实验性大鼠矽肺纤维化中核转录因子Sp1的表达及作用

目的初步探讨核转录因子Sp1在实验性矽肺发生发展中的作用。方法复制SD大鼠矽肺模型,用免疫组织化学法检测体内SiO2刺激的肺巨噬细胞、肺泡Ⅱ型上皮细胞等肺纤维化效应细胞中核转录因子Sp1蛋白表达的定位和动态变化。结果大鼠实验性矽肺模型中,SiO2刺激组与空白对照组相比,肺巨噬细胞、肺泡Ⅱ型上皮细胞、肺间质细胞中转录因子Sp1蛋白表达上调,于染尘后第14天达高峰。结论SiO2能上调肺内多种细胞Sp1的表达,Sp1可能在矽肺的发生发展过程中起重要作用。     

激活蛋白-1介导二氧化硅诱导的巨噬细胞细胞因子的表达

目的 探讨SiO2诱导小鼠巨噬细胞RAW 264.7细胞肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和转化生长因子-β1(TGF-β1)表达改变是否与激活蛋白-1(AP-1)活化有关.方法 用AP-1的抑制剂姜黄素处理巨噬细胞后,用Western blotting检测核蛋白AP-1(c-jun/c-fos)的表达,用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测细胞上清液中TNF-α、TGF-β1蛋白的含量;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测TNF-α、TGFβ1 mRNA的表达.结果 10和20 μmol/L姜黄素处理组c-jun的核蛋白表达为1.150±0.020、1.010±0.108,c-fos的核蛋白表达为0.430±0.023、0.256±0.015,明显低于SiO2刺激组(1.550±0..029、0.860±0.036),差异有统计学意义(P《0.01),且呈剂量依赖关系.20μmo/L姜黄素处理组TNF-α、TGFo-β1蛋白表达分别为123.58±45.78、32.12±5.34,明显低于SiO2刺激组(1582.18±437.52、55.60±5.51);TNF-α、TGF-β1 mRNA表达水平分别为0.74±0.01、0.22±0.04,也明显低于SiO2刺激组(2.27±0.33、2.96±0.15),差异均有统计学意义(P《0.01).结论 SiO2刺激巨噬细胞生成TNF-α、TGF-β1与AP-1的活化有关.     

二氧化硅对矽肺患者肺泡巨噬细胞白细胞介素-1β表达的影响

目的 探讨二氧化硅(SiO2)刺激矽肺患者肺泡巨噬细胞(AM)对白细胞介素-1β(IL-1β)表达的影响.方法 收集矽肺患者的肺泡灌洗液,分离培养AM,对照组加入无血清培养液,处理组加入含SiO2粉尘不含血清的培养液.两组在相同条件下分别培养3、6、12、18、24、36 h,用免疫细胞化学法和酶联免疫吸附(ELISA)方法检测AM细胞内及其培养上清中IL-1β的表达.结果 处理组AM胞质中的IL-1β表达呈双峰,3 h已有较高水平的IL-1β(平均吸光度值为0.2597±0.0102),并随刺激时间不同表达量不同,在12 h达最高浓度(平均吸光度值为0.3632±0.0076),且处理组AM胞质中IL-1β的表达在各个时间点均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01);AM培养上清IL-1β的表达与细胞质内的情况一致.结论 SiO2可促进AM的IL-1β表达增高,IL-1β在肺纤维化形成过程中起较重要的作用.     

Toll样受体4在二氧化硅诱导巨噬细胞肿瘤坏死因子α合成中的作用

目的 探讨Toll样受体4(TLR4)在二氧化硅诱导巨噬细胞肿瘤坏死因子α(TNFα)合成过程中的介导作用.方法 将二氧化硅的粉尘悬液与人巨噬细胞株THP-1温育,收集细胞培养液,利用酶联免疫吸附(ELISA)方法测定培养液中TNFα的含量.为了解TLR4在二氧化硅诱导TNFα合成过程中的作用,用TLR4受体的中和抗体(HTA125,20 μg/ml)预处理THP-1细胞,观察该处理对二氧化硅上述作用的影响.此外,利用可表达野生型或突变型TLR4的小鼠巨噬细胞株,进一步比较二氧化硅诱导两型细胞合成TNFα水平的差异.结果 100 μg/ml二氧化硅刺激THP-1细胞4、8 h,可致细胞TNFα的释放量升高[分别为(4.71±0.84)、(6.22±0.58)pg/ml],为对照组[(3.18±0.41)pg/ml]的1.48和1.96倍,差异有统计学意义(P<0.05).用HTA125抗体预处理THP-1细胞,可致二氧化硅诱导细胞释放TNFα的量降低27%.同表达野生型TLR4的小鼠巨噬细胞相比,表达突变型TLR4细胞在二氧化硅刺激后TNFα的释放量降低30%.结论 TLR4在二氧化硅诱导TNFα合成过程中起一定的作用.     

