白细胞介素2增强利妥昔单抗介导的细胞毒杀伤效应机制研究

目的建立预测利妥昔单抗治疗B细胞淋巴瘤疗效的体外方法，探讨白细胞介素2（IL-2）增强利妥昔单抗介导的细胞毒杀伤效应。方法以Daudi细胞系作为淋巴瘤靶细胞，用^51Cr释放法分别检测18例B细胞淋巴瘤患者和13名健康成人的外周血单个核细胞（PBMNC）的直接细胞毒作用和抗体（利妥昔单抗）介导的细胞毒作用，其结果与患者经利妥昔单抗治疗后疗效进行比较。观察IL-2能否增强PBMNC的直接细胞毒作用和利妥昔单抗介导的细胞毒作用，并通过流式细胞术（FCM）检测IL-2活化前后PBMNC的细胞表型变化。结果淋巴瘤患者的PBMNC对靶细胞的直接杀伤作用和利妥昔单抗介导的细胞毒作用均较健康成人显著降低[效靶比为20：1时特异性细胞杀伤率分别为（5．80±1．16）％、（14．32±1．50）％和（14．29±1．68）％、（24．14±1．53）％]；其下降水平与患者经利妥昔单抗治疗后的临床疗效相关（r=0．781，P〈0．05）。患者的PBMNC在体外经IL-2活化后，其直接杀伤作用和利妥昔单抗介导的细胞毒效应较未经IL-2活化组明显增强[分别为（15．43±2．62）％、（35．79±2．58）％和（5．80±1．16）％、（14．32±1．50）％，t=3．35，P=0．003和t=7．17，P〈0．001]。结论通过对B细胞淋巴瘤患者PBMNC功能的体外分析，有助于预测利妥昔单抗治疗的疗效。IL-2体外可明显增强患者PBMNC的直接杀伤作用和利妥昔单抗介导的细胞毒作用。     

IL-21单独或联合IL-15／IL-2对G-CSF动员人外周血单个核细胞体外增殖和抗肿瘤活性作用研究

本研究探讨IL-21单独或联合IL-15／IL-2对G—CSF动员的人外周血单个核细胞（G-PBMNC）体外增殖和抗瘤活性的影响，评价IL-21及相关细胞因子组合在肿瘤免疫治疗方面的可行性。应用IL-21单独或联合IL-15／IL-2体外培养G—PBMNC，用CCK-8法进行细胞增殖分析；以白血病细胞株K562为靶细胞。用CFSE／PI流式双染法检测其对肿瘤的杀伤作用；用流式细胞术分析免疫细胞表型。结果显示：培养72小时后单独IL-21因子组对靶细胞杀伤活性与IL-2结果相近；当效靶比为25：1时IL21＋IL15／IL21＋IL15＋IL2组与IL21＋IL2组相比杀伤能力有显著增强（P〈0．05）；效靶比50：1时，细胞因子联合应用组均显著高于细胞因子单独应用组（P〈0．05），以IL21＋IL15＋IL2诱导效果最佳。复苏冻存的G-PBMNC处理结果与新鲜的G—PBMNC结果基本-致。细胞因子组和对照组相比CD3、CD4和CD8抗原表达有所增加，以IL21＋IL15组的CD4、CD3^- 56^＋和CD3^＋56^＋抗原表达增加最为显著（P〈0．05）。结论：IL-21可增强G—PBMNC的体外杀伤活性，联合IL-15可更显著提高G—PBMNC的抗瘤活性。     

