月后形成在该药物浓度下生长良好的耐顺铂细胞。运用免疫组化、Western-blot法检测SACC和SACC/DDP细胞株中MRP蛋白的表达,RT-PCR检测SACC和SACC/DDP的MRP mRNA的表达。结果:诱导形成的顺铂作用环境下生长稳定的细胞株SACC/DDP,其MRP蛋白和MRP mRNA表达水平明显高于母本细胞SACC(P<0.01)。结论:SACC/DDP细胞的细胞浆中以及细胞膜上MRP蛋白的表达率很高,可能是涎腺腺样囊性癌细胞产生多药耐药的机制所在。     

双顺反子真核表达载体pVAX1-IRES的构建与鉴定

目的:为适应恶性肿瘤免疫治疗中多基因联合应用的需要,在真核表达载体pVAX1的基础上,利用内部核糖体进入位点IRES序列,构建双顺反子真核表达载体pVAX1-IRES,以增强DNA疫苗的免疫疗效.方法:通过PCR扩增获得目的基因IRES并定向克隆到pVAX1载体中,然后在IRES序列的上下游分别插入红色荧光蛋白基因DsRed1和增强型绿色荧光蛋白基因EGFP,瞬时转染人胚胎肾细胞293T,通过流式细胞术和免疫荧光验证基因表达.结果:pVAX1-IRES经相应酶切和测序鉴定,与预期设计一致,DsRed1基因和EGFP基因在pVAX1-IRES载体中,不仅可以分别表达,而且可以同时表达,显示该双顺反子真核表达载体构建成功.结论:pVAX1-IRES双顺反子表达载体的构建,为基因联合表达和恶性肿瘤的免疫治疗作了必要准备.     

凋亡相关斑点样蛋白ASC真核表达质粒的构建及表达

目的构建凋亡相关的斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC）真核表达质粒。方法从人胚肾细胞系HEK293T细胞的总RNA中经过逆转录和PCR获得ASC的全长cDNA双链片段,经过酶切后连接到真核表达载体pcDNA3/flag中,挑选出转化生成的阳性克隆测序,将序列正确的重组质粒命名为pcDNA3/flag-ASC。脂质体转染pcDNA3/flag-ASC质粒到HEK293T细胞中,用Western印迹检测目的蛋白的表达。同时用免疫沉淀和免疫印迹方法检测ASC蛋白与前半胱天冬酶（pro-caspase）-1的相互作用,并用ELISA方法检测ASC蛋白对IL-1β分泌的影响。结果 Western印迹实验证明pcDNA3/flag-ASC可以在HEK293T细胞中表达ASC,并且可以与pro-caspase-1结合,使IL-1β分泌明显降低。结论构建了重组质粒pcDNA3/flag-ASC,在细胞中表达ASC后具有与pro-caspase-1结合的能力,并具有降低IL-1β分泌的生物活性。     

人野生型和突变型CITED2真核表达质粒的构建与表达

目的 构建人转录辅助因子CITED2突变型(c.573-578del6)及野生型真核表达质粒并检测两种重组质粒CITED2蛋白的表达情况.方法 分别以健康儿童和CITED2基因突变的先天性心脏病患儿血细胞DNA为模板,PCR定向克隆扩增野生型和突变型CITED2编码链,分别T/A克隆至pMD19-T simple质粒上,筛选出野生型和突变型CITED2的T载体重组质粒.应用DNA重组技术将T载体重组质粒上的CITED2基因片段亚克隆入真核表达载体pEGFP-C1,构建pEGFP-C1-wtCITED2和pEGFP-C1-mtCITED2真核表达质粒,并分别转染至HEK293细胞,24h后在荧光显微镜下观察质粒转染情况,48h后应用流式细胞仪检测转染效率,Western blotting检测CITED2蛋白的表达.结果 成功构建了人野生型pEGFP-C1-wtCITED2和突变型pEGFP-C1-mtCITED2真核表达质粒.转染至HEK293细胞后24h,在荧光显微镜下可观察到各转染组EGFP的表达,转染后48h流式细胞仪检测转染效率为50％ ～ 60％,Western blotting检测可见CITED2蛋白与EGFP的融合表达.结论 成功构建了人转录辅助因子CITED2突变型及野生型真核表达质粒,并检测到CITED2蛋白的表达.