原发老年性痴呆淀粉样β25～35多肽诱导乙酰胆碱能受体缺损的研究

目的探讨活性肽段Aβ25～35是否可以直接改变神经元烟碱型乙酰胆碱受体(nAchRs)亚型的表达及其机制.方法实验于2002/2003在瑞典皇家医学院老年病研究所中心进行.采用配体结合实验以及Western Blot,RPA法,观察在Aβ25～35侵害早期,PC12细胞损伤机制.结果用nmol浓度Aβ25～35能明显降低PC12细胞nAchRs结合位点数量,引起α7等亚单位蛋白和mRNA水平不同程度的下降,Aβ25～35(0.1～100 nmol/L)作用后,[3H]epibatidine结合力平均显著下降37.4%,Aβ25～35(10～100 nmol/L)共同孵育,[125I]α-BTX结合力平均降低为28.2%.α7亚单位随Aβ25～35(1～100 mol/L)呈剂量依赖性递减分别为23.4%,α3亚单位随Aβ25～35(0.1～100 nmol/L)呈剂量依赖性递减分别为42.8%.α7亚单位mRNA水平随Aβ25～35(1～100 nmol/L)呈浓度依赖性下降分别为33.8%.对照组反转肽段Aβ35～25对PC12细胞nAchRs结合位点,α3,α7,β2亚单位的蛋白和mRNA水平无明显影响.nmol浓度Aβ25～35与nAchRs的特异结合力较弱,但明显抑制细胞活性.结论在AD病程早期,Aβ可直接引起nAchRs退行性改变;细胞内在信号传导系统的失衡可能是引起nAchRs生物合成降低的原因之一.     

白细胞介素-1对β淀粉样蛋白胞毒及基因表达的调节作用

目的：研究B淀粉样蛋白(β-amyloid protein，Aβ)的神经元毒性作用及白细胞介素1(interleukin-1β，IL-1β)对神经细胞β淀粉样蛋白前体(β-amyloid precursor protein，APP)基因表达以及对Aβ细胞毒性的调节作用。方法：以PC12细胞作为体外神经细胞模型，应用四唑盐(MTY)法检测Aβ，IL-1β对细胞活性的影响，应用RT-PCR法半定量分析IL-1β对APP基因表达的影响。结果：Aβ具有直接的神经细胞毒作用，与浓度以及聚集状态相关，以20μmol／L孵育3h毒性最大(q=5．62，P&;lt;0．01)，而孵育7d者几乎没有毒性。IL-1β(浓度为20μg／L)与Aβ25-35(浓度为20μmol／L孵育3h)共同作用于细胞时，Aβ25—35的细胞毒作用被扩大，细胞活性从36.7％降到了13．2％(q=3．8，P&;lt;0．05)；当IL-1β(浓度为20μg／L)与Aβ25-35(20μmol／L孵育7d)共同作用时，细胞活性迅速下降，从93％降到了7．7％(q=4．83，P&;lt;0．01)。IL-1β可以刺激PC12细胞APP751、770mRNA表达增加，与对照组相比，20μg／L组APP mRNA表达增加约为2倍(q=4．76，P&;lt;0．01)，此后增加不明显；APP mRNA的表达在IL-1β(20μg／L)刺激6h达高峰，约为对照组的2倍(q=4．92，P&;lt;0.01)。结论：Aβ具有直接细胞毒作用，与浓度以及聚集状态相关。IL-1β可以扩大Aβ的细胞毒性作用。IL-1β可以刺激PC12细胞APP mRNA表达增加，具有剂量及时间依赖性。     

淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞凋亡与奥氮平的保护作用

背景：在阿尔茨海默病中起着重要作用的淀粉样β蛋白能够诱导细胞凋亡。目的：探讨奥氮平对淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞凋亡的机制及其保护作用。单位：解放军总医院南楼神经科。设计：随机设计。材料：实验于2002-05／2003-03在加拿大萨斯卡彻温大学医学院神经精神研究所完成。方法：P12细胞在RPMI1640培养液中培养。在96孔板每孔中接种100μL细胞悬液，在胶原被覆的25cm^2培养瓶中接种5mL细胞悬液，培养24h后，分别加50μmol／L、100μmol／L奥氮平培养24h，再加不同浓度的淀粉样β蛋白25～35（0．01μmol／L．2μmol／L、20μmol／L）培养24h。将收获好的96孔板以淀粉样β蛋白25～35诱导PC12细胞凋亡，采用MTT比色分析测定细胞存活率。收获25cm^2培养瓶中的PC12细胞，应用Western blot检测奥氮平对PC12细胞Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的影响。主要观察指标：细胞存活率的测定，PC12细胞中Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达水平。结果：①细胞存活率比较：淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞的细胞活性从75％降低到35％；50μmol／L、100μmol／L奥氮平预处理组PC12细胞的活性明显提高。②奥氮平对淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞凋亡中Bax表达的影响：0．01μmol／L，2μmol／L,20μmol／L淀粉样β蛋白25～35处理的PC12细胞Bax的表达增加，50μmol／L奥氮平预处理使淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞Bax的表达减低。③奥氮平对Aβ25～35诱导的PC12细胞凋亡中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的影响：0．001μmol／L、0．01μmol／L淀粉样β蛋白处理的PC12无变化，50μmol／L奥氮平预处理对PC12细胞表达亦无影响；2μmol／L、20μmol／L淀粉样β蛋白25～35处理的PC12细胞表达增高，50μmol／L奥氮平预处理能抑制其表达升高。结论：①淀粉样β蛋白25～35能够诱发与细胞凋亡密切相关的Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3在培养的PC12细胞中高表达。②奥氮平具有降低其表达，提高PC12细胞存活的保护作用。     