Toll样受体4在二氧化硅诱导巨噬细胞肿瘤坏死因子α合成中的作用

Objective To characterize the role of Toll-like receptor 4 (TLR4) in silica-induced pro-duction of tumor necrosis factor α(TNFα) from macrophage cell line. Methods The human macrophage cell line THP-1 was incubated with silica suspension. Cell media were collected and TNFα levels in the super-natants measured with ELJSA. To examine the involvement of TLR4 in silica-induced TNFα release, the neu-tralizing antibody (HTA125) against human TLR4 receptor was employed topretreat THP-1 cells prior to silica treatment. Moreover, murine macrophages expressing wild type or mutated TLR4 were also treated with silica to verify the effect of TLR4 in silica-induced TNFα release. Results Compared with the control group[(3.18± 0.41) pg/ml], the TNFα release in cells exposed to 100 μg/ml silica for 4 h and 8 h [(4.71±0.84),(6.22±0.58) pg/ml, respectively] increased 1.48 and 1.96 fold, respectively. Pretreatment of THP-1 cells with 20 μg/ml HTA 125 antibody significantly blocked silica-induced TNFα release by 27%. Furthermore, the TNFα content re-leased from cells expressing mutated TLR4 reduced by 30% in compared with that from the cells expressing wild type TLR4 after silica stimulation. Conclusion TLR4 mediates silica-induced TNFα release from macrophages.     

Toll样受体4在二氧化硅诱导巨噬细胞肿瘤坏死因子α合成中的作用

Objective To characterize the role of Toll-like receptor 4 (TLR4) in silica-induced pro-duction of tumor necrosis factor α(TNFα) from macrophage cell line. Methods The human macrophage cell line THP-1 was incubated with silica suspension. Cell media were collected and TNFα levels in the super-natants measured with ELJSA. To examine the involvement of TLR4 in silica-induced TNFα release, the neu-tralizing antibody (HTA125) against human TLR4 receptor was employed topretreat THP-1 cells prior to silica treatment. Moreover, murine macrophages expressing wild type or mutated TLR4 were also treated with silica to verify the effect of TLR4 in silica-induced TNFα release. Results Compared with the control group[(3.18± 0.41) pg/ml], the TNFα release in cells exposed to 100 μg/ml silica for 4 h and 8 h [(4.71±0.84),(6.22±0.58) pg/ml, respectively] increased 1.48 and 1.96 fold, respectively. Pretreatment of THP-1 cells with 20 μg/ml HTA 125 antibody significantly blocked silica-induced TNFα release by 27%. Furthermore, the TNFα content re-leased from cells expressing mutated TLR4 reduced by 30% in compared with that from the cells expressing wild type TLR4 after silica stimulation. Conclusion TLR4 mediates silica-induced TNFα release from macrophages.     

矽肺患者外周血的单核细胞核转录因子-κB水平

目的观察矽尘接触者和矽肺患者外周血单核细胞核转录因子-κB(NF-κB)水平的变化,探讨NF-κB在矽肺发生发展中的作用。方法采用ELISA法对100名不接触粉尘的对照人群,200名接触矽尘1年以上的接尘工人,32名矽尘作业观察对象(原诊断0+患者)及79例矽肺患者,检测其外周血单核细胞胞核蛋白中的NF-κB水平。结果矽肺组NF-κB水平较对照组和接尘组明显升高,接尘组NF-κB水平较对照组明显升高,差异均有统计学意义;在不同期别矽肺患者中NF-κB水平随矽肺期别升高也有升高的趋势。多元回归分析也表明NF-κB水平与接尘情况和矽肺的病情有关。结论接尘组和矽肺组外周血单核细胞NF-κB均有升高,此种升高除与矽肺的发病有关外,与矽肺的严重程度也有关,提示对外周血单核细胞NF-κB水平的监测可能成为矽肺发病预测、预后评估的生物标志物,而适当干预NF-κB的活化可能是矽肺防治新的干预靶点。     

