肝细胞癌中microRNA-1469表达及其对肝癌细胞生物学行为的影响

目的探讨microRNA-1469(miR-1469)在肝细胞癌(HCC)中的表达及其对肝癌细胞生物学行为的影响。方法选取2010年1月至2012年12月于西安交通大学第一附属医院手术切除的HCC组织和对应的癌旁组织(距肿瘤边缘> 2 cm)标本各76例,采用实时荧光定量聚合酶链反应检测HCC组织及癌旁组织中miR-1469的表达水平,分析miR-1469表达与HCC临床病理特征的关系,Kaplan-Meier生存曲线分析miR-1469表达与HCC患者3 a总体生存率的关系。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测HCC细胞系Hep G2、Hep3B、SMMC-7721、Huh7、Bel-7402及正常肝细胞系LO2中miR-1469的表达水平;培养Hep3B和SMMC-7721细胞,当细胞融合度达到70%时,分别应用miR-1469mimics和相应的阴性对照脂质体转染Hep3B细胞,应用miR-1469 inhibitors和相应的阴性对照脂质体转染SMMC-7721细胞。转染48 h后,采用实时荧光定量聚合酶链反应检测各组细胞中miR-1469的表达水平,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法和平板克隆形成实验观察miR-1469对Hep3B和SMMC-7721细胞增殖及克隆形成能力的影响,流式细胞术检测miR-1469对Hep3B和SMMC-7721细胞周期的影响,Transwell实验观察miR-1469对Hep3B和SMMC-7721细胞侵袭及迁移能力的影响,Western blot法检测Hep3B和SMMC-7721细胞中NDRG1蛋白表达。结果 miR-1469在HCC组织和癌旁组织中的相对表达量分别为0. 71±0. 03、5. 49±0. 04,HCC组织中miR-1469相对表达量显著低于癌旁组织(P <0. 05)。miR-1469表达与肿瘤直径、肿瘤数目、TNM分期、组织分化程度及微血管侵犯相关(P <0. 05),而与患者的年龄、性别、血清甲胎蛋白水平、静脉侵犯、Edmondson病理分级、肿瘤部位无相关性(P> 0. 05)。KaplanMeier生存分析显示,miR-1469高表达HCC患者的3 a总体生存率显著高于低表达者(P <0. 05)。miR-1469在LO2、Hep G2、Hep3B、SMMC-7721、Huh7、Bel-7402细胞中的相对表达量分别为1. 01±0. 02、0. 45±0. 01、0. 05±0. 01、0. 61±0. 02、0. 14±0. 01、0. 29±0. 02; miR-1469在Hep G2、Hep3B、SMMC-7721、Huh7、Bel-7402细胞中的相对表达量显著低于LO2细胞(P <0. 05);其中Hep3B细胞中miR-1469表达量最低,SMMC-7721细胞中miR-1469表达量最高。miR-1469mimics组和miR-1469 control mimics组Hep3B细胞中miR-1469相对表达量分别为4. 47±0. 15、0. 05±0. 01,miR-1469mimics组Hep3B细胞中miR-1469相对表达量显著高于miR-1469 control mimics组(P <0. 05)。miR-1469 inhibitors组和miR-1469 control inhibitors组SMMC-7721细胞中miR-1469相对表达量分别为0. 20±0. 11、1. 00±0. 00,miR-1469inhibitors组SMMC-7721细胞中miR-1469相对表达量显著低于miR-1469 control inhibitors组(P <0. 05)。MTT结果显示,培养24、48、72 h时,miR-1469 mimics组Hep3B细胞增殖能力显著低于miR-1469 control mimics组,miR-1469inhibitors组SMMC-7721细胞增殖能力显著高于miR-1469 control inhibitors组(P <0. 05)。平板克隆实验结果显示,miR-1469 mimics组和miR-1469 control mimics组Hep3B细胞的克隆数分别为17. 00±1. 73、65. 67±2. 33,miR-1469mimics组Hep3B细胞的克隆形成能力显著低于miR-1469 control mimics组(P <0. 05); miR-1469 inhibitors组和miR-1469 control inhibitors组SMMC-7721细胞的克隆数分别为93. 00±2. 08、27. 67±1. 45,miR-1469 inhibitors组SMMC-7721细胞的克隆形成能力显著高于miR-1469 control inhibitors组(P <0. 05)。流式细胞术结果显示,与miR-1469control mimics组比较,miR-1469 mimics组G1期Hep3B细胞显著增多,S期Hep3B细胞显著减少(P <0. 05),但2组G2期细胞比例比较差异无统计学意义(P> 0. 05)。与miR-1469 control inhibitors组比较,miR-1469 inhibitors组G1期SMMC-7721细胞显著减少,S期SMMC-7721细胞显著增多(P <0. 05);但2组G2期SMMC-7721细胞比例比较差异无统计学意义(P> 0. 05)。Transwell实验结果显示,miR-1469 mimics组Hep3B细胞迁移数和侵袭数分别为59. 00±2. 08、29. 00±2. 08,miR-1469 control mimics组Hep3B细胞迁移数和侵袭数分别为35. 00±1. 53、20. 33±1. 45; miR-1469 mimics组Hep3B细胞的迁移和侵袭能力显著高于miR-1469 control mimics组(P <0. 05)。miR-1469 inhibitors组SMMC-7721细胞迁移数和侵袭数分别为26. 00±1. 16、17. 33±0. 88,miR-1469 control inhibitors组SMMC-7721细胞迁移数和侵袭数分别为56. 33±3. 18、44. 67±1. 45; miR-1469 inhibitors组SMMC-7721细胞的迁移和侵袭能力显著低于miR-1469 control inhibitors组(P <0. 05)。Western blot结果显示,miR-1469 mimics组和miR-1469 control mimics组Hep3B细胞中NDRG1蛋白相对表达量分别为0. 23±0. 04、1. 00±0. 00,miR-1469 mimics组Hep3B细胞中NDRG1蛋白相对表达量显著低于miR-1469 control mimics组(P <0. 05); miR-1469 inhibitors组和miR-1469 control inhibitors组SMMC-7721细胞中NDRG1蛋白相对表达量分别为3. 90±0. 17、1. 00±0. 00,miR-1469 inhibitors组SMMC-7721细胞中NDRG1蛋白相对表达量显著高于miR-1469 control inhibitors组(P <0. 05)。结论 MiR-1469在HCC中表达下调,且其表达与肿瘤数目、肿瘤直径、TNM分期、组织分化程度、微血管侵犯及患者预后密切相关; miR-1469可能通过靶向结合NDRG1并抑制其表达而抑制HCC细胞的增殖、周期、侵袭和迁移。     