H2O2对PC12细胞par-4和caspase-3基因表达的影响

目的：探讨H2O2对PC12细胞par-4和caspase-3基因表达的影响，为阿尔茨海默病神经元凋亡发生的机制提供实验依据。方法：用不同剂量H2O2(O-400nmaol／L)处理PC12细胞8h，或终浓度200nmol／L H2O2处理PC12细胞不同时间(0～8h)，采用RT-PCR检测par-4，caspase-3 mRNA表达变化，Western blot检测Par-4蛋白表达和Caspase-3P20活性片段的变化，用比色法检测Caspase-3相对活性。结果：随H2O2浓度从100～400nmol／L增加，par-4,caspase-3 mRNA表达和Par-4蛋白表达水平及Caspase-3 P20活性片段逐渐增加；200nmol／LH2O2作用PC12细胞0～8h，par-4 mRNA表达和Par-4蛋白表达，在2～8h随时间延长表达增加；caspase-3 mRNA表达和Caspase-3 P20活性片段，在4～8h随时间延长而增加；随H2O2浓度从50—400nmol／L增加，Caspase-3相对活性增加(r=4．8，P&;lt;0．05)，在400nmol／LH2O2时Caspase-3相对活性达最大值。结论：随着H2O2剂量依赖性的增加和同一剂量下H2O2处理PC12细胞时间增加par-4，cctspase-3基因mRNA的表达，Par-4蛋白的表达，Gaspase-3 P20活性片段，Caspase-3活性均有所增加。     

多奈哌齐对β淀粉样蛋白诱导PC12细胞损伤的保护作用

目的：研究多奈哌齐对Aβ25-35蛋白诱导的PC12细胞损伤的保护作用。方法：采用细胞培养、MTT法和流式细胞仪技术，以β淀粉样蛋白(amyloid beta protein，Aβ)诱导PC12细胞损伤作为细胞模型，观察不同剂量Aβ25～35蛋白对PC12细胞的影响以及多奈哌齐对PC12损伤的保护作用。结果：PC12细胞对于Aβ25—35造成的损伤和凋亡呈剂量依赖型，凋亡百分率增加(71．3％，90．1％)，细胞增殖活性降低(t=13．89，P&;lt;0．001)；提前给予多奈哌齐保护的PC12细胞凋亡百分率明显降低(52．0％)，细胞增殖活性较前提高(t=12．77，P&;lt;0．001)。结论：多奈哌齐明显减少Aβ诱导的PC12细胞的损伤，提高细胞的存活率，减少细胞凋亡。     

脂氧素A4对Aβ_(25-35)所致N2a细胞损伤的保护作用初探

目的:初步探讨脂氧素A4(LXA4)对β-淀粉样蛋白25-35(Aβ_(25-35))损伤N2a细胞的保护作用及其机制。方法:用不同浓度Aβ_(25-35)处理N2a细胞,建立阿尔茨海默病(AD)细胞损伤模型,通过细胞形态学观察、CCK-8法和Hoechst 33258染色来评价细胞模型是否构建成功。细胞分为对照组、模型组(20μmol/L Aβ_(25-35))和LXA4保护组(50、100、200 nmol/L)。采用CCK-8法检测N2a细胞的活性;荧光酶标仪检测N2a细胞内活性氧(ROS)水平;ELISA法检测细胞培养上清中白介素-10(IL-10)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。结果:20μmol/L Aβ_(25-35)处理N2a细胞24 h可建立细胞损伤模型。LXA4保护组的细胞存活率均较模型组显著升高。与模型组相比,200 nmol/L LXA4保护组细胞内ROS水平显著降低(P0.01);200 nmol/L LXA4保护组IL-10水平显著高于模型组(P0.01);200 nmol/L LXA4保护组的TNF-α水平显著低于模型组(P0.01)。结论:LXA4对Aβ_(25-35)损伤N2a细胞具有保护作用,其机制可能是抑制ROS水平以及调节炎症因子的表达。     

淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞凋亡与奥氮平的保护作用

背景:在阿尔茨海默病中起着重要作用的淀粉样β蛋白能够诱导细胞凋亡。目的:探讨奥氮平对淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞凋亡的机制及其保护作用。单位:解放军总医院南楼神经科。设计:随机设计。材料:实验于2002-05/2003-03在加拿大萨斯卡彻温大学医学院神经精神研究所完成。方法:P12细胞在RPMI1640培养液中培养。在96孔板每孔中接种100μL细胞悬液,在胶原被覆的25cm2培养瓶中接种5mL细胞悬液,培养24h后,分别加50μmol/L、100μmol/L奥氮平培养24h,再加不同浓度的淀粉样β蛋白25～35(0.01μmol/L、2μmol/L、20μmol/L)培养24h。将收获好的96孔板以淀粉样β蛋白25～35诱导PC12细胞凋亡,采用MTT比色分析测定细胞存活率。收获25cm2培养瓶中的PC12细胞,应用Westernblot检测奥氮平对PC12细胞Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的影响。主要观察指标:细胞存活率的测定,PC12细胞中Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达水平。结果:①细胞存活率比较:淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞的细胞活性从75%降低到35%;50μmol/L、100μmol/L奥氮平预处理组PC12细胞的活性明显提高。②奥氮平对淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞凋亡中Bax表达的影响:0.01μmol/L,2μmol/L,20μmol/L淀粉样β蛋白25～35处理的PC12细胞Bax的表达增加,50μmol/L奥氮平预处理使淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞Bax的表达减低。③奥氮平对Aβ25～35诱导的PC12细胞凋亡中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的影响:0.001μmol/L、0.01μmol/L淀粉样β蛋白处理的PC12无变化,50μmol/L奥氮平预处理对PC12细胞表达亦无影响;2μmol/L、20μmol/L淀粉样β蛋白25～35处理的PC12细胞表达增高,50μmol/L奥氮平预处理能抑制其表达升高。结论:①淀粉样β蛋白25～35能够诱发与细胞凋亡密切相关的Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3在培养的PC12细胞中高表达。②奥氮平具有降低其表达,提高PC12细胞存活的保护作用。     

何首乌有效成分二苯乙烯甙对神经细胞保护作用的机制

目的：观察2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖甙对两种拟痴呆细胞模型的作用，探讨何首乌主要有效成分二苯乙烯甙神经保护作用的机制。为阐明何首乌及以其为主要成分的中药复方的功效机制提供实验依据。方法：不同浓度二苯乙烯甙(5～400μmol／L)分别与SK-N-SH人神经母细胞瘤细胞共孵育6，24h，加人工具药β-amyloid25-35(终浓度25μmol／L)孵育24h或500μmol／L过氧化氢孵育2h。MTT法测定细胞存活率，细胞膜损伤测定乳酸脱氢酶漏出率(LDH％)。结果：①50～400μmol／L二苯乙烯甙与细胞预孵育6h可明显拮抗β-amyloid25-35引起的细胞存活率下降，随剂量增加，保护作用上升，至200μmol／L保护作用最强。200，400μmol／L二苯乙烯甙能拮抗β-amyloid25-35引起的细胞乳酸脱氢酶漏出率增高。5～200μmol／L二苯乙烯甙与细胞预孵育24h，可使β-amyloid25-35引起的细胞存活率下降恢复正常。200μmol／L二苯乙烯甙使β-amyloid25-35引起的细胞LDH％增多恢复正常。②5μmol／L二苯乙烯甙与细胞预孵育6h，即可明显拮抗过氧化氢引起的细胞存活率下降及LDH％增多[LDH％：(62．47&;#177;2．43)％；MTT(A)：0.1093&;#177;0.0074]，至200μmol／L保护作用最强[LDH％：(46．10&;#177;2．10)％；MTT(A)：0.2487&;#177;0.0283]。二苯乙烯甙与细胞预孵育24h，5～400μmol／L二苯乙烯甙均能拮抗过氧化氢引起的细胞存活率下降及LDH%增多(P&;lt;0.05)，呈明显剂量依赖关系，且各浓度保护作用均较药物预孵育6h增加，200μmol／L二苯乙烯甙组细胞存活率及LDH％基本恢复正常。结论：二苯乙烯甙对β-淀粉样蛋白和过氧化氢致神经细胞存活率下降及乳酸脱氢酶漏出增多有明显拮抗作用。二苯乙烯甙作为何首乌的主要有效成分对老年性痴呆等神经系统退性行疾病的防治有良好应用前景。     

