富血小板血浆复合骨髓基质细胞修复兔颅骨缺损的实验研究

目的 研究利用富血小板血浆(PRP)复合骨髓基质细胞(BMSCs)修复兔颅骨缺损,评价其作为骨组织工程支架的可行性.方法 经穿刺抽吸兔骨髓,培养BMSCs,离心制备PRP.利用10只新西兰大白兔制作直径5mm、每只兔4个全层颅骨缺损.收集原代培养的BMSCs接种于PRP或全血中.用小牛凝血酶激活接种后的复合物及PRP,而后分别植入颅骨缺损区,余下的骨缺损区作为空白对照.术后8周检查缺损区骨修复并利用X线分析成骨情况.结果 在PRP/BMSCs材料植入8周后,缺损区有大量的新骨生成,而以PRP 修复的缺损区有较少的新骨形成.与此相反,在空白对照组及blood/BMSCs植入的缺损区未见新骨形成.结论 PRP/BMSCs复合物可成功修复兔颅骨缺损,表明PRP 能够作为骨组织工程的支架.     

同种异体间充质干细胞复合纤维蛋白修复骨缺损

[目的]探讨骨髓间充质干细胞(m esenchym al stem cells,MSCs)的体外培养,以及同种异体MSCs复合纤维蛋白修复兔股骨髁松质骨缺损的效果。[方法]在日本大耳兔双侧股骨髁制作0.6 cm×1.0 cm松质骨缺损,左侧植入同种异体MSCs纤维蛋白复合物,右侧单纯植入纤维蛋白。分别于术后2、5、8周行放射学、组织学检查,以了解骨缺损修复情况。[结果]单纯植入纤维蛋白的一侧不能自行愈合。植入复合物的一侧术后2周可见少量骨组织生成,5周可见大量模糊骨痂,术后8周骨缺损基本愈合。除少量炎性细胞浸润外,各期均未见明显免疫排斥反应。[结论]同种异体MSCs复合纤维蛋白可有效修复兔股骨髁松质骨缺损,8周内机体的免疫排斥反应较弱。     

异体脱蛋白松质骨复合纤维蛋白BMP修复兔桡骨缺损

[目的]探讨以纤维蛋白复合脱蛋白松质骨作为骨形态发生蛋白（BMP）的载体修复兔节段性骨缺损。[方法]于36只青紫蓝兔两侧桡骨干处造成1．5cm缺损，采用三种方法进行处理：A组，植入脱蛋白松质骨、纤维蛋白、BMP的复合物；B组，植入脱蛋白松质骨；C组，空白对照。术后2、4、8、12、16周进行放射学、组织学和电镜检查。[结果]A组骨缺损区在成骨活跃程度、骨再生量和再生髓腔结构等方面均显著优于B组，使骨缺损得到了较彻底的修复。B、C两组均不能产生骨性愈合。[结论]脱蛋白松质骨复合纤维蛋白是较理想的BMP载体材料，以三者的复合物修复骨缺损可达到满意效果。     

骨组织工程支架A-W-MGC/CS的体内成骨实验研究

[目的]探讨多孔纳米磷灰石-硅灰石生物活性玻璃陶瓷/壳聚糖复合支架材料(A-W-MGC∕CS)载体承载粘附腺病毒载体的种子细胞体内成骨能力。[方法]培养兔骨髓间充质干细胞(BMSCs),转染Ad-GFPh BMP后接种于载体上,电镜观察贴附情况;MTT检测增殖情况;制备日本大耳白兔桡骨1.5 cm骨缺损模型,分三组。实验组1植入经Ad-GFP-h BMP转染的BMSCs载体;实验组2仅植入载体;空白组不植入任何载体,仅注射经Ad-GFP-h BMP转染的BMSCs。术后12周X线片观察骨缺损修复情况,取出缺损区标本行病理切片观察。[结果]A-W-MGC∕CS载体可较好贴附BMSCs且对细胞增殖无明显影响。实验组1骨缺损修复较好,支架材料完全降解;实验组2新生骨质量较差;空白组未见缺损修复,主要由纤维结缔组织填充。[结论]A-W-MGC∕CS构建的组织工程骨具有较好的骨缺损修复能力。     