miR-144通过影响TLR/MyD88通路抑制肝癌SMMC-7721细胞侵袭

目的 探讨miR-144基因过表达对肝癌SMMC-7721细胞侵袭及Toll样受体（TLR）/髓样分化因子88（MyD88）免疫通路的影响。方法 培养人正常肝细胞HL-7702,肝癌细胞系SMMC-7721,采用荧光实时定量PCR法检测两组细胞miR-144基因表达差异,将SMMC-7721细胞分为空白组、miR-144 NC组、miR-144 mimics组,倒置荧光显微镜检测转染效率,qRT-PCR法检测转染后各组miR-144基因表达情况,通过细胞计数试剂盒（CCK8）法各组SMMC-7721细胞存活情况,通过Transwell法检测各组SMMC-7721细胞侵袭情况,应用免疫印迹法检测各组侵袭相关蛋白基质金属蛋白酶2（MMP-2）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）以及TLR/MyD88通路相关蛋白表达情况,观察添加40 μmol/L MyD88抑制剂TJ-M2010-2组对SMMC-7721细胞TLR/MyD88通路相关蛋白表达情况。结果 与正常组相比,SMMC-7721组miR-144基因相对表达量显著降低（P<0.05）;与空白组、miR-144 NC组相比,miR-144 mimics组miR-144基因表达显著升高（P<0.05）;CCK-8实验显示,与对照组、miR-144 NC组相比,miR-144 mimics组转染48、72、96 h后细胞存活率显著降低（P<0.05）;与空白组、miR-144 NC组相比,miR-144 mimics组侵袭细胞数、MMP-2、MMP-9蛋白表达显著降低（P<0.05）;与空白组、miR-144 NC组相比,miR-144 mimics组、TJ-M2010-2组Toll样受体4（TLR4）、MyD88、磷酸化核因子-κB（p-NF-κB）/核因子-κB（NF-κB）蛋白表达显著降低（P<0.05）,miR-144 mimics组与TJ-M2010-2组TLR4、MyD88、p-NF-κB/NF-κB蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）。结论 miR-144过表达可能通过抑制TLR/MyD88通路转导降低SMMC-7721细胞存活、抑制SMMC-7721细胞侵袭。     