EB病毒-细胞毒性T细胞免疫治疗改善EB病毒相关非霍奇金淋巴瘤化疗效果的实验研究观察

目的探讨EB病毒(EBV)特异性细胞毒性T细胞(CTL)免疫治疗对EBV相关非霍奇金淋巴瘤(NHL)化疗效果的影响及机制。方法通过细胞学实验成功诱导并扩增出大量的EBV特异性CTL;建立人EBV相关NHL的Balb/c裸雌鼠动物模型,设单纯免疫(EBV-CTL)治疗组、单纯化疗(CHOP)组、免疫治疗联合化疗疫(EBV-CTL+CHOP)治疗组以及空白对照组,5只/组,观察各组动物肿瘤生长情况;治疗结束后剥离肿瘤组织检测瘤内免疫细胞变化情况。结果体外杀伤实验显示伴随效靶比的增加,EBV-CTL杀伤能力逐渐增大:效靶比例分别在2.5∶1、5.0∶1与、10∶1及20∶1时,杀伤效率(%)分别为9.41±1.23、19.45±3.54、50.34±6.77和55.26±7.21(P0.01);动物实验显示自免疫治疗d3起,与对照组相比,3组实验组抑制淋巴瘤生长率(%)分别为28.57、57.9、76.7(P0.01)。进一步检测肿瘤相关免疫微环境实验发现,治疗后肿瘤内浸润性CTL及巨噬细胞(TIM)平均比率(%),EBV-CTL+CHOP组、EBV-CTL组、CHOP组及空白对照组分别为13.65±1.48、4.33%±1.04%,10.24±1.2%、3.82±0.54,6.83±0.16、0.95±0.07,6.32±0.18、1.96±0.24(P0.05)。结论 EBV特异性CTL可能通过激活TIM增殖而间接促进肿瘤免疫应答。EBV-CTL免疫治疗能有效改善EBV相关NHL化疗疗效,或对EBV相关NHL的治疗起到一定指导作用。     

无血清培养慢性粒细胞白血病树突状细胞的方法及其杀瘤效应研究

目的无血清培养慢性粒细胞白血病（CML）树突状细胞（DCs）并观察其杀瘤效应。方法小牛血清（FCS）、无血清（SFM）及自体血清分别培养CML—DCs，以SCF，GM—CSF，TNF—α，IL-4（A）与GM—CSF，TNF—α，IL-4（B）两组不同的细胞因子作对照。结果SFM同FCS培养体系相比差异无统计学意义（P〉0．05），与自体血清体系相比差异具有显著性统计学意义（P〈0．01）。CML—DCs HLA—DR高表达（〉50％），CD80，CD83舜口CD86表达比例不高（〈50％）。CML—DCs能刺激正常人T淋巴细胞增殖，但增殖倍数不高。经10～12d培养，5例CML—DCs行染色体G显带分析，含Ph染色体比例分别为100oA3例，98％及60％各1例，同培养前标本携带Ph比例基本吻合。在效靶比40：1，以CML—DCs同自身T细胞，自体Ph叶。单个核细胞（MNCs）共孵育，测其杀伤率为（38．5士6．5）％。结论建立了CML—DCs无血清培养方法。CML—DCs携带Ph染色体，能刺激自体T细胞杀伤自身白血病细胞。     

免疫球蛋白样抑制性受体KIR基因与HLA-Cw的匹配对NK细胞活性的影响

本研究探索自然杀伤（naturalkiller,rqK）细胞表面杀伤细胞免疫球蛋白样抑制性受体（killerimmunoglobulin—like inhibitionreceptor,KIR）基因与HLA—Cw配体匹配对NK细胞活性的影响。对27名健康人取新鲜外周血20ml,用NK细胞免疫磁珠分选试剂盒负向分选高纯度NK细胞。对30例初治确诊急性髓系白血病（AML）患者取新鲜骨髓液10ml,分离单个核细胞作为靶细胞。流式细胞仪检测NK细胞CD158a,CD158b表达水平。取健康人和患者的外周血各2ml,以PROTRANS法抽提DNA,采用序列特异性引物PCR—SSP分型技术分别检测HLA—Cw、KIR基因。MTT法检测KIR与HLA—Cw基因不同组合的NK细胞对AML患者白血病细胞的杀伤率。结果表明：分选后的NK细胞,纯度为（90．8±6．08）％。NK细胞KIR基因与靶细胞HLA—Cw等位基因的匹配数少则NK细胞的杀伤效应强,0个等位基因匹配的杀伤率为（50．66±8．40）％,1个匹配与2个匹配的杀伤率分别为（38．28±6．71）％,（19．74±4．15）％,（F=20．226,P〈0．001）。NK细胞的KIR表达水平与杀伤作用也有一定的联系（F=16．276,P值〈0．001）。结论：NK细胞对AML白血病细胞的杀伤作用与抑制性KIR／HLA—Cw的匹配数及KIR的表达相关,匹配越少、KIR表达越低,杀伤率越高。     