旋转生物反应器内微载体扩增骨髓间充质干细胞组织工程法修复兔下颌骨缺损

目的 探索旋转生物反应器内微载体扩增骨髓间充质干细胞(BMSCs)组织工程法及BMSCs与PHB的复合支架修复兔下颌骨缺损的可行性.方法 体外分离纯化BMSCs,在旋转生物反应器内,利用微载体将其在短时间内快速扩增后接种于聚羟基丁酸酯(PHB)支架上,以修复兔的下颌骨缺损区,此为实验A组;以未对缺损区进行修复为对照B组;以单纯PHB修复缺损区为对照C组.分别于修复术后第3、8、14、42、84天处死每组兔2只,对缺损区行组织学检查、骨形态发生蛋白(BMP)免疫组织化学检查、X线摄片.结果 第84天,A组的大部分修复材料被骨性组织取代;B组的缺损区未修复;A组修复骨缺损的效率较C组高.结论 在旋转生物反应器内,应用微载体技术可以成功地进行BMSCs的培养和快速扩增,能满足骨组织工程的需要;PHB可以作为一种组织工程材料修复骨缺损.     

旋转生物反应器内微载体扩增骨髓间充质干细胞组织工程法修复兔下颌骨缺损

目的探索旋转生物反应器内微载体扩增骨髓间充质干细胞(BMSCs)组织工程法及BM-SCs与PHB的复合支架修复兔下颌骨缺损的可行性。方法体外分离纯化BMSCs,在旋转生物反应器内,利用微载体将其在短时间内快速扩增后接种于聚羟基丁酸酯(PHB)支架上,以修复兔的下颌骨缺损区,此为实验A组;以未对缺损区进行修复为对照B组;以单纯PHB修复缺损区为对照C组。分别于修复术后第3、8、14、42、84天处死每组兔2只,对缺损区行组织学检查、骨形态发生蛋白(BMP)免疫组织化学检查、X线摄片。结果第84天,A组的大部分修复材料被骨性组织取代;B组的缺损区未修复;A组修复骨缺损的效率较C组高。结论在旋转生物反应器内,应用微载体技术可以成功地进行BMSCs的培养和快速扩增,能满足骨组织工程的需要;PHB可以作为一种组织工程材料修复骨缺损。     

聚羟基丁酸酯复合骨髓基质细胞构建组织工程骨修复兔下颌骨缺损

目的：探讨以聚羟基丁酸酯（PHB）作为骨组织工程支架的可行性.方法：体外培养兔骨髓基质细胞（BMSCs）,使其向成骨细胞分化后接种于PHB支架上,植入兔下颌角骨缺损中,以单纯缺损、单纯植入材料、植入新鲜骨髓加材料作为对照.4、8、1 2、24周分别处死各组家兔2只,行大体标本、X线摄片、组织学及扫描电镜观察新骨形成情况.结果：实验组24周大部分材料被骨性组织取代,修复骨缺损效率较对照组高.结论：PHB可以作为组织工程材料中的一种来修复骨缺损.     

兔骨髓基质干细胞促进珊瑚骨成骨的实验研究

目的探讨运用组织工程技术合成自体骨移植的替代物的可行性。方法从兔骨髓中分离基质干细胞进行体外培养扩增后，载人明胶海绵或珊瑚骨制成复合物。取24只6～9个月龄雌性新西兰白兔，随机分成四组，每组6只。第1组桡骨干中段15mm的骨缺损内植入明胶海绵，第2组植入明胶海绵＋骨髓基质干细胞（BMSCs），第3组植入珊瑚骨，第4期植入珊瑚骨＋BMSCs，对各组动物进行影像学、p,CT和组织学比较。结果仅植入明胶海绵的骨缺损全部形成典型的骨折不愈合表现；植入明胶海绵＋BMSCs后，骨缺损内的新骨形成明显增多，但仅有1只动物完全愈合；植入珊瑚骨后，骨缺损内有部分新骨形成，但术后16周无一例完全愈合；植入珊瑚骨＋BMSCs后，骨缺损内的载体支架被逐渐吸收的同时有大量的新骨形成，其中4只动物完全愈合。结论由体外分离和培养的BMSCs与珊瑚骨合成的组织工程骨具有可吸收性强、成骨能力好等特点，是一种具有发展前景的自体骨移植材料替代物。     