miR-196a在肝癌细胞中的表达及其促增殖作用

目的: 探讨miR-196a在肝癌组织的表达水平和对肝癌Hep3B细胞增殖的影响,阐明其促进肝癌细胞增殖的可能机制。方法: 收集20例肝癌组织及对应癌旁组织,培养人正常肝细胞株L02及肝癌细胞株SMMC-7721、HepG2和Hep3B,采用qRT-PCR法检测miR-196a mRNA在肝癌组织和对应癌旁组织及肝癌细胞株中的表达水平。取处于对数生长期人肝癌Hep3B细胞随机分为对照组、miR-196a mimics转染组和miR-196a inhibitors转染组,MTT法检测各组Hep3B细胞增殖活力,qRT-PCR法检测各组Hep3B细胞miR-196a的表达,流式细胞术检测各组Hep3B细胞周期变化,qRT-PCR和Western blotting法检测各组Hep3B细胞miR-196a潜在靶点叉头转录因子(FOXO1)的表达水平。结果: 肝癌组织中miR-196a mRNA表达水平明显高于相应癌旁组织(P<0.05);miR-196a mRNA在人肝癌SMMC-7721、HepG2和Hep3B细胞中的表达水平明显高于人正常肝L02细胞(P<0.05)。与对照组比较,miR-196a mimics转染组Hep3B细胞中miR-196a mRNA表达水平明显升高(P<0.05),而miR-196a inhibitors转染组Hep3B细胞中miR-196a mRNA的表达水平明显降低(P<0.05)。与对照组比较,miR-196a mimics转染组Hep3B细胞增殖率明显升高(P<0.05), miR-196a inhibitors转染组Hep3B细胞增殖率明显降低(P<0.05),且呈时间依赖性。与对照组比较,转染24 h时,miR-196a inhibitors转染组Hep3B细胞G₀/G₁期细胞百分率明显升高(P<0.05),S期细胞百分率明显降低(P<0.05)。与对照组比较, miR-196a mimics转染组FOXO1 mRNA和蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。结论: miR-196a可能通过FOXO1促进肝癌细胞的增殖,提示miR-196a可能成为肝癌诊断和治疗的新靶点。     

MiR-92a-3p靶向KLF4促进肝细胞癌恶性进程

目的:探究微小RNA-92a-3p(miR-92a-3p)对肝细胞癌(HCC)的影响及其分子机制。方法:qRT-PCR检测人肝细胞癌细胞系SMMC-7721、Bel-7402、HepG2、Hep3B和人正常肝细胞系HL-7702中miR-92a-3p和Krüppel样因子4(KLF4)的表达。将SMMC-7721、Bel-7402细胞分组为Inhibitor NC组、miR-92a-3p Inhibitor组、mimic NC组、miR-92a-3p mimic组、mimic NC+oe-NC组、mimic NC+oe-KLF4组、miR-92a-3p mimic+oe-NC组、miR-92a-3p mimic+oe-KLF4组。qRT-PCR检测细胞中miR-92a-3p和KLF4的mRNA表达水平。Western blot检测KLF4蛋白表达水平。MTT增殖实验检测细胞活力。划痕愈合、Transwell侵袭实验分别检测细胞迁移能力和侵袭能力。通过TargetScan分析miR-92a-3p与KLF4的靶向关系,并通过双荧光素酶实验验证。结果:相比于正常细胞,miR-92a-3p在H...     

miR-148b-3p通过调节脂代谢基因对肝癌细胞恶性生物学行为的影响

目的 探讨miR-148b-3p通过调节脂代谢基因对肝癌细胞增殖、转移及侵袭能力等恶性生物学行为的影响。方法 通过癌症和肿瘤基因图谱(TCGA)数据库寻找miR-148b-3p、肝癌及脂代谢三者的交集基因,筛选miR-148b-3p治疗肝癌的潜在靶点基因;采用荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测miR-148b-3p在正常肝脏细胞LO2和肝癌细胞Huh7、Hep1中的表达水平,选取miR-148b-3p表达量最低的细胞Huh7作为研究对象;Huh7肝癌细胞分为对照组(转染miR-148b-3p NC)和实验组(转染miR-148b-3p mimics),CCK8实验和克隆形成实验、划痕实验、Transwell实验、以及油红O染色分别检测两组肝癌细胞的增值、迁移、侵袭能力及脂滴形成情况,采用RT-PCR和Western blot检测交集基因及脂肪生成指标基因FASN、PPAR-γ及SCD1的mRNA和蛋白表达水平。结果 miR-148b-3p在Huh7细胞中mRNA相对表达量显著低于Hep1细胞(P<0.01)和LO2细胞(P<0.001);与对照组相比,实验组H...     

miR-1-3p抑制肝癌细胞SMMC-7721增殖、迁移并诱导其凋亡

目的 探讨在肝癌细胞SMMC-7721中微小RNA(miR)-1-3 p的表达变化对其增殖、迁移和凋亡的影响及miR-1-3p的作用机制.方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-1-3p和CAAP1的相对表达量;SMMC-7721细胞按miR-1-3p过表达载体(miR-1-3p组)、pcDNA3组、miR-1-3p inhib-itor组和NC inhibitor组(对照组)分别转染,采用qRT-PCR检测转染效果,CCK-8实验检测细胞增殖能力,克隆形成实验观察并比较组间克隆形成率,流式细胞术和Western blot检测细胞凋亡及CAAP1蛋白表达,划痕和Transwell实验观察SMMC-7721迁移和侵袭.利用miRDB、TargetScan、miRanda数据库预测miR-1-3 p靶基因,双荧光素酶报告验证miR-1-3和CAAP1靶向性.结果 miR-1-3p在SMMC-7721细胞中的表达明显低于正常肝细胞LO2,差异有统计学意义(P<0.05);miR-1-3p上调,SMMC-7721增殖、迁移和侵袭能力显著下降,凋亡显著增强,而下调miR-1-3p的表达则作用相反;miR-1-3p和CAAP1具有靶向性;miR-1-3p过表达明显抑制CAAP1表达.结论 miR-1-3p上调可能通过与CAAP1的3'-UTR结合抑制SMMC-7721细胞增殖、侵袭、迁移.     