人鼠嵌合型CD20单克隆抗体增强树突状细胞诱导抗淋巴瘤CTL免疫效应研究

本研究利用人鼠嵌合型抗CD20单克隆抗体对B细胞淋巴瘤的靶向作用特点和其人源Fc段结合人树突状细胞（DC）的特点，探讨抗CD20单克隆抗体激发人DC呈递肿瘤抗原从而诱导抗淋巴瘤的细胞免疫效应。用人体外周血单个核细胞（MNC）体外诱导Dc生成。对高表达CD20的人淋巴瘤细胞株（Raji）分别进行抗CD20单克隆抗体单独作用（R组）、加热诱导凋亡（A组）、诱导凋亡同时加用抗CD20单克隆抗体作用（R＋A组）。经上述处理的肿瘤抗原分别负载于DC，应用透射电子显微镜观察DC对肿瘤抗原的吞噬作用，用抗原处理的DC进行自体混合淋巴细胞反应，应用ELISPOT分析效应细胞一干扰素产生和用MTT法分析效应细胞对Raji靶细胞的杀伤作用。结果表明：R组处理的DC无明显吞噬现象，A组中易见DC吞噬凋亡小体，而R＋A组中DC吞噬较多的细胞碎片。流式细胞术检测显示，3个实验组DC上的CD80、CD86、HLA．DR表达高于对照组，差别显著（P〈0．05），其中R＋A组的CD86表达阳性率明显大于R组和A组（P〈0．05）。淋巴细胞表面抗原检测结果显示，所有实验组CD8^＋细胞的比例均明显高于对照组（P〈0．05），且应用抗CD20单克隆抗体的实验组（R组和R＋A组）CD56^＋细胞数均有所增加，与不用抗CD20单克隆抗体组比较差别显著（P〈0．05）。ELISPOT方法证明，各实验组产生γ-干扰素的细胞数均高于对照组，且当效靶比为1：10时，R＋A组斑点数明显高于其它组（P〈0．05）。MTT法测定杀伤实验结果表明，各实验组对Raji细胞的杀伤率均较对照组增加，其中R＋A组的杀伤率高于R组和A组，具有显著统计学差异（P〈0．05）。结论：抗CD20单克隆抗体能够介导DC产生抗淋巴瘤效应，即激活并扩增肿瘤特异性细胞毒性淋巴细胞（CTL）和自然杀伤细胞（NK），抗CD20单克隆抗体同时加凋亡诱导处理肿瘤细胞作为抗原冲击树突状细胞，能进一步增强抗淋巴瘤的细胞免疫效应。     

磁力搅拌悬浮培养大规模扩增脐血造血祖细胞

为了利用磁力搅拌悬浮培养装置大规模体外扩增脐血造血祖细胞，从脐血分离单个核细胞，以无血清培养基stemspan添加干细胞因子、FLT-3配基及血小板生成素为培养体系进行培养。先研究磁场（25和50mT）对静态扩增培养的造血祖细胞生长和集落形成能力的影响，再研究磁力搅拌悬浮大规模培养对造血细胞总数扩增、造血集落形成和表面分子标志表达变化。结果表明，在0，25和50mT磁场组和磁转子组，细胞总数扩增倍数和造血集落形成数在各组间均无明显区别（P〉0．05）。经过7天的扩增培养，磁力搅拌悬浮大规模培养细胞总数扩增倍数为2．8±0．45，高于静态培养细胞总数扩增倍数（2．1±0．48）（P〈0．01）；磁力搅拌悬浮培养组形成的红系集落数（1983．5±582．6）、粒-巨噬细胞集落数（186．4±62．7）明显高于静态培养形成的相应的造血集落数（分别为1396．2±425．7和136．5±40．8）（P均〈0．05）：磁力搅拌悬浮扩增后造血干细胞（CD34^＋、CD34^＋／CD38^-或CD133^＋）比例分别为（0.9±0．34）％、（0．7±0．21）％和（1．1±0．35）％，低于静态培养的干细胞比例[分别为（1．4±0．35）％、（1．2±0．34）％和（1．6±0．68％）]（P均〈0．05）；但是，归巢相关分子CD184和CD62L高于静态扩增培养．．结论：磁力搅拌悬浮装置可能有利于脐血造血祖细胞规模扩增，本研究结果还有待于动物实验及临床移植试验进一步验证.     

