p62Dok PTB结构域融合蛋白的表达和纯化

目的：制备p62DokPTB结构域的GST融合蛋白。方法：用PCR方法扩增编码p62Dok PTB结构域的cDNA,并将其克隆入表达载体pGEX-4T-3中,转化大肠杆菌BL－21,构建成表达GST－PTB融合蛋白的菌株。经IPTG诱导表达后,经Glutathion-Sepharose 4B亲和层析柱纯化,用SDS－PAGE进行分析,该融合蛋白的表达量超过菌体总蛋白的25％。结果：获得重组GST－PTB融合蛋白,纯度在95％以上,产物得率约75％。结论：成功制备高纯度p62DokPTB结构域的GST融合蛋白,为进一步研究p62DokPTB结构域的结构和生物学功能奠定了基础。     

p62Dok PTB结构域融合蛋白的表达和纯化

目的 :制备p6 2DokPTB结构域的GST融合蛋白。方法 :用PCR方法扩增编码p6 2DokPTB结构域的cD NA ,并将其克隆入表达载体pGEX 4T 3中 ,转化大肠杆菌BL 2 1,构建成表达GST PTB融合蛋白的菌株。经IPTG诱导表达后 ,经Glutathion Sepharose 4B亲和层析柱纯化 ,用SDS PAGE进行分析 ,该融合蛋白的表达量超过菌体总蛋白的 2 5 %。结果 :获得重组GST PTB融合蛋白 ,纯度在 95 %以上 ,产物得率约 75 %。结论 :成功制备高纯度p6 2DokPTB结构域的GST融合蛋白 ,为进一步研究p6 2DokPTB结构域的结构和生物学功能奠定了基础。     

Doks PTB结构域与EGFR特异性结合

目的:探讨Doks家族的PTB结构域在识别上游分子时的特异性.方法:利用裂解大量内源性表达表皮生长因子受体(EGFR)的COS-7传代细胞株获取EGFR,利用大肠杆菌表达GST融合蛋白GST1PTB、GST4PTB和GST5PTB,采用GST共沉淀技术检测Dok1、4和5的PTB结构域能否与EGFR结合.结果:Dok1的PTB结构域,而非Dok4和Dok5的PTB结构域,能够特异性地与被激活的EGFR结合,不能与未激活的EGFR结合.结论:Doks家族的PTB结构域功能有差别,即PTB结构域在识别上游分子时具有特异性.     

表皮生长因子受体与Dok1 PTB结构域结合关键位点的确定

目的:确定表皮生长因子受体(EGFR)与Dok1 PTB结构域结合的关键氨基酸残基位点.方法:合成包含磷酸化的酪氨酸残基的EGFR胞内域的5个小肽片段,利用谷胱苷肽S转移酶共沉淀技术确定能够抑制Dok1 PTB结构域与激活的EGFR结合的小肽.结果:pY1086或pY1148小肽能抑制激活的EGFR与Dok1 PTB结构域的结合.结论:pY1086和pY1148是激活的EGFR与Dok1 PTB结构域结合的关键位点.     

Dok6促进神经营养因子3诱导的过表达原肌球蛋白相关激酶C的PC12细胞突起生长

目的 探讨胞浆接头蛋白Dok6对PC12细胞突起生长的影响.方法 将Dok6的不同功能模体片段构建至TrkC/Y516F突变体中形成融合克隆.利用Western blot法验证各个融合克隆在细胞内是否稳定表达.利用瞬时转染的方法将融合克隆导入PC12细胞进行过表达,之后用NT-3刺激PC12细胞突起生长,检测不同Dok6片段的效应.结果 各个融合克隆均能在细胞内稳定表达.融合了Dok6 PTB结构域+C末端以及单纯C末端的融合克隆均可以挽救由于TrkC受体516位酪氨酸突变导致的PC12细胞突起生长减少,而融合单纯的Dok6 PTB结构域则无此效应.结论 Dok6可以促进NT-3诱导的过表达TrkC的PC12细胞突起生长,并且此效应与其C末端密切相关.     

Dok1与TrkA之间相互作用的酵母双杂交研究

目的:研究downstream of kinases1(dok1)与TrkA之间的相互作用,寻找TrkA的可能底物或调控蛋白,以深入认识TrkA下游信号转导机制.方法:将TrkA胞内域与LexA蛋白融合作为DNA结合蛋白,分别将dok1、dok1PTB及dok1ΔPTB与B42AD蛋白融合作为激活域蛋白,共转化酵母菌后,通过β-半乳糖苷酶活性检测以及氨基酸营养缺陷生长实验分析它们之间的相互作用.结果:dok1及dok1PTB与TrkA之间在酵母中存在结合,而dok1ΔPTB不与TrkA结合.结论:证实TrkA与dok1之间具有相互作用,dok1的PTB结构域在介导此相互作用的过程中非常重要.     