依达拉奉对淀粉样β蛋白25～35致PC12细胞氧化损伤的神经保护作用

目的：观察特异性清除羟自由基的神经保护剂依达拉奉对淀粉样β蛋白25-35诱导的PC12细胞氧化损伤的保护作用。方法：实验于2005-03／07在吉林大学中日联谊医院神经内科进行。将培养的PC12细胞分为3组：①正常对照组：加入含体积分数0．25的胎牛血清的DMEM维持液培养。②依达拉奉预处理组：加入依达拉奉20μmol／L预处理12h，然后加入淀粉样β蛋白25～35 30μmol／L继续孵育24h。③淀粉样B蛋白25～35干预组：淀粉样β蛋白25～35 30μmol／L孵育24h。采用MTT法测定细胞生存率；采用ELISA法测定羰基蛋白和晚期糖基化终产物的含量；硫代巴比妥酸法测定丙二醛的浓度。结果：①3组细胞生存率比较：正常对照组为（100．0&;#177;5.7）％，依达拉奉预处理组显著高于淀粉样β蛋白25～35干预组[（86．4&;#177;17．7炀，（42．5&;#177;9．4）％，P〈0．001]。②3组细胞内羰基蛋白含量比较：正常对照组为（0．35&;#177;0．09）μmol／g，依达拉奉预处理组显著低于淀粉样β蛋白25～35干预组[（0．41&;#177;0．12），（0．81&;#177;0．17）μmol／g，P〈0.01]。③3组晚期糖基化终产物水平比较：正常对照组为（12．21&;#177;3．26）mg／L，依达拉奉预处理组显著低于淀粉样β蛋白25-35干预组[（14.65&;#177;4．25），（26．57&;#177;5，18）mg／L，P〈0．01]。④丙二醛浓度：正常对照组为（4．11&;#177;0．98）μmol／L，依达拉奉预处理组显著低于淀粉样β蛋白25～35干预组[（4．92&;#177;1．30），（7.58&;#177;1．01）μmol／L，P〈0.01]。结论：依达拉奉能够减少淀粉样β蛋白25～35对PC12细胞内蛋白质氧化产物、晚期糖基化终产物及脂氧化终末产物的生成，具有神经保护作用。     

晚期糖基化终产物在β样淀粉蛋白25-35诱导PC12细胞氧化损伤中的作用

目的探讨晚期糖基化终产物(AGEs)在β样淀粉蛋白25-35(Aβ25-35)诱导PC12细胞氧化损伤中的作用。方法将实验对象分为五组:10、20、304、0μmol/L四种浓度的Aβ25-35干预组和正常对照组。采用MTT法测定细胞生存率,采用ELISA法测定AGEs的含量。结果Aβ25-35诱导PC12细胞,细胞生存率为50%时,Aβ25-35浓度约为30μmol/L;与正常对照组相比,30μmol/L Aβ25-35干预组细胞生存率明显降低(P<0.001)、细胞内AGEs含量明显升高(P<0.05)。结论AGEs参与了β样淀粉蛋白25-35诱导PC12细胞氧化损伤的过程。     

Aβ25-35致PC12细胞核酸、蛋白质氧化损伤及依达拉奉的保护作用

目的 研究依达拉奉对淀粉样β蛋白25-35（Aβ25-35）诱导的PC12细胞核酸、蛋白质氧化损伤的保护作用。方法 实验对象分为三组：依达拉奉保护组（依达拉奉20μmol／L,Aβ25-35 30 μmol／L）、Aβ25-35干预组（Aβ25-35 30 μmol／L）和正常对照组。采用MTT法测定细胞生存率；慧星法测定DNA单链损伤；ELISA法测定羰基蛋白含量；比色法测定羟自由基（．OH）并计算，OH清除率。结果 与正常对照组相比，Aβ25-35干预组细胞生存率降低。DNA单链损伤明显加重，细胞内羰基蛋白含量升高（P均〈0．001）。依达拉奉保护组与Aβ25-35干预组相比，细胞生存率明显升高，DNA单链损伤明显减轻，细胞内羰基蛋白含量减低（P〈0．001或P〈0．01），但都未达到正常水平。依达拉奉对．OH的有效清除率可高达79．98％。结论 依达拉奉能够通过清除．OH来减轻DNA损伤。并能减少细胞内蛋白质氧化产物的生成，具有神经保护作用。     