组织工程骨膜及脱蛋白骨修复兔桡骨大段骨缺损的早期观察

[目的]比较组织工程骨膜及脱蛋白骨对兔桡骨大段骨缺损的早期修复效果,研究组织工程骨膜移植修复大段骨缺损的可行性。[方法]分离兔骨髓间充质干细胞体外诱导增殖,制成细胞悬液接种于猪小肠黏膜下层表面,构建组织工程骨膜。3个月龄新西兰大白兔24只,随机分为3组各8只,手术制备单侧桡骨干30 mm骨膜-骨缺损模型,A组缺损区植入组织工程骨膜骨修复,B、C组则分别以猪小肠黏膜下层和脱蛋白骨作为对比。术后4周,行X线检查并杀取标本予以组织学染色及评分。[结果]经放射学和组织学观察,在A组中缺损区可见大量新骨形成并桥连两缺损端;而在B组和C组中无明显新骨产生。[结论]使用组织工程骨膜修复同种异体兔桡骨大段骨缺损是可行的,且明显优于脱蛋白骨。     

纤维蛋白凝胶和脱钙骨基质支架材料复合软骨细胞修复兔膝关节软骨缺损的实验研究

目的：探讨纤维蛋白凝胶和脱钙骨基质支架材料复合软骨细胞作为软骨组织工程支架的可行性及有效性,并为后续研究可注射性材料做基础。方法：体外分离培养软骨细胞后接种到纤维蛋白凝胶和脱钙骨基质支架材料体外培养4周,然后植入兔膝关节软骨缺损区继续培养4、8、12周后取材,分别行大体、组织学、Ⅱ型胶原免疫组织化学观察。并进行Wakitani评分,观察其体内修复关节缺损效果。结果：大体观察4周后,实验组软骨缺损区可有乳白色组织修复,12周可修复完全,并无明显凹凸感。光镜下8周可见大量软骨细胞修复,并在TB染色下见Ⅱ型胶原比4周时明显增多。12周时软骨陷窝结构形成,细胞形态排列及Ⅱ型胶原与正常软骨组织相近。结论：纤维蛋白凝胶和脱钙骨基质支架材料复合软骨细胞可以作为软骨组织工程支架材料,能够用于再生修复软骨的缺损。并为构建可注射性修复材料提供途径。     

脱蛋白骨复合纤维蛋白胶构建骨组织工程支架的体外实验研究

[目的]探讨复合纤维蛋白胶的脱蛋白骨与单纯脱蛋白骨作为骨髓基质干细胞（MSCs）支架材料的差异，为骨组织工程提供合适的复合支架材料。[方法]实验组使用复合纤维蛋白胶的脱蛋白骨与MSCs复合培养，对照组用单纯脱蛋白骨与MSCs复合培养，取不同时间点进行光学显微镜观察、扫描电镜观察、细胞DNA含量检测及钙结节染色比较两组细胞的情况。[结果]实验组骨髓基质干细胞在黏附能力与分泌情况明显优于对照组，细胞DNA检测表明实验组细胞增殖明显优于对照组（P〈0．05）。[结论]复合纤维蛋白胶的脱蛋白骨比单纯脱蛋白骨更适合细胞生长，可作为MSCs的载体应用于骨组织工程的构建。     

人骨髓基质干细胞体外诱导培养的新方法研究

目的为骨组织工程的临床应用提供一种新的人骨髓基质干细胞(BMSCs)培养方法,以满足细胞培养过程中对各类细胞因子的需求,同时尽量减少细胞培养过程中动物源性抗原物质的引入。方法采用10%富血小板血浆(PRP)替代动物血清配比高糖DMEM培养基,体外诱导培养(50μg/mL抗坏血酸、10-8mol/L地塞米松、10-3mol/Lβ-甘油磷酸钠)人BMSCs,快速扩增后,倒置相差显微镜、扫描电镜观察各组细胞形态及细胞增殖情况。ALP染色与钙结节染色等方法对细胞进行生物学特性检测。结果人BMSCs24h开始贴壁,7d左右细胞融合。诱导培养后细胞能较快地扩增;ALP染色与钙结节染色结果显示细胞具有良好的成骨细胞生物学特性。结论以自体PRP替代动物血清体外诱导培养人BMSCs是一种良好的培养方法,所培养的细胞数量及其生物学特性能快速达到临床应用的需求。     