沙利度胺对人外周血单个核细胞免疫正调控作用

本研究观察沙利度胺对外周血单个核细胞（PBMNC）增殖、淋巴细胞亚群、细胞因子分泌及其杀伤活性的影响，探讨沙利度胺治疗MM的免疫调节机理。用MTT法检测PBMNC的增殖及杀伤活性，用流式细胞术检测淋巴细胞亚群的变化，用ELISA方法检测培养上清中细胞因子的浓度。结果表明：与阴性对照组相比，沙利度胺可明显刺激正常人PBMNC中CD8^＋T、NK细胞的增殖，显著增加IL-6的分泌，减少IFN-γ的分泌，不影响IL-2、IL-10的分泌；在同一效靶比时，5μg/ml的沙利度胺可明显增强PBMNC的杀伤活性（P〈0．01），效靶比为40：1时沙利度胺组杀伤活性最强。结论：沙利度胺主要刺激PHA活化后的正常人PBMNC中CD8^＋T、NK细胞的增殖及IL-6的分泌来增强PBMNC的杀伤活性，通过增强细胞免疫功能发挥抗骨髓瘤作用。     

应用免疫球蛋白重链可变区上框架区来源的抗原九肽获得的细胞毒T细胞功能分析

目的明确存B淋巴细胞肿瘤表面的免疫球蛋白重链可变区(IgHV)的框架区(FR)上是否存在可以激发细胞毒T淋巴细胞(CTL)的抗原表位，这些来源于FR的抗原肽是否能够激发家族特异性的免疫反应，探讨按照B淋巴细胞肿瘤的IgHV基因分型进行家族性的免疫治疗的可能性，方法利用生物信息学系统预测了40例B淋巴细胞肿瘤表面的免疫球蛋白序列的抗原表位，人工合成不同基因家族的抗原几肽，利用1、2细胞结合实验检测预测的抗原肽和HLA分子的亲合力利用体外CTL刺激扩增体系。诱导特异性的CTL细胞增殖，用肽／HLA四聚体检测特异性CTL的数目，应用LDH释放实验检测CTL的细胞毒活性并验证其家族特异性。结果在B淋巴细胞肿瘤的7个IgHV基因家族中找到了12个高亲和力的抗原九肽，其中10个(83％)位于FR，以HLA-A*0201正常供的外周血单个核细胞(PBMNC)负荷该九肽作为抗原呈递细胞去刺激自身PBMNC，经过4轮刺激，CD8和肽／HLA四聚体双阳性细胞从0．38％上升到49．38％LDH释放实验证明对HLA—A*0201( )、IgHV1( )靶细胞有明显的杀伤作用，并且被IgHV1肽刺激出的CTL不能识别负荷IgHV3肽的靶细胞：结论IgHV基因FR抗原儿肽可以刺激产生具有HLA限制性的并且肽特异性的CTL，同时这样的杀伤作用具有家族特异性，以此为靶位有望对B淋巴细胞肿瘤进行家族特异性的免疫治疗。     

白介素21对树突状细胞诱导的CTL抗白血病作用的影响

本研究探讨白介素21（IL-21）对树突状细胞（DC）诱导的CTL抗白血病的体外作用。以不同细胞因子诱导培养急性白血病（AL）患者缓解期外周血单个核细胞产生DC，自体AL细胞RNA作为抗原负载DC，与自体T淋巴细胞共培养诱导白血病特异性CTL产生；用LDH释放法检测CTL杀伤自体AL细胞的作用，并检测CTL产生IFN-γ和TNF-α的变化。实验共分2组：实验组，在DC—CTL共培养过程中加用IL-21（200ng／ml）；对照组，不加IL-21。同时对IL-21单独作用培养后成熟DC，检测其表面抗原表达变化以及诱导同种混合淋巴细胞反应能力。结果表明：对照组和实验组的CTL产生率分别为：（56．73±10．21）％，（73．43±18．01）％（P〈0．01）；培养上清中IFN-γ和TNF-α分别为：（154．91±67．20）ng／L，（310．62±141．15）ng／L（p〈0．01）和（8．77±5．09）μg/L，（15．25±6．56）μg／L（p〈0．01）。在效靶比为20：1时，两组对自体AL细胞的杀伤作用分别为（50．22±5．07）％，（75．38±9．47）％（P〈0．01）；IL-21作用后的成熟DC的CD1a、CD83、CD86、CD80和HLA—DR表达没有明显变化；诱导同种混合淋巴细胞反应能力亦没有明显不同。结论：IL-21可促进DC诱导的CTL增殖、增加IFN--γ和TNF—α产生从而增强其抗白血病作用；IL-21对成熟DC表面抗原表达及其免疫功能无明显影响；提示IL-21在白血病免疫治疗中发挥一定的作用，具有潜在的临床应用价值。     