脑性瘫痪幼鼠脑中γ-氨基丁酸A受体mRNA表达变化

目的：探讨缺血缺氧窒息脑性瘫痪(以下简称脑瘫)幼鼠脑中γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABAA)受体α1,β2亚单位mRNA的变化规律，及脑瘫形成的生物学机制。方法：应用RT-PCR方法分别检测大鼠缺血缺氧后不同时间(2，12，24，48，96h)大脑、海马中GABAA受体α1,β2亚单位mRNA表达情况。结果：正常对照鼠脑内GABAA受体α1,β2亚单位的mRNA广泛表达；脑瘫组单位面积(mm^2)皮质及海马GABAA受体α1mRNA阳性细胞数在窒息后12h分别增加20％和34％，96h分别增加57％和75％与对照组比F=7、22，3、23，P&;lt;0、05或0、01；单位面积(mm^2)皮质及海马GABAA受体132mRNA阳性细胞数窒息后2h分别下降19％和34％与对照组比F=7、12，P&;lt;0、05，12h分别下降34％和46％与对照组比F=2．56，P&;lt;0．01，24h恢复正常。结论：GABAA受体α1,β2mRNA的变化可能为脑瘫形成的重要原因。     

白细胞介素-1对β淀粉样蛋白胞毒及基因表达的调节作用

目的:研究β淀粉样蛋白(β-amyloidprotein,Aβ)的神经元毒性作用及白细胞介素1(interleukin-1β,IL-1β)对神经细胞β淀粉样蛋白前体(β-amyloidprecursorprotein,APP)基因表达以及对Aβ细胞毒性的调节作用。方法:以PC12细胞作为体外神经细胞模型,应用四唑盐(MTT)法检测Aβ,IL-1β对细胞活性的影响,应用RT-PCR法半定量分析IL-1β对APP基因表达的影响。结果:Aβ具有直接的神经细胞毒作用,与浓度以及聚集状态相关,以20μmol/L孵育3h毒性最大(q=5.62,P<0.01),而孵育7d者几乎没有毒性。IL-1β(浓度为20μg/L)与Aβ25-35(浓度为20μmol/L孵育3h)共同作用于细胞时,Aβ25-35的细胞毒作用被扩大,细胞活性从36.7%降到了13.2%(q=3.8,P<0.05);当IL-1β(浓度为20μg/L)与Aβ25-35(20μmol/L孵育7d)共同作用时,细胞活性迅速下降,从93%降到了7.7%(q=4.83,P<0.01)。IL-1β可以刺激PC12细胞APP751、770mRNA表达增加,与对照组相比,20μg/L组APPmRNA表达增加约为2倍(q=4.76,P<0.01),此后增加不明显;APPmRNA的表达在IL-1β(20μg/L)刺激6h达高峰,约为对照组的2倍(q=4.92,P<0.01)。结论:Aβ具有直接细胞毒作用,与浓度以及聚集状态相关。IL-1β可以扩大Aβ的细胞毒性作用。IL-1β可以刺激PC12细胞APPmRNA表达增加,具有剂量及     

瘦素对RAW264．7细胞肿瘤坏死因子α表达的影响

背景：瘦素是脂肪组织分泌的一种多肽激素，研究显示瘦素在动脉粥样硬化形成中发挥了一定重要的作用。目的：观察瘦素对鼠源性巨噬细胞系RAW264．7细胞肿瘤坏死因子α表达的影响，并从核转录因子κB活性变化角度探讨其可能机制。设计：对照观察实验。单位：华中科技大学同济医学院生物化学及分子生物学系。材料：实验于2005-04／2006—02在华中科技大学同济医学院生物化学及分子生物学系及附属协和医院普外科实验室完成。将培养的RAW264．7细胞分为不同浓度瘦素处理组（12．5，25，50，100μg／L）、I kappa B激酶抑制剂组及空白对照组。每组3瓶，重复实验3次。方法：将鼠源性巨噬细胞株RAW264．7细胞以1&;#215;10^9 L^-1密度接种于6孔板中，用含体积分数为0．1的小牛血清的RPMI-1640培养基培养。待RAW264．7细胞生长至80％时，换用无血清培养基Opti—MEM继续培养24h后，将细胞分为不同浓度瘦素处理组（12．5，25，50，100μg／L）及空白对照组，瘦素孵育4h后采用反转录-聚合酶链反应检测肿瘤坏死因子α在mRNA水平的表达。上述分组细胞经瘦素分别孵育1，3，6和9h后采用双抗夹心酶联免疫吸附实验检测肿瘤坏死因子α在蛋白水平的表达。上述分组细胞经瘦素孵育不同时间后采用凝胶迁移率实验检测细胞核内核转录因子κB活性。将RAW264．7细胞分为以下4组：空白对照组、I kappa B激酶特异性抑制剂PS1145（10μmol／L）处理组、瘦素（50μg／L）处理组、瘦素（50μg／L）＋PS1145（10μmol／L）组，各组孵育时间均为6h，分别检测细胞核内核转录因子κB活性及肿瘤坏死因子α在mRNA水平的表达。主要观察指标：①不同浓度瘦素对RAW264．7细胞肿瘤坏死因子α：mRNA表达水平的影响；蛋白分泌的影响。②不同浓度瘦素对RAW264．7细胞核内核转录因子κB活性的影响。③抑制I kappa B激酶活性对瘦素诱导RAW264．7细胞肿瘤坏死因子α的影响。结果：①RAW264．7细胞经不同浓度的瘦素处理后，肿瘤坏死因子α在mRNA水平呈瘦素剂量依赖性增加，50μg／L瘦素处理组达峰值。②蛋白水平的表达呈瘦素剂量时间依赖性增加，50μg／L瘦素处理6h即可达峰值。③核转录因子κB的活性亦与瘦素浓度正相关，50μg／L瘦素处理6h后核转录因子κB活性最高（P〈0．05）。④抑制I kappa B激酶活性可部分抑制肿瘤坏死因子α的表达。结论：瘦素可直接促进RAW264．7细胞肿瘤坏死因子α的表达和分泌，并呈剂量时间依赖性，其机制可能与瘦素激活核转录因子κB有关。这可能是瘦素致动脉粥样硬化的机制之一。     

