视网膜神经节细胞体外培养研究进展

视网膜神经节细胞（RGC）是视网膜的第三级神经元，在视觉通路中起着重要的传导作用。许多眼科疾病（如视神经病、青光眼等）可导致RGC损伤、变性和凋亡，最终引起视功能丧失，因此保持或促进RGC存活及轴突生长对视功能的维持至关重要，目前国内外学者都在努力探寻体外培养RGC的最有效方法。笔者就RGC的培养、分离、鉴定、纯化等方法的研究进展作一综述。     

猪视网膜神经节细胞的培养及超微结构

目的：建立视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells,RGCs)的体外培养方法,并研究视网膜不同类型神经细胞之间的相互作用,为RGCs的体外实验研究奠定基础。方法：进行猪视网膜细胞混合体外培养和神经节细胞的纯化培养,观察神经节细胞生长状态及轴突生长情况,研究视网膜不同类型神经细胞之间的相互作用。结果：视网膜细胞混合培养时,神经节细胞生长良好,纯化后的神经节细胞间连接减弱,细胞存活时间缩短。结论：视网膜细胞混合培养有利于神经节细胞的贴壁和生长。     

大鼠视网膜共培养诱导神经干细胞分化为视网膜神经节细胞

目的:研究新生大鼠视网膜组织与胚胎上丘源神经干细胞共培养对干细胞分化的影响.方法:采用机械分离、无血清培养基选择培养的方法从孕14 d的胚鼠上丘中获取神经干细胞并传代培养.使用组织-细胞共培养系统将出生4 d的乳鼠视网膜组织与上丘源神经干细胞共培养,观察干细胞分化过程,对分化细胞进行鉴定,并与干细胞的自然分化过程进行比较.结果:从胚鼠上丘中获得的细胞在无血清培养条件下聚集呈球形悬浮生长,可以持续传代培养,具有多向分化能力,经免疫荧光鉴定证实为神经干细胞.新生大鼠视网膜组织与胚胎上丘源神经干细胞共培养促进干细胞的分化,并诱导分化出Thy1.1阳性细胞.结论:从胚胎大鼠上丘可以分离培养神经干细胞,与新生鼠视网膜组织共培养可以诱导上丘源神经干细胞分化出视网膜神经节细胞.     

荧光金逆行标记乳鼠视网膜神经节细胞的实验研究

目的建立荧光金逆行标记乳鼠视网膜神经节细胞的方法。方法选取出生1 d的SD大鼠乳鼠,腹腔注射水合氯醛麻醉后,剪开头部皮肤,向双侧上丘各注射4%荧光金注射液1μl,缝合皮肤,4 d后处死,提取视网膜,胰酶消化后培养,显微镜下观察被标记的视网膜神经节细胞。结果混合培养的视网膜细胞中,可见被荧光金标记的视网膜神经节细胞,大约占细胞总数的0.34%,视网膜神经节细胞可存活3周。结论荧光金逆行标记乳鼠视网膜神经节细胞是一种可行的方法,可用于视网膜神经节细胞的鉴定。     

人眼视网膜神经节细胞胚胎发育的观察

①目的 观察人眼视网膜神经节细胞（ＲＧＣ）胚胎发育的状况,为研究ＲＧＣ提供形态学依据。②方法 对胎龄６～３８周５７３眼的ＲＧＣ进行光镜及电镜观察。利用计算机自动图像分析系统对２０～３８周的ＲＧＣ进行定量分析;用Ｉ（ＳＥＬ法定性标记凋亡细胞。③结果 电镜下胚胎６周ＲＧＣ的轴突与树突已可分辨;１５周时ＲＧＣ层及内丛状层在视网膜周边部已形成,后极部ＲＧＣ层小细胞多,周边部ＲＧＣ层大细胞多;胎龄１８～２２     

用MATLAB定量视网膜神经节细胞

视网膜神经节细胞的定量计数在眼科研究方面具有重要价值.用MATLAB软件对标记的SD大鼠视网膜神经节细胞图像进行定量计数,所编写的程序不仅操作简单,适合非计算机专业人员使用;而且可避免眼睛计数所造成的人为误差,提高计数效率,提高可靠性、稳定性、可重复性和精确性.     

