可注射性藻酸钙凝胶修复整合兔膝关节骨软骨缺损实验研究

目的: 使用骨髓基质干细胞 (BMSCs)、藻酸钙及两种生长因子, 修复兔股骨内髁负重区骨软骨缺损, 寻找合适的关节骨软骨缺损修复方法。方法: 将藻酸钙、体外培养扩增的自体BMSCs及IGF I TGF β复合材料注射于兔膝关节股骨内髁负重区上的骨软骨缺损。结果: BMSCs在藻酸钙中能分化为软骨细胞和成骨细胞, 材料无毒副作用; 关节骨软骨缺损后注入BMSCs 藻酸钙 IGF I TGF β复合体, 各期修复较对照组均有统计学意义 (P<0. 05)。结论: 藻酸钙能为BMSCs提供良好三维生长环境并能使之保持正常形态; BMSCs 藻酸钙 IGF I TGF β复合体能用于关节骨软骨急性缺损修复, 形成正常透明软骨样结构, 软骨下骨修复良好。     

BrdU标记的同种异体骨髓基质干细胞移植治疗兔股骨头坏死骨缺损模型

[目的]探讨同种异体骨髓基质干细胞移植治疗股骨头坏死的可行性,并研究移植细胞的转归和缺损区新生骨的来源.[方法] 24只新西兰大耳白兔随机分成两组,每组12只,所有动物的双侧股骨头均参加实验.用液氮冷冻法造模,股骨头钻孔造成骨缺损.对照组置入胶原蛋白海绵,实验组置入复合有定向诱导并用BrdU标记的第5代同种异体骨髓基质干细胞的胶原蛋白海绵.分别于术后2、4、8、12周处死3只实验动物.所获的股骨头标本分别做组织切片HE染色、BrdU免疫组织化学染色,进一步测算股骨头冠状截面的新生骨小梁在骨缺损区所占的面积百分比,做统计分析.[结果]股骨头标本切片后行免疫组织化学染色,可见成骨细胞及骨细胞的核均呈棕褐色.实验组缺损区2周时新生骨小梁开始形成,并可见少量的浆细胞和淋巴细胞,4周时浆细胞和淋巴细胞明显减少,12周时缺损区可见大量细小的骨小梁,炎性细胞消失.两组实验动物股骨头冠状截面的新生骨小梁在骨缺损区所占的面积百分比具有统计学意义上的差异(P＜0.05).[结论]移植的骨髓基质干细胞的最终转归是缺损区新生骨小梁,同种异体骨髓基质干细胞可以用于股骨头坏死的治疗.     

微小颗粒骨复合细胞移植治疗大鼠颅骨缺损

目的 观察自体微小颗粒骨复合骨髓基质细胞(MSC)或成骨细胞移植修复大鼠颅骨缺损的治疗效果。方法 制作大鼠颅骨缺损动物模型，培养同种异体新生大鼠的骨髓基质细胞及成骨细胞，复合自体颗粒骨植入骨缺损区，X线摄片观察骨愈合情况；逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)检测骨钙素、转化生长因子-β1(TGF-β1)表达水平。结果植入微小颗粒骨复合成骨细胞组颅骨缺损愈合最快，骨钙素、TGF-β1表达出现早，与另两组差异有统计学意义(P＜0．05)。植入微小颗粒骨复合骨髓基质细胞组颅骨缺损愈合时间居中，骨钙素、TGF-β1表达早于单纯微小颗粒骨组(P＜0．05)。结论 微小颗粒骨复合细胞移植修复颅骨缺损，细胞因子表达早，缺损愈合明显加快，具有较好的治疗效果。     

钙离子对骨髓基质干细胞增殖及成骨分化的影响

目前,关于钙离子对成骨细胞增殖分化的影响已有少量研究,研究结果表明钙离子与成骨细胞活性及成骨分化基因的表达都有密切关联[1],但对骨髓基质于细胞(BMSCs)成骨分化过程的影响报道尚少.我们采用柠檬酸钙作为钙源,添加到无钙培养基中配制不同浓度的含钙培养基,检测钙离子对BMSCs增殖及成骨分化的作用.     