IL-23单独或联合IL-2诱导人外周血单个核细胞对K562细胞杀伤效应的实验研究

本研究旨在探讨IL-23单独或联合IL-2诱导的人外周血单个核细胞（PBMNC）对白血病细胞的杀伤效应及作用机制.IL-23（50 ng/ml）单独或联合IL-2（100 U/ml）体外诱导正常人PBMNC 72 h,并与白血病细胞株K562共同培养.采用CCK-8法测定不同时间诱导后的PBMNC对K562细胞的杀伤效应;采用ELISA方法检测杀伤活性最大时细胞培养液中IFN-γ的水平;应用RQ-PCR法检测诱导后PBMNC的穿孔素、颗粒酶B的表达水平.结果表明,IL-23单独或联合IL-2作用后的PBMNC均对K562细胞有杀伤活性,随着时间延长,杀伤率明显增加,各个时间点比较,有显著性差异（P＜0.05）;各细胞因子组培养液中分泌IFN-γ水平均显著高于空白对照组（P＜0.05）,其中以IL-23联合IL-2组诱导PBMNC表达IFN-γ的水平最高,与其它两组比较,差异显著（P＜0.05）.各细胞因子组PBMNC的穿孔素、颗粒酶B mRNA的表达量均较对照组明显增加（P＜0.05）,且IL-23联合IL-2组的穿孔素、颗粒酶B mRNA表达量显著高于其他组（P＜0.05）.结论：IL-23能促进PBMNC对K562细胞的杀伤活性,与IL-2联合具有协同增强作用,并呈时间依赖性.IL-23作用于PBMNC后IFN-γ、穿孔素、颗粒酶B的表达均明显增加,且与IL-2具有协同作用.推测IL-23可能通过诱导PBMNC表达IFN-γ、穿孔素、颗粒酶B发挥抗白血病细胞作用.     

IL-2、IL-7和IL-15联合对T细胞的体外扩增效应

为了建立一种快速有效的体外T细胞扩增方法,本研究比较了不同培养条件对T细胞增殖及其功能和特性的影响。取外周血T细胞,用自体的树突状细胞（DC）和EB病毒转化的B细胞进行周期性刺激,用细胞增殖试验、PI和AnnexinV双标记流式细胞术、Cr释放测定及ELISPOT试验分别测定不同培养条件下细胞的增殖程度、IFN-γ分泌细胞的频率、抗原特异性T细胞的杀伤活力、细胞的凋亡状态和分化能力。结果显示：T细胞在周期性刺激后,用CD3/28微珠的短期扩增效应最好,但多轮刺激后联合应用IL-2,IL-7和IL-15对细胞的扩增最强。Cr释放试验表明,CD3/28微珠扩增的T细胞不具有杀伤活力,高浓度IL-2诱导的T细胞杀伤活性最强,其次为联合应用IL-2,IL-7和IL-15。ELISPOT显示不同培养条件诱导出的分泌IFN-γ的T细胞频率从高到低依此为高浓度IL-2〉联合应用IL-2,IL-7和Il-15〉低浓度的IL-2〉CD3/28微珠。细胞表型分析显示高浓度IL-2和联合应用IL-2,IL-7和Il-15扩增的细胞含有较高比例的CD3＋CD8＋T细胞。对细胞的凋亡测定表明联合应用IL-2,IL-7和IL-15获得的T细胞的存活率最高,处于凋亡早期的细胞比例最低。细胞增殖试验显示联合应用IL-2,IL-7和IL-15扩增的细胞分化能力最强。结论：本研究建立了一种快速有效地体外扩增T细胞的方法,其中联合应用IL-2,IL-7和IL-15对T细胞的扩增最显著,获得的T细胞存活率最高,分化能力最强,该细胞同时也含有较高频率的IFN-γ分泌细胞且表现出较强的杀伤活力。     