二氧化硅致人单核细胞THP-1核因子-κB活化定位改变的研究

目的 探讨矽肺发病过程中SiO2诱导对人单核细胞株THP-1核因子-κB(NF-κB)活化的影响。方法 采用间接免疫荧光细胞化学法结合激光共聚焦显微镜(LSCM，Zeiss 510)检测THP-1细胞NF-κB p65亚基(NF-κB／p65)定位；Western-blot法测定THP-1细胞核蛋白中NF-κB／p65水平。结果 免疫荧光分析显示，异硫氰酸荧光素(FTTC)标记的NF-κB／p65在胞浆区为绿色荧光，而进入了丙亚基碘(PI)红色荧光标记的胞核区时则红绿两色叠加成黄色荧光。正常细胞NF-κB／p65主要分布于胞浆区，核区很少，而100μg/mlSiO2刺激30min后NF-κB／p65荧光标记集聚于核区，胞浆区少见。Westem-blot结果显示，对照组(0μg/mlSiO2)THP-1细胞核蛋白中有低水平NF-κB／p65表达,100μg/ml和200μg/ml SiO2作用15min和30min，THP-1细胞核蛋白中NF-κB／p65表达增加，并随着剂量的增加和时间的延长，NF-κB／p65水平相对增加。NF-κB／p65激活剂脂多糖(LPS)处理的THP-1细胞NF-κB／p65定位情况和核蛋白水平与上述结果相似。结论 SiO2刺激可引起THP-1单核细胞NF-κB核转位活化。     

二氧化硅对肺泡巨噬细胞膜K^＋通透性和LDH影响的研究

采用体外培养方法，检测了不同剂量的ＳｉＯ２和同一剂量，不同培养时间对肺泡巨噬细胞（ＡＭ）膜Ｋ含量和ＬＤＨ活性的影响。结果表明，低剂量的ＳｉＯ２，ＬＤＨ即有较明显的变化，且Ｋ含量和ＬＤＨ活性的剂量－反应关系和时间－效应关系。Ｋ含量和ＬＤＨ活性为反映膜损伤较简便和敏感的指标，为及时保护扫尘工人的健康提供实验依据。     

SiO2刺激矽肺肺泡巨噬细胞对MMP-9和TIMP-1表达的影响

目的 探讨SiO2对矽肺患者的肺泡巨噬细胞(AM)基质金属蛋白酶-9(MMP-9)及金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)-1表达的影响.方法 收集矽肺患者肺泡AM,体外经SiO2刺激3、6、12、18、24、36 h,分别用明胶酶谱法和免疫细胞化学方法检测AM中TIMP-1、MMP-9蛋白表达和MMP-9活力.结果 实验组AM中6、12、18、24 h MMP-9的蛋白表达增强,在18 h时最高(积分吸光度值为0.386±0.037),与同期对照组相比,差异均有统计学意义(P＜0.05).实验组12、18、24、36h AM中MMP-9活力的表达增强,在24 h最强(吸光度值3.061±0.153),与同期对照组相比,差异均有统计学意义(P＜0.05).实验组与对照组各时间点TIMP-1蛋白表达比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 体外SiO2刺激矽肺肺泡AM可影响MMP-9蛋白及其活力的表达.     