MicroRNA-124对喉鳞状细胞癌细胞自噬、侵袭和迁移的影响

目的探讨microRNA-124(miR-124)在人喉鳞状细胞癌(LSCC)组织中的表达及其对LSCC细胞自噬、侵袭和迁移的影响。方法选取2016年1月至2018年9月新乡医学院第一附属医院手术切除的LSCC组织及癌旁组织(距离肿瘤边缘1～2 cm)标本各12例,采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测LSCC组织和癌旁组织中miR-124表达;体外培养人Hep-2细胞,将其分为miR-124类似物(miR-124 mimics)组、miR-124抑制剂(miR-124inhibitor)组、类似物阴性对照(mimics NC)组、抑制剂阴性对照(inhibitor NC)组、mimics+西罗莫司组和inhibitor+3-甲基腺嘌呤(3-MA)组,进行细胞转染;采用qRT-PCR检测miR-124 mimics组、miR-124 inhibitor组、mimics NC组、inhibitor NC组细胞中miR-124的表达水平,Western blot法检测LSCC组织、癌旁组织和mimics NC组、miR-124 mimics组、inhibitor NC组、miR-124 inhibitor组细胞中自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ的表达,Transwell小室法检测miR-124 mimics组、miR-124 inhibitor组、mimics NC组、inhibitor NC组、mimics+西罗莫司组和inhibitor+3-MA组细胞的侵袭能力,细胞划痕实验检测miR-124 mimics组、miR-124 inhibitor组、mimics NC组、inhibitor NC组、mimics+西罗莫司组和inhibitor+3-MA组细胞的迁移能力。结果 LSCC组织中miR-124相对表达量显著低于癌旁组织(P <0. 05)。LSCC组织中LC3B-Ⅱ蛋白表达显著高于癌旁组织(P <0. 05)。miR-124 mimics组细胞中miR-124相对表达量显著高于mimics NC组(P <0. 05),miR-124 inhibitor组细胞中miR-124相对表达量显著低于inhibitor NC组(P <0. 05)。miR-124 mimics组细胞LC3B-Ⅱ蛋白相对表达量显著低于mimics NC组(P <0. 05),miR-124 inhibitor组细胞LC3B-Ⅱ蛋白相对表达量显著高于inhibitor NC组(P <0. 05)。miR-124 mimics组侵袭细胞数显著少于mimics NC组和mimics+西罗莫司组(P <0. 05),miR-124 inhibitor组侵袭细胞数显著多于inhibitor NC组和inhibitor+3-MA组(P <0. 05)。划痕培养72 h后,inhibitor NC组和inhibitor+3-MA组细胞的划痕愈合率低于miR-124 inhibitor组(P <0. 05);培养96 h后,mimics NC组和mimics+西罗莫司组细胞的划痕愈合率高于miR-124 mimics组(P <0. 05)。结论人LSCC组织中miR-124表达显著下调,人LSCC组织和miR-124过表达细胞中自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ表达显著上调,miR-124可能通过抑制自噬而抑制LSCC细胞的侵袭和迁移能力。     

MicroRNA-152在胃癌细胞中表达及对细胞增殖的影响

目的探讨microRNA-152(miR-152)在胃癌细胞中的表达情况以及对胃癌细胞增殖的影响及其可能的机制。方法采用实时荧光定量PCR(real-timePCR)方法检测胃癌细胞系MGC-803、SGC-7901、BGC-823和胃上皮细胞GES-1(作为对照)中miR-152的表达情况。采用脂质体法,转染miR-152模拟物(miR-152mimics)构建miR-152过表达体系,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测miR-152对MGC-803胃癌细胞系增殖能力的影响,Westernblot检测转染miR-152mimics后E2F3蛋白的表达情况。结果 MGC-803、SGC-7901、BGC-823胃癌细胞系中miR-152的相对表达量分别为(0.05±0.01)、(0.19±0.03)、(0.48±0.09),表明在胃癌细胞中miR-152的表达明显下调(P<0.05)。MTT法检测结果显示,转染miR-152mimics后可明显抑制MGC-803胃癌细胞的增殖(P<0.05)。Westernblot结果表明,转染miR-152后,E2F3蛋白水平显著下降。结论 miR-152在胃癌细胞中明显低表达,并可能通过下调癌基因E2F3的表达,抑制肿瘤细胞的增殖,从而发挥抑癌基因的功能。     