BCR-ABL抑制剂ST1571对慢性髓系白血病细胞株K562中SARI基因表达影响的研究

为了探讨抑癌基因SARI（suppressor of AP-1 regu1atexi by IFN）在慢性髓系白血病（CML）中表达调控可能的分子机制,收集了46名CML患者和40名健康志愿者外周血样品,使用实时定量PCR技术检测2组人群~eSAIU基因的相对表达水平。在体外以CML细胞株I（562为研究模型,使用BCR．ABL抑制剂ST1571（imatinib）处理K562细胞,用实时定量PCR技术检测聃耐基因的相对表达水平。结果表明,CML患者外周血中SAR1mRNA相对表达量明显低于健康志愿者,2组间具有明显的统计学差异（P〈0．001）。使用ST1571（2．5μmo1／L）处理K562细胞24小时后SARImRNA相对表达量明显高于未处理K562细胞,两组间差异具有显著性（P〈0．001）。结论：CML患者外周血SARImRNA表达水平降低可能与该疾病的发生发展过程相关联,而且融R,基因表达下调与BCR-ABL抑制作用有关。本研究为CML患者基因治疗的研究提供了新线索。     

用抗原特异性树突状细胞激活的淋巴细胞治疗复发难治性非霍奇金淋巴瘤

本研究探讨负载自身肿瘤裂解物的树突状细胞(dendritic cells,DC)与细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killers,CIK)共培养后,治疗复发难治性非霍奇金淋巴瘤患者的临床免疫学疗效、毒副反应。选择9例复发难治性非霍奇金氏淋巴瘤患者,分离外周血单个核细胞,贴壁细胞体外经GM-CSF和IL-4诱导产生DC,并负载自体肿瘤细胞裂解物,悬浮淋巴细胞经IFN-γ、IL-2、抗CD3单克隆抗体、IL-1α体外诱导产生CIK细胞。7天后将负载抗原的DC与CIK共培养,12天后回输体内。利用流式细胞术、T淋巴细胞核仁形成区嗜银蛋白(Ag-NORs)的检测及ELISA双抗夹心法检测过继免疫生物治疗前后各项免疫指标的变化,并观察临床疗效。结果表明:经细胞治疗后患者外周淋巴细胞Ag-NOR的IS值明显增高,呈上升趋势;CIK细胞培养后可见CD3+CD8+和CD3+CD56+细胞较培养前显著增加(p0.01),负载肿瘤抗原的DC致敏后CD3+CD8+和CD3+CD56+的表达较之单纯的CIK进一步明显提高(p0.01);将负载自身肿瘤抗原的DC与CIK共培养后,上清液中IFN-γ、IL-12的水平显著高于单独CIK对照组(p0.05)。5例患者通过影像学复查显示肿瘤较治疗前明显缩小;除一过性发热、畏寒外未见其它不良反应。结论:负载自身抗原的DC-CIK细胞的具有特异性杀伤淋巴瘤细胞的能力;外周淋巴细胞Ag-NOR的IS值明显增高,分泌细胞因子水平高于单纯CIK细胞,临床治疗效果令人满意。     