矽肺纤维化体外细胞模型的建立

目的根据SiO2对不同类型细胞的增殖效应,建立矽肺纤维化的体外细胞模型.方法以不同剂量的SiO2刺激SD大鼠肺泡巨噬细胞(PAM)及佛波酯(PMA)诱导分化THP-1(具有PAM特性的人血单核细胞株)细胞的培养上清液,分别作用于中国仓鼠肺成纤维细胞(CHL)和貂肺上皮细胞(CCL-64),采用四唑盐(MTT)比色法测定其增殖效应(以A570nm值表示).结果在0、50、100、200、500μg/ml SiO2浓度范围内,用体积分数为5%的SiO2刺激的PAM和体积分数为10%的SiO2刺激的PMA-primed THP-1细胞上清液分别作用于CHL和CCL-64细胞,均可引起细胞增殖,200、500μg/ml SiO2剂量组与对照组的差异有显著性,并存在剂量-效应关系(CHLr1=0 914,P＜0.05;r2=0.980,P＜0.01.CCL-64r1=0.975,P＜0 01;r2=0.956,P＜0.01).以体积分数为10%的SiO2刺激PAM的上清液分别作用于CHL和CCL-64,50μg/ml SiO2组的A570nm值为CHL0.66±0.05,CCL-640.21±0.04,与对照组(CHL0.74±0.04;CCL-640.26±0.04)的差异有显著性(P＜0.05),均表现为抑制增殖作用.结论利用体积分数为5%的SiO2刺激的PAM上清液和体积分数为10%的SiO2刺激的PMA-primed THP-1细胞上清液作用于CHL和CCL-64建立的体外细胞模型在矽肺纤维化发生和矽肺相关肺癌的研究中有应用前景.     

二氧化硅对肺成纤维细胞连接蛋白Cx43表达的影响

目的通过研究SiO2对连接蛋白(Cx)Cx43表达的调节,了解SiO2抑制肺成纤维细胞细胞间隙连接通讯(GJIC)功能的机制.方法以不同剂量SiO2刺激SD大鼠肺泡巨噬细胞(PAM)及佛波酯(PMA)诱导分化的THP-1(具有PAM特性的人血单核细胞株)细胞培养上清液,作用于中国仓鼠肺成纤维细胞(CHL),采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(ELISA)相对定量CHL细胞Cx43的含量(以A492nm表示),用四唑盐(MTT)法测定其增殖效应(以A570nm表示).结果在0、50、100、200、500μg/ml SiO2浓度范围内,SiO2剂量与SiO2刺激的PAM和PMA-primed THP-1上清液诱导的增殖效应呈正相关(r1=0.914,P＜0.05;r2=0.980,P＜0.01).SiO2刺激的PAM上清液促进CHL细胞Cx43蛋白的表达,50、100、200、500 μg/ml SiO2剂量组Cx43的A492nm值分别为(0.171±0.027、0.161±0.041、0.257±0.040和0.208±0.026),与SiO20 μg/ml对照组(0.105±0.008)比较,差异均有显著性(P＜0.05).SiO2刺激的PMA-primedTHP-1细胞上清液对CHL细胞Cx43蛋白表达水平无明显影响.结论 SiO2刺激PAM分泌活性因子进而抑制肺成纤维细胞GJIC功能的调节机制可能发生在Cx的翻译后水平.     

二氧化硅影响人肺成纤维细胞α-平滑肌肌动蛋白表达的实验研究

目的 探讨二氧化硅（SiO2）体内体外影响人肺成纤维细胞α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达情况.方法 体内实验以SiO2灌注的大鼠矽肺模型为研究对象,实验组32例（7、14、21和28d各8例）,对照组32例.免疫组化法检测肌成纤维细胞标志物α-SMA的表达;体内实验以人肺成纤维细胞（HLF-02）为研究对象,分别用SiO2刺激的体外小鼠腹腔巨噬细胞系（RAW264.7细胞）上清液、SiO2未刺激的RAW264.7细胞上清液、SiO2悬液以及转化生长因子β1（TGF-β1）作用24 h,免疫印迹法检测α-SMA的表达变化情况.结果 （1）染尘28 d大鼠肺组织有表达α-SMA阳性的肌成纤维细胞出现.（2）RAW264.7细胞上清液（SiO2）可诱导HLF-02细胞α-SMA的表达,而TGF-β1可明显上调α-SMA表达.（3）单纯SiO2悬液对HLF-02细胞α-SMA的表达没有影响.结论 肌成纤维细胞与矽肺纤维化进展有关;体外条件下肌成纤维细胞的出现不是SiO2直接作用的结果,而与SiO2活化巨噬细胞分泌的介质TGF-β1有关.     