miR-1246在肝癌血清中的表达及对肝癌HepG2细胞生物学功能的影响

  目的  探讨miR-1246在肝癌患者血清中的表达及其对HepG2细胞生物学功能的影响。  方法  应用荧光定量PCR检测miR-1246在正常对照者和肝癌患者血清中的表达;将miR-1246 mimics和NC mimics分别转染至HepG2细胞,采用Transwell小室法、划痕实验和细胞克隆形成实验检测miR-1246对HepG2细胞生物学功能的影响,荧光定量PCR检测NFE2L3、Vimentin、GAS1基因的表达改变。  结果  miR-1246在正常对照者和肝癌患者血清中的表达量分别为1.079(0.740,1.534)、0.132(0.068,0.324),差异有统计学意义(P < 0.001);miR-1246 mimics转染HepG2细胞后,HepG2细胞穿过基质胶的细胞数为128.000±9.900, 较NC mimics组(251.500±24.749)明显减少(P=0.023),划痕48 h后HepG2细胞相对迁移率为(24.833±3.351)%,较NC mimics组(31.859±7.194)%明显减慢(P=0.046),Vimentin、GAS1、NFE2L3基因相对表达量分别为0.318±0.213、0.479±0.157、0.755±0.044,较NC mimics组(1.000±0.000)表达均明显下调(P=0.046、0.043、0.030)。  结论  肝癌患者血清中miR-1246表达下调;miR-1246可能通过下调Vimentin、GAS1、NFE2L3基因抑制HepG2细胞的侵袭、迁移能力。      

miR-143-5p靶向AGR2在肝癌细胞增殖和凋亡中的作用

目的 探讨miR-143-5p在肝癌细胞增殖和凋亡中的作用及其机制。方法 qRT-PCR检测正常肝细胞HL-7702和肝癌细胞(BEL-7402、HepG2、SMMC-7721、MHCC-97H和Hep3B)中的miR-143-5p表达。选取肝癌细胞BEL-7402和HepG2,将每株肝癌细胞分别分为：mimics-NC组(转染阴性对照mimics-NC)和miR-143-5p mimics组(转染miR-143-5p mimics)。采用MTT法、克隆形成实验、流式细胞术和Western blot分别检测mimics-NC组和miR-143-5p mimics组细胞增殖能力、克隆形成能力、凋亡率和凋亡相关基因(Bax、Caspase-3和Bcl-2)的表达。通过靶基因预测网站RNA22预测miR-143-5p的靶基因。双荧光素酶报告基因验证miR-143-5p和靶基因前梯度蛋白2(AGR2)关系。qRT-PCR和Western blot检测mimics-NC组和miR-143-5p mimics组肝癌细胞BEL-7402和HepG2中AGR2的表达水平。再将肝癌细胞BEL-7402和...     

miR-143通过负向调控Bcl-2抑制食管癌细胞的增殖

目的探讨miR-143通过负向调控B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)抑制食管癌细胞的增殖。方法 RTPCR法检测食管癌细胞TE-1、EC109、EC9706、KYSE150、KYSE510、SEG-1及人正常食管上皮细胞HEEC中miR-143表达,使用脂质体Lipofectamine~(TM) 2000将miR-143 mimics和miR-143 NC转入EC9706细胞中,48 h后,RT-PCR法检测miR-143表达,CCK-8法检测细胞活力,Ed U染色检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞周期,RT-PCR及Western blot检测Bcl-2蛋白及mRNA的表达。结果 miR-143在食管癌细胞TE-1,EC109,EC9706,KYSE150,KYSE510及SEG-1中的表达量[(1.36±0.13),(1.08±0.10),(0.89±0.09),(0.95±0.09),(1.32±0.14),(0.96±0.11)]显著低于miR-143在人正常食管上皮细胞HEEC(2.38±0.15)中的表达量(P0.01)。与miR-143 NC组比较,miR-143 mimics组miR-143表达量显著升高(P0.01),细胞活力下降(P0.01),细胞增殖能力降低(P0.01),细胞周期阻滞在G1期(P0.01),同时Bcl-2蛋白及mRNA表达量显著降低(P0.01)。结论miR-143过表达能通过下调Bcl-2表达抑制EC9706细胞增殖。     