In vitro osteogenic differentiation and in vivo bone-forming capacity of human isogenic jaw periosteal cells and bone marrow stromal cells

OBJECTIVE: To compare the in vitro osteogenic differentiation and in vivo ectopic bone forming capacity of human bone marrow stromal cells (BMSCs) and jaw periosteal cells (JPCs), and to identify molecular predictors of their osteogenic capacity. SUMMARY BACKGROUND DATA: JPC could be an appealing alternative to BMSC for the engineering of cell-based osteoinductive grafts because of the relatively easy access to tissue with minimal morbidity. However, the extent of osteogenic capacity of JPC has not yet been established or compared with that of BMSC. METHODS: BMSCs and JPCs from the same donors (N = 9), expanded for 2 passages, were cultured for 3 weeks in osteogenic medium either in monolayers (Model I) or within 3-dimensional porous ceramic scaffolds, following embedding in fibrin gel (Model II). Cell-fibrin-ceramic constructs were also implanted ectopically in nude mice for 8 weeks (Model III). Cell differentiation in vitro was assessed biochemically and by real-time RT-PCR. Bone formation in vivo was quantified by computerized histomorphometry. RESULTS: JPCs had lower alkaline phosphatase activity, deposited smaller amounts of calcium (Model I), and expressed lower mRNA levels of bone sialoprotein, osteopontin, and osterix (Models I and II) than BMSCs. JPCs produced ectopic bone tissue at lower frequency and amounts (Model III) than BMSCs. Bone sialoprotein, osteopontin, and osterix mRNA levels by BMSCs or JPCs in Model II were markedly higher than in Model I and significantly more expressed by cells that generated bone tissue in Model III. CONCLUSIONS: Our data indicate that JPCs, although displaying features of osteogenic cells, would not be as reliable as BMSCs for cell-based bone tissue engineering, and suggest that expression of osteoblast-related markers in vitro could be used to predict whether cells would be osteoinductive in vivo.     

经碱性成纤维细胞生长因子修饰骨髓基质干细胞注射式修复全层软骨缺损

目的 探讨经碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)修饰的骨髓基质干细胞(BMSCs)注射式修复全层软骨缺损的可行性.方法 体外培养家兔自体骨髓基质干细胞,并以bFGF处理修饰细胞,免疫组织化学Ⅱ型胶原蛋白表达、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测蛋白聚糖表达.将其与藻酸钙凝胶支架复合注射式植入兔股骨髁全层软骨缺损处,同时设立凝胶支架对照组和空白对照组.术后8周取材观察修复效果,并行苏木素-伊红(HE)、甲苯胺蓝、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色检测;透射电镜观察修复组织的微观结构.结果 BMSCs的细胞群体倍增时间(PDT)为33.8 h,经bFGF处理的BMSCs可检测到Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的表达.至术后8周可见质硬的类白色修复组织完全充填软骨缺损处,组织学检查可见大量软骨样细胞分布于深染的细胞外基质中,检测到Ⅱ型胶原的表达.透射电镜可见丰富的细胞器和胞外基质.凝胶支架对照组和空白对照组仅有部分质软组织充填缺损处,未检测到Ⅱ型胶原的表达.结论 经hFGF修饰的自体骨髓基质干细胞藻酸钙凝胶复合物可用于修复全层软骨缺损.     

可注射型生物蛋白胶包埋骨髓基质细胞工程化组织的体外实验

目的构建可注射型生物蛋白胶包埋骨髓基质细胞的工程化组织,体外培养并研究其生物学特性,探讨将可注射型生物蛋白胶作为组织工程支架用于临床的实验基础。方法体外培养浇铸有骨髓基质细胞的生物蛋白胶,通过倒置相差显微镜、激光共聚焦显微镜观察载体内细胞生长及载体降解情况,5-溴脱氧尿苷(5-Bromodeocyuridine,BrdU)掺入标记后免疫组化等方法研究可注射型载体内包埋细胞的增殖情况。结果骨髓基质细胞包埋于生物蛋白胶内能很好地存活并增殖,2d后细胞呈典型的成纤维细胞形态;6d后生物蛋白胶边缘部分开始降解,细胞脱落至培养板;体外培养14d,细胞生长良好,大部分生物胶降解,脱落的细胞增多,贴壁生长的细胞形态正常;3周后生物蛋白胶完全降解。结论生物蛋白胶聚合后包埋的种子细胞能够正常增殖,生物蛋白胶是一种理想的适用于微创方法修复组织的可注射型组织工程培养和移植的支架。     