GST融合蛋白制备表皮生长因子受体抗体

目的：探讨制备大量表皮生长因子受体(EGFR)特异性抗体的方法。方法：将编码EGFR的N端肽段的cDNA克隆入表达载体pGEX-4T-3中,转化大肠杆菌BL-21,经IPTG诱导表达后,经亲和层析柱纯化,用该GST融合蛋白免疫BALB／C小鼠,获得免疫血清,以ELISA和Western Blot检测抗体滴度。结果：获得GST—PTB融合蛋白纯度大于95％;经免疫小鼠抗血清滴度1：38827～1：190602,得到大量高滴度的EGFR特异性抗体。结论：用原核系统表达GST融合蛋白直接免疫小鼠可以快速、大量地制备EGFR特异性抗体。     

Cortactin功能性结构域GST融合蛋白的表达和纯化

目的:制备cortactin功能性结构域(NTA和ABR)GST融合蛋白,用于后续研究NTA和ABR多肽分子对肿瘤细胞的侵袭转移能力的影响。方法:通过从cortactin基因cDNA克隆中扩增获得cortactin功能性结构域(NTA和ABR片段),经双酶切和连接后将其分别插入载体pGEX-4T-2中获得重组质粒。将重组质粒转化入感受态菌,诱导表达,蛋白粗提后纯化。结果:PCR扩增后获得和预期一致的cortactin功能性结构域(NTA和ABR片段),通过测序证实该两片段正确插入表达载体。纯化的蛋白作SDS-PAGE电泳,证实蛋白的完整性和纯度良好。结论:成功地获得cortactin功能性结构域(NTA和ABR)GST融合蛋白。     

p11融合蛋白表达、纯化及抗血清的制备

目的 :表达GST p11和 6xHis p11融合蛋白并制备GST p11特异性抗体。方法 :将人p11基因克隆入两种原核表达载体pGEX 4T 2和pQE30 ,分别在大肠杆菌BL2 1和M15中表达 ,用GlutathioneSepharose 4B和Ni NTAagar ose亲和柱分别纯化目的蛋白。利用纯化的GST p11蛋白制备多克隆抗体。结果 :得到高表达量的融合蛋白 ,经亲和层析柱纯化获得较高纯度的GST p11和 6xHis p11蛋白。以GST p11蛋白免疫新西兰兔得到p11多克隆抗体 ,Westernblotting证实该抗体能够识别 6xHis p11蛋白 ,具有较高特异性。结论 :利用原核表达人p11融合蛋白制备的p11多克隆抗体具有较好的特异性 ,为研究p11蛋白在蛋白转运和定位过程中的作用提供重要的技术和材料保障     

Dok1与表皮生长因子受体之间相互作用的酵母双杂交研究

目的:研究downstream of kinases(dok1)与表皮生长因子受体(EGFR)之间的相互作用,寻找EGFR的可能底物或调控蛋白,以深入认识EGFR下游信号转导机制.方法: 将EGFR胞内域与LexA蛋白融合作为DNA结合蛋白,分别将dok1、dok1PTB及dok1ΔPTB与B42AD蛋白融合作为激活域蛋白,共转化酵母菌后,通过β-半乳糖苷酶活性检测、生长实验以及免疫共沉淀实验分析它们之间的相互作用.结果: dok1及dok1PTB与EGFR之间在酵母中存在结合,而dok1ΔPTB不与EGFR结合. 结论: 首次证实EGFR与dok1之间具有相互作用,dok1的PTB结构域在介导此相互作用的过程中非常重要.     

BCR/ABL-OD结构域重组蛋白的表达和纯化

目的：制备BCR／ABL-0D结构域-HIS的重组蛋白．方法：用RT-PCR方法扩增BCR／ABL-0D结构域的基因片段,测序正确后将其克隆入原核表达载体pET16b中,并进行酶切鉴定,鉴定正确后转化大肠杆菌B121,构建表达His-OD融合蛋白的菌株．经IPTG诱导表达后,镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)琼脂糖进行亲和层析纯化,用SDS-PAGE对该融合蛋白的表达产率及蛋白纯度进行了分析．结果：获得了His-OD重组融合蛋白,纯度在95%以上,产物得率约75％．结论：成功制备高纯度His-OD融合蛋白,为进一步研究OD结构域的生物学功能奠定了基础。     

人晚期糖基化终产物受体胞质内段融合蛋白表达载体的构建与表达

目的 构建人晚期糖基化终产物受体胞质内段(hRAGE-C)GST融合蛋白的重组原核基因表达载体并进行表达与纯化，研究其功能并鉴定与其相互作用的蛋白。方法 采用PCR方法扩增hRAGE基因编码区的胞质内段。并将其重组于pGEX-KG载体中。重组质粒经PCR、酶切、序列鉴定分析后，转化大肠杆菌BL21，以异丙基β-D硫代半乳糖(IPTG)诱导产生hRAGE胞质内段的GST融合蛋白。结果 PCR、酶切和测序结果表明所克隆的GST／hRAGE-C原核表达载体完全正确，继而表达、纯化获得了相对分子质量约35000的融合蛋白(符合预期大小)。结论 将hRAGE胞质内段构建于含有GST标记的载体上并获得融合蛋白的高效表达。     