甘精胰岛素干预游离脂肪酸诱导RIN-m细胞凋亡的变化

目的：观察甘精胰岛素对游离脂肪酸诱导的β细胞(RIN—m细胞)凋亡是否具有保护作用，并与普通胰岛素及胰岛素样生长因子1的干预效果进行对比。方法：本实验于2004—05／2004—10在中山大学附属第二医院林百欣医学科学研究中心完成。RIN—m细胞被培养并常规培养传代。诱导凋亡接种于6孔板或者96孔板后常规培养2d，待细胞长至70％满左右时，吸去培养基，加入含10g／L血清白蛋白，10mL／L乙醇，20mL／L胎牛血清的培养基(正常对照组)，或者含10g／L血清白蛋白，体积分数为0．01乙醇、体积分数为0．02胎牛血清和0．3mmol／L棕榈酸的培养基(凋亡对照组)，或者含10g／L牛血清白蛋白，体积分数为0．01乙醇、体积分数为0．02胎牛血清，0．3mmol／L棕榈酸以及100nmol／L甘精胰岛素(甘精胰岛素组)或者100nmol／L普通胰岛素(普通胰岛素组)或者10nmol／L胰岛素样生长因子1组的培养基，孵育24h后，将细胞接种于6孔板，诱导细胞凋亡。采用Hoechst33342染色、流式细胞仪以及酶联免疫吸附反应方法检测各组RIN-m细胞的凋亡，吸光度值代表细胞裂解液中核小体的数量，即DNA断裂的数量。结果：0．3mmol／L棕榈酸孵育后RIN-m细胞出现核皱缩、碎裂等典型凋亡表现。①甘精胰岛素组、普通胰岛素组、胰岛素样生长因子1组亚二倍体细胞比率[(32．00&;#177;3．08)％，(35．97&;#177;3．14)％，(25．25&;#177;1．66)％]明显高于正常对照组[(3．28&;#177;1．44)％](P&;lt;0．01)；但明显低于凋亡对照组(42．10&;#177;4．24)％(P&;lt;0．01)。②甘精胰岛素组、普通胰岛素组、胰岛素样生长因子1组细胞裂解液中核小体的数量(A值)(2．372&;#177;0．21，2．758&;#177;0．20，1．704&;#177;0．16)明显高于正常对照组(0．341&;#177;0．023)(P&;lt;0．01)；但明显低于凋亡对照组(3．333&;#177;0．23)(P&;lt;0．01)。甘精胰岛素组和胰岛素样生长因子1组裂解液中核小体的数量(A值)明显低于普通胰岛素组(P&;lt;0．05)。结论：甘精胰岛素对游离脂肪酸诱导的B细胞凋亡具有抑制作用，该种作用强于普通胰岛素。     