SiO2尘刺激肺泡巨噬细胞上清液对Mv-1-lu细胞迁移的影响

目的探讨ＳｉＯ２刺激肺泡巨噬细胞（ＰＡＭ）的上清液对肺泡上皮细胞的迁移和增殖的影响。方法采用Ｂｏｙｄｅｎｃｈａｍｂｅｒ系统,观察空白对照（０μｇ／ｍｌＳｉＯ２）和２００μｇ／ｍｌＳｉＯ２刺激ＰＡＭ的上清液（１．０×１０６～１．５×１０６ＰＡＭ／ｍｌ）对貂肺泡上皮细胞株Ｍｖ１ｌｕ细胞的迁移和增殖的影响。结果２００μｇ／ｍｌＳｉＯ２ＰＡＭ的上清液对Ｍｖ１ｌｕ细胞的迁移和增殖效应明显低于空白对照组。结论ＳｉＯ２刺激ＰＡＭ的上清液对Ｍｖ１ｌｕ细胞的迁移和增殖均有明显的抑制作用;ＳｉＯ２吸入可以刺激ＰＡＭ分泌某些因子,对肺泡上皮细胞损伤的修复产生抑制作用。     

二氧化硅刺激肺成纤维细胞间隙连接功能下调的研究

目的　探索矽肺发病过程中二氧化硅(SiO     

AcSDKP对大鼠矽肺纤维化转化生长因子-β1和结缔组织生长因子表达的抑制

目的 探讨N-乙酰基-丝氨酰-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸(AcSDKP)对大鼠肺内转化生长因子(TGF)-β1、结缔组织生长因子(CTGF)表达的影响.方法 将大鼠随机分为6组.每组10只.对照组大鼠支气管内灌注1.0 ml生理盐水,矽肺模型对照1组4周后处死,矽肺模型对照2组8周后处死;矽肺模型组大鼠予SiO2混悬液50 mg/ml,矽肺模型1组4周后处死,矽肺模型2组8周后处死;抗纤维化治疗组(治疗组):支气管内灌注SiO2混悬液50mg/ml,4周后给予AcSDKP 800 μg/(kg·d),至第8周处死;预防治疗组给予AcSDKP800μg(kg·d)48h后,支气管内灌注SiO2混悬液50mg/ml,8周后处死.HE染色进行形态学观察;采用免疫组织化学法检测TGF-β1与CTGF的蛋白表达;采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)及反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测TGF-β1与CTGF的mRNA表达.结果 治疗组TGF-β2及CTGF蛋白表达分别为0.244±0.016、0.241±0.017,明显低于矽肺模型1组和矽肺模型2组;治疗组TGF-β1 mRNA及CTGF mRNA表达水平明显低于矽肺模型1组和矽肺模型2组,差异均有统计学意义(P<0.05);预防治疗组TGF-β1和CTGF蛋白表达和mRNA表达水平明显低于矽肺模型2组,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 AcSDKP能减轻实验性矽肺纤维化大鼠肺组织中的TGF-β1与CTGF表达水平.     

矽肺患者肺泡巨噬细胞培养上清对人胚肺成纤维细胞c-myc基因表达的影响

目的 探讨矽肺患者肺泡巨噬细胞(AM)培养上清对人胚肺成纤维细胞(HEFB)c-myc基因表达的影响.方法 AM分为加尘组(SiO2,30μg/ml)和对照组,培养1、2、6、12、24和36 h,收集培养上清.Ⅲ代HEFB用质量分数为0.5%的血清培养液培养48 h使大部分细胞处于静止期后,加人SiO2刺激6 h的AM培养上清(S6组),用反转录一聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot方法观察c-mycmRNA和蛋白的时程变化.然后将各组AM上清与静止状态的HEFB孵育2和7 h,观察c-myc mRNA和蛋白表达的变化.结果 HEFB在静止状态时c-myc mRNA和蛋白的表达为0,在对照组中,培养不同时间的AM上清刺激了c-myc mRNA及蛋白的表达,以AM培养12 h的卜清作用最明显,比值分别为0.749±0.088和0.759±0.101.加尘组中各上清也刺激了c-myc mRNA和蛋白的表达,但作用高峰提前,以SiO2刺激6 h的上清作用最明显,比值分别0.982±0.147和0.978±0.141.与同期对照相比,SiO2刺激1、2和6 h的AM上清诱导mRNA和蛋白表达增多,差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01).结论 SiO2激活的AM培养上清可促进HEFB c-myc基因的表达.