GST-p16融合蛋白的表达、纯化及鉴定

目的利用GST融合基因表达系统表达、纯化及鉴定GST-p16融合蛋白。方法以质粒pM-p16为模板,扩增出p16基因片段,将其克隆至大肠杆菌表达载体pGEX-6P-1,将所构建的重组质粒pGEX-p16转化大肠杆菌B121并诱导表达,采用GST蛋白纯化系统进行纯化,所得产物进行SDS-PAGE及Westernblot鉴定。结果大肠杆菌细胞经诱导高效表达出约42kD蛋白,其分子量与GST-p16融合蛋白相符。Westernblot结果显示该蛋白能够被p16．抗体特异性识别。结论本实验在大肠杆菌表达系统中高效表达了有活性的GSTipl6融合蛋白并可用于以后的实验研究。     

表皮生长因子受体胞外区的原核表达和鉴定

目的 克隆表皮生长因子受体(EGFR)胞外区段基因序列(EGFR ECD),构建重组融合表达载体.方法 采用常规PCR方法 扩增EGFR的胞外区DNA序列,并将扩增产物克隆入GST融合表达载体pGEX-4T-1中,构建重组质粒pGEX-4T-1/EGFRECD,转化BL21(DE3)宿主菌;采用Sal Ⅰ和Not Ⅰ双酶切和序列分析鉴定插入序列的正确性:并用IPTG诱导工程菌,SDS-PAGE及Western blotting分析融合蛋白的表达.结果 双酶切鉴定表明,EGFR胞外区序列已经正确克隆到GST融合表达载体中,测序结果证实插入DNA序列与EGFR胞外区序列完全一致.SDS-PAGE电泳显示,融合蛋白在BL21(DE3)中以包涵体形式表达,重组融合蛋白GST-EGFRECD的表达量占菌体总蛋白的12%左右.经Western blotting分析证实,重组融合蛋白可以被EGFR特异性抗体所识别.结论 本试验成功克隆了EGFR胞外区DNA序列,构建了融合表达载体,并进行了融合蛋白的诱导表达和鉴定,可进一步用于EGFR功能及免疫学研究.     

人表皮生长因子受体Ⅲ型突变体胞外区的克隆表达和鉴定

目的 构建含表皮生长因子(EGF)受体Ⅲ型突变体胞外区基因(vⅢECD)的重组质粒并进行表达和鉴定.方法 应用PCR方法扩增EGFRvⅢECD片段,将其T-A克隆和测序.再将目的基因插入GST融合表达载体pGEX-4T-1中进行表达.采用双酶切鉴定插入序列的正确性,用SDS-PAGE及Western blotting分析融合蛋白的表达.结果 测序结果证实插入DNA序列与EGFR胞外区序列完全一致;双酶切鉴定表明,EGFRvⅢ ECD序列已经正确克隆到GST融合表达载体中.SDS-PAGE电泳显示融合蛋白在E.coli BL21(DE3)中以包涵体形式表达.重组融合蛋白GST-vⅢ ECD的表达量占菌体总蛋白的15%以上.Western blotting分析证实重组融合蛋白可以被EGFR特异性抗体所识别.结论 成功构建了融合表达载体(pGEX-4T-1/vⅢECD),并进行了融合蛋白的诱导表达和鉴定,可进一步用于EGFRvⅢ功能及免疫学研究.     

缺氧状态下丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶1对缺氧诱导因子1α和p300在体外结合的影响

目的探讨丝裂原活化的蛋白激酶磷酸酶1（MKP-1）对缺氧诱导因子1α（HIF-1α）和p300在体外结合的影响。方法采用DNA重组技术构建含HIF-1α反式激活域（TAD）的原核表达载体并进行原核表达;利用谷胱甘肽-琼脂糖珠子纯化原核表达的谷胱甘肽S转移酶（GST）融合蛋白;利用脂质体将含MKP-1的正义真核表达载体和空载体转入SGC7901细胞;借助Pull-down试验和Western印迹检测MKP-1或PD98059对HIF-1d与协同激活因子p300在体外结合的影响;Western印迹检测MKP-1对p300表达的影响。结果（1）成功构建了含HIF-1αTAD的原核表达载体,使含HIF-1αTAD的GST融合蛋白在BL-21大肠杆菌中得到表达。（2）利用谷胱甘肽-琼脂糖珠子纯化得到了含HIF-1αTAD的GST融合蛋白。（3）缺氧12h后,GST融合蛋白HIF-1αTAD从PD98059处理细胞裂解液中洗脱的p300量低于从二甲基亚砜（DMSO）处理细胞和SGC7901细胞裂解液中洗脱的p300。（4）分别将MKP-1正义真核表达载体和pcDNA3．1空载体瞬时转入SGC7901细胞;缺氧12h后,GST融合蛋白从MKP-1正义真核表达载体转染细胞（SGC7901-MKP-1）裂解液中洗脱的p300的量低于从空载体转染细胞（SGC7901-空载体）和未转染细胞（SGC7901）裂解液中洗脱的p300。（5）缺氧12h后,p300的表达量在SGC7901-MKP-1、SGC7901-空载体和SGC79013组细胞中无变化。结论MKP-1抑制HIF-1α和p300在体外结合。