microRNA-10b及靶基因HOXD10在肝癌细胞中的表达及侵袭能力的影响

目的  探讨microRNA-10b（miR-10b）及其靶基因同源异性盒基因HOXD10在肝癌细胞中的表达及转染miR-10b对肝癌细胞侵袭性能力的影响。方法  分析HOXD10基因在3种肝癌细胞株Huh7、HepG2、SMMC-7721中的基础表达量,筛选出HOXD10基础表达量高的HepG2作为后续研究对象。设计合成外源性miR-10b序列,用脂质体瞬时转染肝癌细胞株,设置miR-10b转染组、无关序列转染组（阴性对照组）和未处理组（对照组）。用RT-PCR及Western blot检测肝癌细胞转染miR-10b后HOXD10基因及蛋白表达量的变化,细胞侵袭实验研究转染miR-10b对肝癌细胞侵袭能力。结果  在基因水平和Western blot分析蛋白水平HOXD10基因表达量2-ΔΔCT分别是（1.24±0.23）、（1.00±0.02）,P >0.05差异无统计学意义。在蛋白分析HepG2细胞灰度计算值是值分别是653.492和1 968.742,蛋白水平表达降低。HOXD10基因在肝癌细胞株HepG2的表达量显著高于Huh7和SMMC-7721;miR-10b成功转染HepG2后,HOXD10基因表达水平与对照组比较无明显变化,但HOXD10蛋白表达量与对照组比较下降及侵袭性也增强。结论  miR-10b可能通过抑制靶基因HOXD10表达发挥作用,促进肝癌细胞的侵袭。

     

MiR-194对恶性黑色素瘤细胞增殖和凋亡的影响及机制

目的研究miR-194对人恶性黑色素瘤细胞的增殖和凋亡的影响及机制。方法应用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）分别检测miR-194在原代正常人皮肤黑色素细胞系PIG1 和5种恶性黑色素瘤细胞系（A375、SK-MEL-1、SK-MEL-2、SK-MEL-5及SK-MEL-28）中的相对表达量。利用Lipofectamine TM 2000分别将A375 细胞系转染miR-194 mimics 和阴性对照质粒,从而将A375 细胞系分为miR-194 模拟物组和阴性对照组;应用MTT法和流式细胞术分别测定miR-194 模拟物组和阴性对照组细胞的增殖能力及凋亡率,蛋白印迹（Western blot）分别检测miR-194 模拟物组和阴性对照组的细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、裂解型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Cleaved Caspase-3）蛋白表达情况。结果miR-194 在5 种黑色素瘤细胞系A375、SKMEL-1、SK-MEL-2、SK-MEL-5及SK-MEL-28中的表达水平低于正常人皮肤黑色素细胞系PIG1,依次分别是正常细胞系的（0.18±0.03）、（0.25±0.05）、（0.37±0.03）、（0.39±0.04）及（0.45±0.03）倍（均p<0.05）。转染后第0、1、2、3、4 及5 天,miR-194 模拟物组vs阴性对照组的OD 值分别为：（0.18±0.02）vs（0.19±0.03）（p >0.05）、（0.29±0.02）vs（0.27±0.03）（p >0.05）、（0.42±0.08）vs（0.45±0.07）（p >0.05）、（0.63±0.09）vs（1.17±0.12）（p <0.05）、（1.05±0.15）vs（2.15±0.21）（p <0.05）及（1.87±0.23）vs（3.18±0.27）（p <0.05）。miR-194 模拟物组和阴性对照组的细胞凋亡率分别为24.2%和9.3%（p <0.05）。Cyclin D1 和Cleaved Caspase-3 蛋白在miR-194模拟物组中的表达量分别是阴性对照组的（0.36±0.04）和（3.2±0.28）倍（均p<0.05）。结论miR-194 在黑色素瘤细胞中低表达,miR-194表达上调可促进黑色素瘤细胞凋亡并抑制黑色素瘤细胞的增殖,其机制可能为下调Cyclin D1 蛋白及上调Cleaved Caspase-3 蛋白表达。     

端粒酶逆转录酶线粒体转位促进肝癌细胞干性及耐药的研究

目的 探讨人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse enzyme,hTERT)线粒体转位对肝癌细胞干性及耐药的影响.方法 采用大剂量顺铂(CDDP)冲击、间歇诱导的方法诱导肝癌细胞HepG2、Huh7耐药,构建耐药细胞株HepG2/CDDP、Huh7/CDDP,CCK-8检测细胞耐药能力;Western blot检测细胞线粒体hTERT表达情况;激光共聚焦显微镜观察细胞线粒体膜电位;流式细胞术检测耐药细胞干性相关蛋白CD133、EpCAM表达情况;克隆形成实验检测细胞克隆形成能力;Western blot检测耐药细胞干性相关因子OCT-4蛋白表达水平变化.结果 与亲本细胞HepG2[耐药指数(7.69±0.86)μg/mL及Huh7 (7.18±0.35) μg/mL]相比,耐药细胞株对CDDP耐药指数明显增加[HepG2 (41.16±0.42) μg/mL,Huh7 (33.48±0.33)μg/mL,P＜0.01],经顺铂(CDDP)诱导耐药细胞线粒体hTERT表达显著升高,线粒体膜电位增强,CD133+细胞比例[HepG2 (1.44±0.41),HepG2/CDDP (23.15±1.55),P＜0.01]及EpCAM+细胞比例[HepG2 (0.85 ±0.10),HepG2/CDDP (3.96 ±0.10),P＜0.01]增加,克隆形成能力增强,干性相关因子OCT4蛋白表达水平增加.结论 经顺铂诱导的肝癌耐药细胞线粒体hTERT转位显著增加,且具有明显的肿瘤干细胞特征.     