Muller细胞诱导视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化

目的研究Muller细胞在视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化中的作用。方法分离培养Muller细胞和不同时期的胚胎视网膜前体细胞,将其与Muller细胞共同培养,并进一步用Muller细胞条件培养液来诱导视网膜前体细胞的分化。倒置相差显微镜每天观察细胞的生长和分化情况,Thy1.1标记视网膜神经节细胞并计数。结果视网膜前体细胞能分化为多种视网膜细胞类型,包括视网膜神经节细胞。不同时期、不同培养条件下的视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化的百分比不同。单独培养组、共同培养组和Muller细胞条件培养液组视网膜神经节细胞的百分比,E14分别为(16.91±4.05)%,(47.25±9.67)%和(42.36±10.52)%,E18则分别为(4.65±1.88)%,(9.90±3.19)%和(8.69±3.01)%。相同时期的视网膜前体细胞,共同培养组和Muller细胞条件培养液组视网膜神经节细胞的百分比较单独培养组高,差异有统计学意义。相同培养条件下,E14视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化的百分比较E18高,差异有统计学意义。结论Muller细胞能诱导视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化,可能通过Muller细胞释放某些可溶性因子发挥作用。     

视网膜神经节细胞的药物干预现状

视网膜神经节细胞（RGCs）是青光眼等神经退行性病变的主要损伤细胞，它的死亡常导致视功能不可逆性损害。许多人为了寻找促进RGCs存活和轴突再生的药物作了大量的研究，作者着重介绍神经营养因子、中药等对RGCs的神经保护作用，以及谷氨酸、一氧化氮对RGCs的神经损伤作用，为实验和临床研究提供参考。     

α晶体蛋白对视网膜神经节细胞作用的初步研究

目的 探讨α晶体蛋白对体外培养视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)的作用.方法 原代培养RGCs,Thy1.1免疫荧光法鉴定RGCs并进行纯度检测,10-7、10-6、10-5、10-4 g/L α晶体蛋白加入后于1、3、12 h、1、2 d和3 d在相差倒置显微镜下观察RGCs形态学变化;计数突起数目和轴突长度;应用免疫荧光及激光共聚焦扫描技术观察实验组α晶体蛋白在体外培养RGCs上的定位并进行荧光强度半定量分析.结果 Thy1.1鉴定RGCs纯度为90%～95%,RGCs 10-4、10-5 g/L组突起数目及轴突长度显著大于对照组,以10-4 g/L组变化最显著.免疫荧光结果显示10-4 g/Lα晶体蛋白组RGCs与α晶体蛋白抗体呈阳性结合,并呈先升高后降低趋势.结论 α晶体蛋白能够促进RGCs生长,最佳浓度为10-4 g/L,细胞膜上抗体结合阳性,表明α晶体蛋白可与RGCs膜结合,这在α晶体蛋白促进RGCs存活和轴突再生的反应中可能起重要作用.     

高功率微波致视网膜神经节细胞损伤的研究

目的观察2450 MHz微波对视网膜神经节细胞的损伤作用，为视网膜损伤的研究提供一定的实验依据。方法体外培养鼠视网膜神经节细胞，微波理疗机于微波屏蔽室内按微波强度分3组进行微波辐射1h，光镜下观察其形态变化，测细胞存活率。结果微波辐照后，光镜下细胞即有聚集现象，部分细胞轴突消失，个别细胞凋亡，改变随着微波强度而增加。结论2450 MHz微波可诱导视网膜神经节细胞凋亡，损伤程度与微波辐射强度呈正相关。     

壳糖体外介导血管平滑肌细胞内皮型一氧化氮合酶基因转移的初步研究

目的探讨壳糖作为非病毒载体介导质粒体外转染哺乳动物平滑肌细胞的可行性、转染效率及影响转染效率的因素。方法用壳糖包被携带绿色荧光蛋白(GFP)基因和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因的质粒PAdTrack-CMV-eNOS,制备壳糖/质粒复合体(CPC-eNOS),在不同条件下将其和Wistar大鼠血管平滑肌细胞孵育,通过检测靶细胞是否表达GFP和eNOS,评价壳糖介导质粒转染的效率。并以裸质粒PAdTrack-CMV- eNOS和重组腺病毒表达载体Ad-eNOS分别作为对照。结果荧光显微镜下472nm观察,CPC-eNOS和重组腺病毒表达载体Ad-eNOS孵育的血管平滑肌细胞均观察到绿色荧光,Western印迹法检测均有eNOS蛋白表达,但裸质粒PAdTrack-CMV-eNOS组均为阴性。CPC-eNOS中氨基/磷酸基比值(N/P比值)为5、pH值为7.0时,对平滑肌细胞的转染效率最高。结论CPC-eNOS能够体外介导转染哺乳动物的血管平滑肌细胞。转染效率与CPC-eNOS的N/P比值和转染介质pH值有关。     