缺氧诱导人视网膜色素上皮细胞19中血管内皮生长因子mRNA表达及金雀异黄素的抑制作用

目的：观察缺氧对人视网膜色素上皮细胞19中血管内皮生长因子mRNA表达的诱导作用，以及金雀异黄素对其血管内皮生长因子mRNA和蛋白表达的抑制作用。方法：实验于2004—02／12在南京医科大学生理学实验室完成。视网膜色素上皮细胞缺氧(体积分数为0．05的CO2／体积分数为0．95的N2)2，12，24，36h后，用反转录聚合酶链反应检测该区域血管内皮生长因子mRNA表达；细胞用50，100，200μmol／L金雀异黄素和50μmol／L PD98059预处理后缺氧2和24h，用反转录聚合酶链反应检测人视网膜色素上皮细胞19细胞中血管内皮生长因子mRNA表达，用酶联免疫吸附分析检测细胞培养液上清中血管内皮生长因子蛋白表达。结果：①缺氧2，12，24，36h人视网膜色素上皮细胞19细胞血管内皮生长因子mRNA表达是正常组的2．6，3．1，8．4，2．9倍(P&;lt;0．05，n=8)。②缺氧2h：50，100，200μmol／L金雀异黄素和50μmol／LPD98059可以抑制缺氧组血管内皮生长因子mRNA表达的51．1％，71．6％．79．7％和55％(P=0．01，n=10)，蛋白表达分别为(97．00&;#177;12．79)，(58．85&;#177;20．21)．(37．93&;#177;14．41)，(57．83&;#177;9．66)ng／L。③缺氧24h：50，100，200μmol／L金雀异黄素和50μmol／LPD98059可以抑制缺氧组血管内皮生长因子mRNA表达的55．0％，78．7％，90．7％和67．2％(P=0．000，n=10)，蛋白表达分别为(189．60&;#177;20．20)，(117．70&;#177;21．97)，(49．7&;#177;13．17)，(86．33&;#177;12．47)ng／L。结论：缺氧对血管内皮生长因子mRNA表达的诱导呈时间依赖性；金雀异黄素可以在转录及转录后水平抑制缺氧诱导的人视网膜色素上皮细胞19细胞中血管内皮生长因子表达的上调。金雀异黄素对血管内皮生长因子mRNA和蛋白表达的抑制作用也呈浓度依赖性。     

H2O2对PC12细胞par-4和caspase-3基因表达的影响

目的探讨H2O2对PC12细胞par-4和caspase-3基因表达的影响,为阿尔茨海默病神经元凋亡发生的机制提供实验依据.方法用不同剂量H2O2(0～400 nmol/L)处理PC12细胞8 h,或终浓度200 nmol/L H2O2处理PC12细胞不同时间(0-8 h),采用RT-PCR检测par-4,caspase-3 mRNA表达变化,Western blot检测Par-4蛋白表达和Caspase-3P20活性片段的变化,用比色法检测Caspase-3相对活性.结果随H2O2浓度从100～400 nmol/L增加,par-4,caspase-3mRNA表达和Par-4蛋白表达水平及Caspase-3 P20活性片段逐渐增加;200 nmol/LH2O2作用PC12细胞0～8 h,par-4 mRNA表达和Par-4蛋白表达,在2～8 h随时间延长表达增加;caspase-3 mRNA表达和Caspase-3 P20活性片段,在4～8 h随时间延长而增加;随H2O2浓度从50～400 nmol/L增加,Caspase-3相对活性增加(x2=4.8,P＜0.05),在400 nmol/LH2O2时Caspase-3相对活性达最大值.结论随着H2O2剂量依赖性的增加和同一剂量下H2O2处理PC12细胞时间增加par-4,caspase-3基因mRNA的表达,Par-4蛋白的表达,Cas-pase-3 P20活性片段,Caspase-3活性均有所增加.     

右美托米啶对β-淀粉样肽引起的SH-SY5Y细胞凋亡的影响

目的:探讨右美托米啶(dexmedetomidine,Dex)对β-淀粉样肽(amyloid-βpeptide,Aβ)引起的SH-SY5Y细胞(神经母细胞瘤细胞)凋亡的影响作用。方法:体外培养SH-SY5Y细胞,随机分为4组:阴性对照组,不同浓度Aβ25-35组(2.5、5.0、10.0μmol/L组),观察不同浓度的Aβ25-35对SH-SY5Y细胞的作用。同时进一步观察Dex与Aβ联合应用对SH-SY5Y细胞的作用,实验随机分为5组:阴性对照组,Aβ组(10.0μmol/L Aβ25-35),Aβ+Dex 0.1组(10.0μmol/L Aβ25-35+0.1μmol/L Dex),Aβ+Dex 1.0组(10.0μmol/L Aβ25-35+1.0μmol/LDex)和Aβ+Dex 10.0组(10.0μmol/L Aβ25-35+10.0μmol/L Dex),分别处理24 h后,采用DAPI荧光染色法计数凋亡细胞数,计算凋亡率。结果:Aβ25-35可以促进SH-SY5Y细胞的凋亡,且呈时间和浓度依赖性;而在Aβ25-35中同时加入Dex作用后,细胞凋亡明显受到抑制,细胞凋亡率明显下降(P<0.05),但仍明显高于阴性对照组。结论:Dex可以有效的抑制Aβ25-35引起的SH-SY5Y细胞的凋亡。     