microRNA-616在肝细胞癌侵袭转移中的作用机制研究

目的探讨microRNA-616（miR-616）在肝细胞癌（HCC）中的表达及其在HCC侵袭转移中的作用机制。方法通过qRT-PCR检测miR-616在60例HCC及癌旁组织中的表达,同时检测miR-616在不同肝癌细胞系中的表达情况;免疫组织化学染色检测miR-616在HCC及癌旁组织中波形蛋白（vimentin）、上皮型钙黏素（E-cadherin）及同源性磷酸酶-张力蛋白（PTEN）的表达情况;qRT-PCR检测miR-616在人正常永生化肝细胞（LO2）及5种不同肝癌细胞系（HepG2、SMMC-7721、Hep3B、Hu7）中的表达水平;使用miR-616抑制物作用Hep3B细胞,TranswellTM实验检测miR-616抑制后Hep3B细胞侵袭能力变化;应用miR-616抑制物及PTENsiRNA转染Hep3B细胞,qRT-PCR检测Hep3B中miR-616、vimentin、PTEN、E-cadherin的mRNA水平,Westernblot法检测癌细胞中vimentin、PTEN、E-cadherin的蛋白水平。结果miR-616在HCC组织中表达水平高于对应癌旁组织;miR-616在不同肝癌细胞系中表达均高于LO2细胞;miR-616高表达与低表达在血管侵犯、Edmonson-Steiner分级、TNM分期比较差异均有统计学意义(均P＜0.05);miR-616高表达肝癌组PTEN及E-cadherin水平低于miR-616低表达肝癌组,而vimentin水平高于miR-616低表达肝癌组,相关性分析结果显示HCC组织中miR-616与E-cadherin、PTEN水平呈负相关,与vimentin水平呈正相关;在肝癌细胞中抑制miR-616后PTEN及E-cadherin表达水平上调,而vimentin表达降低,Hep3B细胞的侵袭能力明显降低。结论miR-616在HCC组织中表达上调,其表达与HCC恶性临床病理特征有关,miR-616促进肝癌细胞侵袭转移的作用可能与其抑制PTEN表达及诱导上皮间质转化有关。     

miR-19a在鼻咽癌细胞上皮间质转化中的作用

目的 研究微小RNA-19a(miR-19a)在鼻咽癌细胞中的表达以及对体外鼻咽癌细胞上皮间质转化(EMT)的作用.方法 利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测miR-19a在鼻咽癌细胞株CNE2、SUNE-1、HNE1、58F及人正常鼻咽上皮细胞株NP69中的转录水平;使用miR-19a模拟物(miR-19a...     

miR-181b-5p对卡波西肉瘤细胞系SLK细胞迁移、侵袭的影响

目的 通过脂质转染miR-181b-5p模拟物及抑制物到卡波西肉瘤细胞系SLK,研究miR-181b-5p对卡波西肉瘤细胞SLK细胞增殖、迁移、侵袭生物学功能的影响。方法 应用脂质体对人卡波西肉瘤细胞株SLK进行转染,转染miR-181b-5p模拟物及抑制物后应用MTT测定细胞增殖曲线,应用流式细胞仪行检测细胞周期。利用Transwell小室试验后行苏木素染色观察细胞迁移、细胞侵袭生物学特性。结果 miR-181b-5p模拟物促进细胞增殖,促进S期的转变,加速细胞周期进程;miR-181b-5p抑制物抑制细胞增殖,诱导细胞发生G₀/G₁期阻滞,延缓细胞周期进程。Transwell小室迁移实验结果显示,与阴性对照组迁移实验下室面细胞数目151±11个相比,miR-181b-5p模拟物组184±9个,细胞数目明显数量增多,迁移能力均明显提高,差异有统计学意义(P<0.05)。Transwell小室侵袭实验结果显示,与阴性对照组侵袭实验下室面细胞数目35±6个相比,miR-181b-5p模拟物组48±5个,细胞数目明显数量增多,侵袭能力均明显提高(P<0.05)。结论 miR-181b-5p在SLK细胞中高表达,其对SLK细胞的增殖、侵袭和迁移能力可能存在正向调控作用,可能成为卡波西肉瘤的潜在治疗靶点。     