5-BrdU标记的骨髓间充质干细胞对大鼠创面愈合的作用研究

目的探讨以5-溴脱氧尿嘧啶（5-BrdU）标记的骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）在大鼠创面愈合中的作用。方法分离培养大鼠BMSCs并用流式细胞仪技术鉴定。在大鼠背部脊柱一侧制作全层皮肤缺损模型，实验组经尾静脉注入经5-BrdU标记的BMSCs，移植细胞数为2×10^7。对照组为5-BrdU标记的BMSC移植的正常大鼠。术后3d、7d、14d、21d、28d分批处死动物，观察移植细胞参与创面愈合的情况。结果流式细胞仪鉴定细胞表达CD29、CD90；CD45表达呈阴性。实验组：经5-BrdU体外标记的BMSCs进行细胞移植14d后，大鼠创面局部及边缘可见5-BrdU标记的阳性细胞聚集，免疫组化染色可见基底层、真皮层、新生血管周围有散在红棕色标记细胞；对照组中未发现明显的聚集现象；抗BrdU／FⅧ、BrdU／波形蛋白免疫双标技术检测结果显示：在创伤部位有部分BMSCs分化为血管内皮细胞和成纤维细胞参与创面愈合。大鼠正常皮肤中未见明显的BMSCs聚集和增殖分化情况。结论经尾静脉注射移植的BMSCs参与皮肤创面愈合。     

土鳖虫对激素诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的:探讨激素性股骨头缺血坏死的发病机制及土鳖虫防治该病的作用机制。方法:体外培养骨髓间充质干细胞,传3代BMSCs随机分为空白组,模型组及中药低、中、高剂量组。模型组应用大剂量地塞米松诱导体外培养的骨髓间充质干细胞成脂分化,抑制其成骨分化。中药低、中、高剂量组在诱导成脂的同时给予土鳖虫含药血清干预。检测干预6d后各组细胞内成骨标志物骨钙素、碱性磷酸酶及Ⅰ型胶原mRNA的表达。结果:土鳖虫含药血清可逆转激素诱导下的BMSCs内碱性磷酸酶含量,骨钙素及Ⅰ型胶原mRNA表达均降低。结论:土鳖虫防治激素性股骨头缺血坏死的机制不仅是改善股骨头的微循环,同时还与其抑制激素诱导下的BMSCs成骨分化减少有关。     

自体成骨细胞的诱导培养及其生物学特性

目的 诱导培养来自自体骨髓间充质干细胞的成骨细胞或成骨细胞的前体细胞，进行自体成骨细胞异体骨复合移植实验研究。方法 抽取动物骨髓、抗凝稀释，以适当条件培养诱导，分化为成骨细胞并分析细胞生物学特性。成骨细胞生长在同种异体骨制成的载体上，形成复合物，植入人工缺损处，观察骨修复情况。结果 可以诱导培养出大量的成骨细胞或成骨细胞的前体细胞。自体成骨细胞异体松质骨复合物修复骨缺损的效果明显优于对照组。结论 本实验为自体成骨细胞异体骨复合移植的临床应用提供一个简单有效的方法。     

生长板软骨细胞对骨髓基质干细胞体外分化的影响

目的 观察大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)在与大鼠生长板软骨细胞体外共培养条件下，BMSCs碱性磷酸酶(ALP)活性变化及成骨分化的标志骨钙素与Ⅰ型胶原mRNA水平表达的影响，从而认识生长板软骨细胞旁分泌作用对BMSCs分化的影响，以期帮助认识生长板损伤后骨桥形成的发生机制。方法 大鼠BMSCs在与生长板软骨细胞进行间接共培养，并设阴性对照。测定ALP活性．用RT-PCR方法，检测Ⅰ型胶原与骨钙素mRNA的表达。结果 BMSCs随共培养时间的延长，ALP活性明显升高，Ⅰ胶原mRNA表达丰度明显高于对照组，骨钙素mRNA在对照组中几乎未见PCR扩增产物，共培养组在终末期则有一定的表达。结论 BMSCs在与大鼠生长板软骨细胞体外共培养后，出现成骨分化倾向：随时间延长效应愈加显著，提示生长板软骨细胞的旁分泌作用可以促进BMSCs向成骨分化。     

纳米人工骨在股骨头坏死缺损模型修复的影像学观谗

目的用影像学方法观察纳米人工骨和骨髓间充质干细胞在治疗股骨头坏死缺损动物模型修复的效果.方法建立双侧股骨头内骨缺损模型,并分为3组,A组为制作缺损而不填充任何材料作为对照,B组为单纯填充纳米人工骨,C组填充纳米人工骨和骨髓间充质干细胞的复合材料.对植入后4、8、12周的股骨头行普通X线片和高分辨聚焦CT检查.结果影像学上观察到B组和C组在股骨头缺损修复成骨方面与对照组有显著差异,C组差异性更大.结论纳米胶原基骨有较强的传导成骨及诱导成骨作用,是修复股骨头骨缺损的良好移植材料,加用骨髓间充质干细胞可促进骨缺损的修复,对股骨头坏死的治疗有较大价值.     