阿尔茨海默病发病与淀粉样β蛋白1～42／α1-抗糜蛋白酶复合物及脂质代谢紊乱的关系

目的：研究淀粉样β蛋白(Aβ）1～42与α1-抗糜蛋白酶(antichymotrypsin，ACT)形成的复合物对神经胶质瘤细胞(DK-MG)脂质代谢的影响，探索脂质代谢紊乱与阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)发病机制的相关性。方法：实验于2001-01／2002-03在瑞典隆德大学附属马尔默医院Wallenberg实验室和首都医科大学宣武医院神经内科实验室完成，Aβ1～42与ACT溶液室温下以10：1摩尔比混合孵育2h，琼脂糖凝胶电泳和Western-blot检测反应产物Aβ1～42／ACT。观察在Aβ1～42／ACT存在的条件下，细胞对低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)的摄取、降解和细胞内胆固醇的合成；红油O染色观察细胞内脂质的含量；RT-PCR检测LDL受体(LDLr)的mRNA表达水平。结果：Aβ1～42，ACT单克隆抗体染色证实Aβ1～42／ACT复合物的存在.与对照组细胞相比，Aβ1～42／ACT使细胞摄取LDL增加50％(t=10．30．P&;lt;0．01)，胞内脂质颗粒增加20倍(t=6．84，P&;lt;0．05)，LDLr的mRNA水平增加48％(t=20．79，P&;lt;0．01)。相反，Aβ1～42，ACT单分子对上述脂质代谢过程没有显著影响。Aβ1～42，ACT，Aβ1～42／ACT对LDL降解、细胞内胆固醇的合成都没有影响。结论：Aβ1～42／ACT复合物使神经胶质细胞内的脂质累积增加，可能是LDLr表达上调增加LDL摄取的结果。脂质代谢紊乱是AD发病的假说之-，Aβ1～42通过与ACT结合对脂质代谢造成的影响可能与AD的发病机制相关。     

miR-320a调控水通道蛋白4对阿尔茨海默病细胞模型的影响

目的 探讨miR-320a调控水通道蛋白4(AQP4)对阿尔茨海默病细胞模型的影响。 方法 采用神经生长因子（NGF）诱导大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株（PC12)为神经元细胞,观察PC12组和神经元细胞组的细胞形态。采用β淀粉样蛋白(Aβ)处理诱导的神经元细胞,构建AD细胞模型。根据处理因素的不同将培养细胞分为对照组（不做特殊处理）、miR-320a模拟剂组（加入miR-320a模拟剂50 nmol/L）、miR-320a抑制剂组（加入miR-320a抑制剂50 nmol/L）、Aβ处理组（加入Aβ）、Aβ+miR-320a模拟剂组（加入Aβ+miR-320a模拟剂50 nmol/L）和Aβ+miR-320a抑制剂组（加入Aβ+miR-320a抑制剂50 nmol/L）。采用CCK8法检测细胞活力。利用RT-PCR检测目标基因AQP4、miR-320a、Bax、B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）mRNA的相对表达。采用免疫印迹法检测目标基因AQP4、Bax、Bcl-2蛋白的相对表达。 结果 PC12经NGF诱导后,与PC12组比较,神经元细胞组泛素羧基末端水解酶-L1(Uch-L1)基因表达明显下调,神经丝蛋白(NFP)、微管结合蛋白2(MAP2)、AQP4基因表达明显上调,MAP2和AQP4蛋白相对表达明显增高。造模后,与对照组比较,Aβ处理组神经元细胞凋亡增加,细胞活力明显减低,miR-320a、AQP4、Bcl-2的mRNA及AQP4、Bcl-2蛋白表达明显减少,Bax的mRNA及蛋白表达明显增加。与Aβ处理组比较,Aβ+miR-320a模拟剂组,细胞活力明显增加,miR-320a、AQP4、Bcl-2的mRNA及AQP4、Bcl-2蛋白表达明显增加、Bax的mRNA及蛋白表达明显降低。与Aβ+miR-320a模拟剂组比较,Aβ+miR-320a抑制剂组细胞活力明显降低,miR-320a、AQP4、Bcl-2的mRNA及AQP4、Bcl-2蛋白表达明显降低,Bax的mRNA及蛋白表达明显升高。 结论 miR-320a可以上调AD细胞模型中AQP4的表达,减少细胞凋亡,增加细胞存活率。