MiR-29b下调肝肿瘤细胞Mcl-1的表达并诱导其发生凋亡

目的:探讨miR-29b(microRNA-29b)的作用靶点及其对肝肿瘤细胞系Huh7的凋亡诱导作用。方法:荧光定量PCR检测正常肝细胞系LO2及肝癌细胞系Huh7的miR-29b和Mcl-1的表达水平。通过生物信息学分析预测Mcl-1基因是否受microRNA调控。将miR-29b模拟物通过Lipofectamine 2000顺时转染Huh7细胞,检测miR-29b对Mcl-1表达水平的影响。MTT法检测miR-29b模拟物转染对Huh7细胞增殖的影响;Annexin V/PI染色法检测miR-29b对Huh7细胞凋亡的影响。结果：肝肿瘤细胞相比于正常肝细胞高表达Mcl-1低表达miR-29b,在肝癌细胞中转染miR-29b可使Mcl-1的表达水平下降,转染miR-29b可抑制Huh7细胞的增殖并诱导其发生凋亡。结论：MiR-29b下调Huh7细胞Mcl-1蛋白的表达并诱导其发生凋亡。     

长链非编码RNA ATB调控miR-144对胶质瘤迁移和侵袭的影响

目的 探讨长链非编码RNA ATB （lncRNA ATB）调控miR-144对胶质瘤迁移和侵袭的影响。方法 采用qPCR检测lncRNA ATB在胶质瘤组织和癌旁正常组织中的表达差异以及慢病毒si-ATB对胶质瘤细胞的转染效率情况;通过双荧光素酶报告基因进行检测lncRNA ATB和miR-144之间的关系;通过平板克隆实验检测lncRNA ATB对胶质瘤细胞株U87和U251增殖能力的影响;流式细胞术检测lncRNA ATB对胶质瘤细胞株凋亡行为的影响;Transwell实验检测lncRNA ATB对细胞株侵袭能力的影响;裸鼠体内实验检测lncRNA ATB对裸鼠移植瘤的体积和质量的影响情况。结果 胶质瘤lncRNA ATB的表达水平高于癌旁正常组织（P<0.05）,高水平lncRNA ATB患者的生存率低于低水平lncRNA ATB患者;使用si-ATB1和si-ATB2分别转染胶质瘤U87和U251细胞后,lncRNA ATB的表达水平降低;过表达miR-144后,野生型lncRNA ATB的荧光素酶活性受到抑制,对突变型lncRNA ATB的荧光素酶活性影响不明显。转染si-ATB 24、48和72小时后,U87[（186.4±12.4）个比（73.6±8.6）个比（62.6±5.6）个,P<0.05]和U251细胞[（192.2±15.3）个比（63.6±6.3）个比（68.3±7.6）个,P<0.05]和U251细胞的增殖能力低于对照组;lncRNA ATB的下调提高了U87和U251凋亡百分比（P<0.05）;抑制lncRNA ATB后,U87细胞和U251细胞的细胞侵袭能力降低;与对照组相比,si-ATB组肿瘤体积和肿瘤重量均小于或低于对照组（P<0.05）。结论 lncRNA ATB通过调控miR-144的表达促进胶质瘤细胞的生物学行为。     

miRNA-381 对胃癌细胞增殖和侵袭的影响及机制

目的 观察miRNA-381 对胃癌细胞增殖和侵袭的影响,并探讨其作用机制。方法 应用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测胃癌细胞系AGS、MGC-803、Hs746T 及BSG823 和正常胃黏膜上皮细胞系RGM-1 中miRNA-381 的表达;将AGS 细胞系分成两组,阴性对照组和miRNA-381 模拟物组,采用Lipofectamine TM 2000 分别转染miRNA-381 scramble 及mimics,采用CCK-8、Transwell 实验测定两组细胞增殖和侵袭的影响,Western blot 检测两组细胞肝受体类似物1（LRH-1）和扭曲相关蛋白1（Twist1）表达水平。结果 胃癌细胞系AGS、MGC-803、Hs746T 及BSG823 中miRNA-381 相对表达量较正常胃黏膜上皮细胞系RGM-1 为低。miRNA-381 模拟物组在转染后72 和96 h OD 450 nm 值低于阴性对照组（P <0.05）;阴性对照组侵袭细胞数为（79.6±7.2）个,miRNA-381 模拟物组侵袭细胞数为（31.70±4.2）个,miRNA-381 模拟物组侵袭细胞数少于阴性对照组（P <0.01）;miRNA-381 模拟物组LRH-1 蛋白相对表达量为（0.39±0.04）,阴性对照组为1.0,miRNA-381 模拟物组LRH-1 蛋白相对表达量低于阴性对照组（P <0.01）;miRNA-381 模拟物组Twist1蛋白相对表达量为（0.51±0.05）,阴性对照组为1.0,miRNA-381 模拟物组Twist 1 蛋白相对表达量低于阴性对照组（P <0.01）。结论 miRNA-381 低表达于胃癌细胞系,miRNA-381 过表达可抑制胃癌细胞增殖和侵袭能力,其机制可能与下调LRH-1 和Twist1 的表达有关。