鼠视网膜的免疫原性

为探讨视网膜的免疫原性,选择ＤＢＡ／２鼠（ＭＨＣ为Ｈ２ｄ）为供体,Ｃ５７ＢＬ／６（ＭＨＣ为Ｈ２ｂ）或ＢＡＬＢ／Ｃ鼠（ＭＨＣ为Ｈ２ｄ）为受体,把ＤＢＡ／２鼠的半个视网膜移植于受体鼠的皮下,２周后检测迟发型超敏反应（ＤＴＨ）和细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）。结果示移植组的迟发型超敏反应（ＤＴＨ）和细胞介导的细胞毒效应（ＣＴＬ）均低于阳性对照ＤＢＡ／２鼠脾细胞组（Ｐ＜０．０１）,高于阴性对照假手术组（Ｐ＜０．０１）。提示ＤＢＡ／２鼠视网膜表达ＭＨＣⅠ类和Ⅱ类抗原及ＭｉｎｏｒＨＣ抗原,刺激受鼠产生较弱的细胞免疫应答。视网膜具有弱免疫原性。     

LAK细胞活性与体外培养时间关系的研究

本文报告了以引产胎儿胸腺细胞为淋巴细胞来源，用ＩＬ－２激活后ＬＡＫ活性与培养时间的关系，经多次重复实验证明，ＭＴＴ法是简单，易行，准确可靠的检验ＬＡＫ活性的方法之一，在我们实验室的培养条件之下，ＬＡＫ活性最高时间是在培养４～８天之间，此间ＬＡＫ活性比培养前增加８５．７～１１４．３％，是收获ＬＡＫ细胞的最佳时间，两周后ＬＡＫ活性衰减很快，因此，作者认为，ＬＡＫ细胞培养时间不宜超过两周。     

药物体外肝代谢研究方法

体外代谢研究对阐明药效物质基础及作用机制有重要意义。常见的体外肝代谢研究方法有肝微粒体体外温孵法、肝细胞体外温孵法、肝灌流技术、肝组织切片技术、基因重组P450 酶系等。药物体外肝代谢不能全面反映体内药物的综合代谢情况,与体内的真实代谢情况存在差异,今后需结合体内实验等方法来完善药物在体内外的药物代谢转运的研究。目前肝灌流技术和基因重组P450 酶系等体外肝代谢研究方法对设备、实验操作成本、数据处理技术等要求较高,其运用和推广仍然受到一定的约束和限制,今后需建立简单、快速、经济、高效的科学技术方法和手段。由于药物体外肝代谢对新药研究与开发、正确指导临床合并用药有着巨大的推动作用,因此该文将对其进行重点论述。     

寡肽阳离子脂质体作为基因载体的体外研究

采用阳离子寡肽脂质材料赖氨酰化谷氨酸双十四醇酯(T2GL)制备阳离子脂质体(CL),与增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP)静电结合形成复合物(CL/pDNA),CL/pDNA粒径和表面电位分别为(132.3±1.0)nm和+(31.35±2.99)mV。考察CL/pDNA对肝素及脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DNase I)的稳定性,结果表明,CL/pDNA可被适宜浓度的肝素竞争性解组装释放pDNA,其对DNase I的稳定性明显优于市售制剂Lipofectamine 2000。研究CL与pDNA的比例(N/P)及质粒用量对转染效率的影响,结果显示当N/P为3,质粒用量4μg时,CL/pDNA的转染效率最佳。采用CL/pDNA对3种不同的细胞进行转染,发现CL/pDNA在人源非小细胞肺癌A549细胞中转染效果最好,与Lipofectamine 2000相比,转染效率相当但细胞毒性更低,因此为进一步研究其体内行为提供了良好的基础。     

不同转染方式对GFP表达质粒在小鼠肝脏的表达影响

目的 研究经流体力学注射、门静脉和腹腔常规注射3种不同途径注射GFP表达质粒后,目的基因在小鼠肝脏的表达情况及其转基因效率.方法 将裸质粒或脂质体包裹的质粒DNA分别应用流体力学注射、门静脉及腹腔常规注射法注入同种异体小鼠体内,48h后分别取血和肝组织,通过荧光显微镜观察3种转染途径对质粒DNA在小鼠肝脏的表达影响.结果 流体力学注射组及门静脉常规注射组均可见大量绿色荧光蛋白表达,两组的荧光表达量差异无统计学意义(P>0.05),腹腔注射组小鼠的肝脏仅见少量的绿色荧光表达,但3组内脂质体/质粒DNA复合物组绿色荧光表达量均明显高于裸质粒组(P<0.05).结论 应用流体力学注射及门静脉常规注射脂质体/质粒DNA复合物途径,目的基因均在小鼠肝脏高效表达,两种途径无明显差异,流体力学注射可广泛用于肝靶向性的活体基因转染.     