Local transplantation is an effective method for cell delivery in the osteogenesis imperfecta murine model

Purpose

Osteogenesis imperfecta is a serious genetic disorder that results from improper type I collagen production. We aimed to evaluate whether bone marrow stromal cells (BMSC) delivered locally into femurs were able to engraft, differentiate into osteoblasts, and contribute to formation of normal bone matrix in the osteogenesis imperfect murine (oim) model.

Methods

Donor BMSCs from bone-specific reporter mice (Col2.3GFP) were expanded in vitro and transplanted into the femoral intramedullary cavity of oim mice. Engraftment was evaluated after four weeks.

Results

We detected differentiation of donor BMSCs into Col2.3GFP+ osteoblasts and osteocytes in cortical and trabecular bone of transplanted oim femurs. New bone formation was detected by deposition of dynamic label in the proximity to the Col2.3GFP+ osteoblasts, and new bone showed more organized collagen structure and expression of type I α2 collagen. Col2.3GFP cells were not found in the contralateral femur indicating that transplanted osteogenic cells did not disseminate by circulation. No osteogenic engraftment was observed following intravenous transplantation of BMSCs. BMSC cultures derived from transplanted femurs showed numerous Col2.3GFP+ colonies, indicating the presence of donor progenitor cells. Secondary transplantation of cells recovered from recipient femurs and expanded in vitro also showed Col2.3GFP+ osteoblasts and osteocytes confirming the persistence of donor stem/progenitor cells.

Conclusion

We show that BMSCs delivered locally in oim femurs are able to engraft, differentiate into osteoblasts and osteocytes and maintain their progenitor potential in vivo. This suggests that local delivery is a promising approach for introduction of autologous MSC in which mutations have been corrected.     

BMSCs来源成骨细胞和内皮细胞复合壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架构建血管化组织工程骨研究

目的探讨大鼠BMSCs来源的成骨细胞和内皮细胞复合壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架植入大鼠桡骨缺损处的成骨作用和成血管作用。方法取分离培养至第3代的SD大鼠BMSCs行成骨和成内皮细胞诱导并鉴定。分别将内皮细胞(A组)、成骨细胞(B组)、混合细胞(成骨细胞和内皮细胞比例为1∶1,C组)均匀滴加于壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架上制备3组细胞-支架复合物,MTT检测支架内细胞增殖活性。取2月龄雄性SD大鼠30只,制作大鼠桡骨5 mm长缺损模型并分别植入3组细胞-支架复合物(n=10)。术后4、8、12周分别取移植物行HE染色观察,CD34免疫组织化学染色计数微血管密度,RT-PCR法检测骨桥蛋白(osteopontin,OPN)和骨保护素(osteoprotegrin,OPG)mRNA表达。结果 BMSCs成骨诱导7 d后ALP染色可见细胞质内蓝染颗粒,细胞核呈红染;内皮细胞诱导14 d后,CD34免疫细胞化学染色可见细胞内棕色颗粒。MTT检测示3组细胞活性随时间延长逐渐升高。HE染色示,术后12周A组未见明显类骨质形成,而有较密集的微血管结构及较多纤维组织形成;B、C组可见均质的类骨质,呈条索状和岛状分布,可见大量成骨样细胞存在。术后各时间点A、C组微血管密度均显著高于B组(P<0.05);A组术后12周微血管密度高于C组(P<0.05),其余2个时间点A、C组间差异无统计学意义(P>0.05)。A组3个时间点OPN和OPG mRNA表达水平均较低,与B、C组比较差异有统计学意义(P<0.05);B、C组分别于术后8、12周OPN mRNA表达达峰值,4周时OPG mRNA表达达峰值。结论 BMSCs来源的成骨细胞和内皮细胞按1∶1比例共培养于壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架作为组织工程骨移植物,可以促进大鼠桡骨缺损部位骨的形成和血管化,促进骨缺损愈合。     