大鼠骨髓间充质干细胞复合n-HA/PLA支架异位成骨的实验研究

[目的]研究大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)复合纳米羟基磷灰石/聚乳酸(n-HA/PLA)支架材料体内异位成骨情况.[方法]取SD大鼠股骨胫骨骨髓,进行贴壁培养BMSCs,将第3代BMSCs接种到n-HA/PLA支架材料上,加入成骨诱导液,3d后置人大鼠体内,设为实验组;将单纯支架材料置入组为对照组.4、8、12周时取材进行大体和组织学观察.[结果]8、12周时实验组可见类骨质成分形成,并且支架材料维持置入时形状,对照组无类骨质形成.[结论]BMSCs复合n-HA/PLA构建组织工程骨有很好的异位成骨能力,且能在体内维持良好塑型.     

Healing of an ulnar defect using a proprietary TCP bone graft substitute, JAX, in association with autologous osteogenic cells and growth factors

Currently, available synthetic bone substitutes have adequate osteoconductive properties but have little or no osteoinductivity. Recent research has focused on using osteogenic growth factors or cells to provide this. JAX is a beta tricalcium phosphate bone graft substitute that has a novel shape and interlocking design. This study investigated delivery methods and the use of autologous cell therapy to enhance healing of a bone defect using JAX as a scaffold. Bone marrow was harvested from 24 New Zealand White rabbits. The mononuclear cell fraction was isolated and culture expanded. Bilateral 1.5 cm defects in the ulna were filled with: Group 1: JAX alone, Group 2: JAX plus 1x10(7) autologous BMSCs injected at the time of surgery, Group 3: JAX plus 8x10(6) autologous BMSCs cultured on granules for 14 days prior to surgery, Group 4: JAX plus fresh bone marrow (BMA), Group 5: cortical autograft, Group 6: JAX plus 2.5 microg VEGF. Radiographs demonstrated that there was more new bone in the BMA and VEGF groups compared to JAX alone. Groups containing autologous BMSCs were only slightly better than JAX alone in the amount of bone in the defect but did improve bridging of the osteotomy. Histomorphometry identified a significant increase in bone volume in the BMA group compared to JAX alone. BMA and VEGF enhanced healing of bone defects whereas expanded BMSCs provided little advantage over scaffold alone. There was no difference between delivery methods of autologous BMSCs. These observations suggest that the provision of osteogenic cells alone is insufficient to enhance bone healing and that additional factors are required to initiate this process in vivo.     

Mosaicplasty associated with gene enhanced tissue engineering for the treatment of acute osteochondral defects in a goat model

Objective  To compare single mosaicplasty, mosaicplasty associated with gene enhanced tissue engineering and mosaicplasty associated with the gels of non-gene transduced bone mesenchymal stem cells (BMSCs) in alginate for the treatment of acute osteochondral defects in a goat model. Methods  The principle and methods of tissue engineering were used. BMSCs were separated and amplified in vitro, and human transforming growth factor-β1 (hTGF-β1) gene was transduced to the cells. Then, the cells were suspended in the alginate. At the same time using mosaicplasty to repair the defects on the medial femoral condyle, the dead space between the cylindrical grafts were filled with the gels of hTGF-β1 gene transduced BMSCs in alginate. Single mosaicplasty and mosaicplasty associated with the gels of non-gene transduced BMSCs in alginate were compared by the different time observation. Results  All of the three treatments could repair the acute osteochondral defects. Mosaicplasty associated with gene enhanced tissue engineering had a better integration than single mosaicplasty, and mosaicplasty associated with the gels of non-gene transduced BMSCs in alginate. Conclusion  Mosaicplasty associated with tissue engineering could solve the problem of the poor concrescence of the remnant defect and the integration of single mosaicplasty.