CEA真核表达载体的瞬时表达及检测

目的:检测含癌胚抗原(CEA)的真核表达质粒pWACEA在体外的瞬时表达。方法:用脂质体包裹含CEA的真核表达质粒pWACEA转染MCF7细胞,采用原位杂交和免疫组化技术检测CEA的表达。结果:转染细胞原位杂交和免疫组化均为阳性;对照标本未见阳性信号。结论:真核表达质粒pWACEA在体外可表达CEA分子,为进一步建立CEA阳性动物肿瘤细胞模型及研究CEA阳性肿瘤的免疫防治提供了基础。     

鼠真核表达的双顺反子质粒载体pIRES2-EGFP-MyoD的构建及鉴定

目的 构建鼠真核表达的双顺反子质粒载体pIRES2-EGFP-MyoD，为研究MyoD对肌损伤的修复作用提供物质基础。方法 从质粒EMSV上用EcoRI酶切下MyoD cDNA片段，进行琼脂凝胶电泳，切胶回收纯化；EcoRI酶切pIRES2-EGFP，将线形化的栽体与回收的MyoD cDNA片段用T4 DNA连接酶连接，克隆出双顺反子质粒载体pIRES2-EGFP-MyoD，并分别用Hind Ⅲ酶切和测序对重组质粒进行鉴定。结果 凝胶电泳和测序结果均证明已将MyoD cDNA亚克隆入pIRES2-EGFP内。结论 成功地构建了鼠真核表达的双顺反子质粒载体pIRES2-EGFP-MyoD。     

应用人黄素化颗粒细胞条件培养液行人类胚胎体外培养

目的 研究卵泡壁颗粒细胞条件培养液在人类胚胎体外发育中的作用。方法 将卵泡液中回收的卵泡壁颗粒细胞,分别置于添加0．1％聚乙烯醇(PVA)和添加10％胎牛血清(FCS)的TCM-199培养系统中进行体外培养。结果 在无蛋白培养系统中,颗粒细胞能够缓慢生长,第三～五天达到生长高峰,群体倍增时间发生在培养的第二～三天,培养第一～五天可分泌雌二醇到培养液中(3．22～4．65pmol／ml)。在有蛋白培养系统中,颗粒细胞生长速度明显高于无蛋白的培养系统。使用颗粒细胞条件培养液,获得的囊胚在囊胚腔的大小和细胞数量上,均优于商品化囊胚培养液。结论颗粒细胞条件培养液有利于人类4-细胞以后胚胎的发育。     

脂质体介导质粒pcDNA3.1/ KDRn3基因在转染小鼠视网膜组织中的表达及定位

目的：将真核表达质粒pcDNA3.1/ KDRn3以脂质体介导转染C57BL/6J小鼠视网膜组织,观察其表达及定位。方法：首先对真核表达质粒pcDNA3.1/KDRn3进行扩增和酶切鉴定,然后将20只健康C57BL/6J小鼠随机分成对照组及玻璃体腔注射后2、5、7和14 d组,每组4只鼠8眼。注射组每眼玻璃体腔注射脂质体pcDNA3.1/ KDRn3复合物1 μL,分别于注射后2、5、7及14 d摘除眼球,制成石蜡切片,用KDRn3蛋白免疫荧光染色在激光共聚焦显微镜下观察KDRn3蛋白表达及定位。结果：Xho Ⅰ和BamHⅠ进行双酶切,切下900 bp大小片段,与目的片段大小一致,表明该质粒确实为KDRn3。注射后2 d在视网膜神经节细胞层细胞胞浆内可见红色荧光信号,注射后5和7 d组视网膜神经节细胞层、内核层部分细胞胞浆内可见红色荧光信号;注射后14 d视网膜神经节细胞层、部分内核层细胞胞浆内可见红色荧光信号,但发出红色荧光信号的细胞数明显减少。　结论：阳离子脂质体可有效将pcDNA3.1/ KDRn3基因转染小鼠视网膜组织,并得到持续表达。