富血小板血浆联合骨髓间充质干细胞对兔股骨头坏死BMP-2/Smads通路的影响

目的研究富血小板血浆联合骨髓间充质干细胞对兔股骨头坏死BMP-2/Smads通路的影响。方法随机将40只新西兰兔随机分为模型组、富血小板血浆(3%)组、骨髓间充质干细胞(1×106/m L)组、富血小板血浆(3%)+骨髓间充质干细胞(1×106/m L)组。建立兔股骨头坏死模型,术后4w分别向各组股骨头内髓芯减压后注射富血小板血浆、骨髓间充质干细胞。另设空白组10只新西兰兔。空白组与模型组不注射任何物质作为对照。造模后第14周,取材。通过HE染色观察兔股骨头骨髓腔内的病理学及骨陷窝空缺率变化情况。酶联免疫(ELISA)法检测血清中血管内皮生长因子(VEGF)的含量。蛋白免疫印迹(Western blot)法检测股骨头中BMP-2、Smad1、Smad5、Runx2的蛋白水平的变化。结果与模型组相比,各治疗组骨髓腔内骨小梁变粗,脂肪细胞减少,骨细胞增多,骨陷窝空缺率降低(P0.05);各治疗组兔血清VEGF的含量增加,股骨头中BMP-2、Smad1、Smad5、Runx2的蛋白水平提高。结论富血小板血浆与骨髓间充质干细胞可调节BMP-2/Smads信号通路,促进股骨头骨细胞增殖,减少骨陷窝空缺率。     

中药干预骨髓间充质干细胞成骨分化治疗非创伤性股骨头坏死研究进展

非创伤性股骨头坏死（nontraumatic osteonecrosis of the femoral head，NONFH）作为一种骨结构和生物力学的发生改变可导致髋关节功能丧失的一种难治性骨关节病，主要可分为糖皮质激素性和酒精性两大类。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）作为保持骨稳态的主要干细胞，具有分化为成骨细胞、软骨细胞的能力。通过调控BMSCs向成骨细胞、软骨细胞分化对NONFH的进行修复和重建意义重大。中药在中医学“整体观念、辨证论治”理论指导下防治“骨蚀、骨痹”历史悠久、疗效显著。中药通过促进BMSCs向成骨细胞、软骨细胞分化，避免其向脂肪细胞分化，对NONFH的治疗有着重要意义。基于此，该文将中药调控BMSCs分化功能治疗NONFH最新研究进展进行综述，旨为NONFH相关研究的深入及临床防治提供思路和参考。     

Treatment of osteonecrosis of femoral head with BMSCs-seeded bio-derived bone materials combined with rhBMP-2 in rabbits

Objective： To evaluate the effect of autologous bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） seeded bio-derived bone materials （BBM） combined with recombinant human bone morphogenetic protein-2 （rhBMP-2） in repairing defect of osteonecrosis of femoral head （ONFH）.
Methods： Early-stage osteonecrosis in the left hip was induced in 36 adult New Zealand white rabbits （provided by the Animal Center of Guangxi Medical University, Nanning, China） after core decompression and delivery of liquid nitrogen into the femoral head. Then the animals were divided into three groups according to the type of implants for bone repair： 12 rabbits with nothing （Group Ⅰ, the blank control group）, 12 with BBM combined with rhBMP-2 （Group Ⅱ）, and 12 with BMSCs-seeded BBM combined with rhBMP-2 （Group Ⅲ）. At 4, 8, and 12 weeks after surgery, X-ray of the femoral head of every 4 rabbits in each group was taken, and then they were killed and the femoral heads were collected at each time point, respectively. Gross observation was made on the femoral heads. After hematoxylin and eosin staining, Lane-sandhu scores of X-ray and bone densitometry were calculated and the histomorphometric measurements were made for the new bone trabeculae.
Results： At 12 weeks after surgery, two femoral heads collapsed in Group Ⅰ, but none in Group Ⅱ or Group Ⅲ. X-ray examination showed that the femoral heads in Group I had defect shadow or collapsed while those in Group II had a low density and those in Group III presented with a normal density. Histologically, the defects of femoral heads were primarily filled with no new bone but fibrous tissues in Group Ⅰ. In contrast, new bone regeneration and fibrous tissues occurred in Group II and only new bone regeneration occurrd in Group Ⅲ. Lane-sandhu scores of X-ray, bone mineral density and rate of new bone in trabecular area in Group Ⅲ were higher significantly than those of the other two groups. Conclusions： Our findings indicate a superior choice of     

右归饮对激素性股骨头坏死患者股骨近端骨髓骨活性影响的实验研究

目的：观察右归饮含药血清对激素性股骨头坏死患者股骨近端骨髓体外分化为成骨细胞的影响。方法：将右归饮含药血清加入人骨髓间充质细胞诱导分化成骨细胞的培养体系,采用观察细胞学形态、MTT法、细胞内ALP含量及矿化结节形成,并与普通血清组进行比较。结果：与普通血清组相比,形态学观察及MTT法表明,右归饮舍药血清对激素性股骨头坏死患者股骨近端骨髓体外分化成骨细胞的增殖起促进作用（P〈0．01）;矿化结节染色及细胞内ALP含量测定表明右归饮对成骨细胞的活性有促进作用（P〈0．01）。结论：右归饮对激素性股骨头坏死患者股骨近端骨髓间充质干细胞诱导分化的成骨细胞的增殖和活性起促进作用。     

大鼠损伤脊髓内异体骨髓基质干细胞移植后的存活、迁移及分化

目的 观察骨髓基质干细胞(BMSCs)经局部微注射后在成年大鼠脊髓内存活、迁移及向神经细胞分化的情况.方法 成年大鼠脊髓半横断后,损伤部位脊髓内注射经Hoechst标记的异体大鼠BMSCs,存活2个月后损伤部位脊髓切片观察细胞局部存活、迁移情况,同时行甲基受体蛋白-2(MAP-2)及神经胶质酸性蛋白(GFAP)免疫组织化学染色.结果 注射点周围可见密集的Hoechst标记细胞存活,细胞迁移主要沿脊髓纵轴方向并跨过损伤区,迁移距离超过0.5 cm,同时可见少量细胞沿水平方向迁移到注射点周围远隔部位,有少量移植细胞(少于10%)表现为MAP-2或GFAP免疫反应阳性.结论 大鼠脊髓损伤后局部移植BMSCs,移植细胞可在局部良好存活、增殖,并向损伤区迁移,少量移植细胞可向神经细胞方向分化.     

旋髂深血管骨瓣和旋股外血管束联合移植治疗股骨颈骨折

目的 探讨用带血管骨瓣加血管束移植到股骨头人治疗股骨骨折,以提高骨折的愈合率,降低股骨头的坏死率。方法 骨折复位固定后,用旋髂深血管骨瓣移植到骨折处,再用旋股外血管束移植到股骨头内治疗３０例,并与股方肌骨瓣治疗的３０例作对照。结果 股骨头坏死率从２０％下降到１０％,功能优良率从８０％提高到９０％,骨折全部愈合,愈合时间缩短１／４。结论 旋髂深血管骨瓣另旋股因管束联合移植治疗股骨颈骨折,可改善骨折处     

骨形成蛋白增强自体骨修复股骨头骨缺损的研究

目的　对比评价应用骨形成蛋白 (BMP)增强自体骨与单纯自体骨重建股骨头的不同能力。方法　用健康成年杂种犬 9只 ,以环钻钻入股骨头造成股骨头内骨缺损模型。实验犬分为 A、B、C三组。A组为骨缺损模型组 ,B组取自体同侧大转子骨植入 ,C组取自体大转子骨加 BMP植入。术后 3、6和 9周行 X线片、CT、光镜及电镜观察 ,了解股骨头骨缺损的修复情况。结果　 A组术后 3周可见股骨头骨缺损内血肿机化 ,编织骨形成 ,但骨小梁改建慢 ,9周时编织骨小梁仍未被板层骨小梁取代。B组植入的自体骨坏死 ,9周时仍可见到大量的坏死骨 ,坏死骨主要起到成骨支架的作用。C组术后 3周可见股骨头骨缺损内软骨内成骨及膜内成骨活跃 ,9周时骨缺损已完全由致密的新生板层骨修复。结论　应用单纯自体骨修复股骨头骨缺损仅能发挥成骨支架的作用 ,而自体骨加BMP复合移植能在术后早期 (9周 )有效地重建股骨头内结构 ,是修复重建股骨头骨缺损的好方法     

Histological study of effect of bone morphogenetic protein derived from bovine tooth on periosteum in rats

Summary In this study, we examined histologically the effect of a bone morphogenetic protein (BMP) derived from bovine tooth on the periosteum. Supraperiosteal injection of crude BMP into femurs of Wistar rats (28 day old) resulted in periosteal cell proliferation with subsequent bone and cartilage formation. Moreover, proliferating periosteal cells migrated into injected BMP, and formed both cartilage and bone. These observations show that exogenous BMP stimulates mesenchymal cells of the periosteum to proliferate and differentiate into osteoblasts, and therefore BMP may be one of factors which are involved in differentiation of osteoblasts in the periosteum.