原代骨髓基质细胞共培养对K562细胞伊马替尼敏感性及细胞周期的影响

背景：与骨髓基质细胞黏附可介导白血病细胞耐药,而对于黏附功能缺陷的慢性髓细胞白血病而言,骨髓基质细胞在伊马替尼耐药形成中的作用及其机制尚不清楚。目的：构建慢性髓细胞白血病骨髓基质细胞-K562细胞共培养模型,探讨慢性髓细胞白血病骨髓基质细胞共培养对K562细胞伊马替尼敏感性及细胞周期的影响。方法：自慢性髓细胞白血病患者骨髓分离、培养骨髓基质细胞,与K562细胞共培养构建骨髓基质细胞-K562细胞共培养模型。MTT法检测伊马替尼IC50,Annexin V-FITC/PI标记暴露于0.5μmol/L伊马替尼72 h的K562细胞,流式细胞仪检测K562细胞凋亡率。收集与骨髓基质细胞共培养72 h的K562细胞,流式细胞仪检测细胞周期及细胞周期蛋白（Cyclin A、Cyclin D1及cyclin E）的表达。结果与结论：基质细胞共培养组及悬浮培养组 K562细胞伊马替尼 IC50分别为（0.52±0.02）μmol/L 和（1.27±0.05）μmol/L,两者比较差异有显著性意义（P＜0.01）。0.5μmol/L伊马替尼处理72 h,共培养组及悬浮培养组凋亡率分别为（15.48±4.17）%和（32.01±6.83）%,两者比较差异有显著性意义（P＜0.01）。与骨髓基质细胞共培养72 h的K562细胞G0-G1期细胞的比例为（48.81±8.27）%,明显高于悬浮培养组（25.78±3.26）%（P＜0.01）。慢性髓细胞白血病骨髓基质细胞共培养能介导 K562细胞对伊马替尼耐药,其机制可能与基质细胞共培养使K562细胞发生G0/G1细胞周期阻滞有关。     

EB病毒近期感染与系统性红斑狼疮的关联性研究

目的：检测系统性红斑狼疮（SLE）患者体内 EB 病毒衣壳抗体（EBV-VCA-IgG、IgA）滴度及病毒DNA载量,探讨SLE患者EB病毒感染情况及病毒再发感染后的激活对SLE总体疾病活动度的影响。方法收集80例SLE患者、118例非SLE的风湿患者、33例正常对照组血标本,运用酶联免疫吸附实验（ELISA）测EB病毒抗体,实时荧光定量PCR测EBV-DNA载量。运用卡方检验比较各组病毒抗体或DNA阳性率差别,非参数检验比较各组病毒抗体滴度、红细胞沉降率、SLE疾病活动度（SLEDAI）等,Spearman相关分析病毒抗体滴度或DNA载量与SLEDAI的关联性。结果（1）抗体阳性率：SLE组EBV-IgA阳性率显著高于非SLE组及正常对照组（57.5%vs.16.96%,χ2＝37.054,P＜0.000;57.5%vs.15.15%,χ2＝16.92,P＜0.000）,并与SLE的发病有显著的相关性（r＝7.57,P＜0.05）,但IgG抗体阳性率与对照组相比无差别。抗体滴度：SLE组EBV-IgA及IgG滴度显著高于正常对照组[EBV-IgA：1.11（2.268） vs.0.495（0.856）,Z＝-2.836,P＝0.005;EBV-IgG：5.391（6.038）vs.4.121（5.231）,Z＝-2.49,P＝0.013];（2） SLE组EBV-IgA及IgG滴度与对应的SLEDAI未发现明显的相关性（EBV-IgA：r＝0.164,P＝0.195;EBV-IgG：r＝-0.09,P＝0.576）。也未发现EBV-IgA阳性患者在皮疹、关节炎、肝损害、SLEDAI、低补体血症等方面与阴性患者的差别,但红细胞沉降率却明显高于阴性患者[47（82.75）mm/1 h vs.26.5（46.25）mm/1 h, Z＝-3.028,P＝0.002];（3）80例SLE患者中有42例随访了IgA表型变化,但未发现表型变化对SLEDAI未见明显差异的影响。（4）SLE患者EBV-DNA阳性率也显著高于非SLE风湿病组（27.5% vs.12.8%,χ2＝6.712,P＜0.05）,SLE患者EB病毒DNA载量异常与正常者的SLEDAI比较无统计学意义[分别为15（22） vs.13（20.25）,Z＝-0.573,P＝0.567],并且异常DNA载量值与对应的SLEDAI之间也未见明显的相关性。结论 SLE患者EBV抗体及DNA的高表达,提示EB病毒与SLE密切相关,但是近期感染或再发感染的激活（EBV-IgA或DNA）未影响到SLE总体的疾病活动度变化。     

EBV及HPV感染与宫颈癌相关性研究

目的：探讨人乳头瘤病毒（HPV）与EBV与宫颈癌的相关性。方法：分别取宫颈炎（32）和宫颈鳞癌患者组织标本（52）共84例,采用PCR方法对EBV和HPV DNA进行检测。结果：宫颈癌组HPV DNA、和EBV的阳性表达率分别为96.15％和69.23％,显著高于正常宫颈炎组3.13％和0,差异有统计学意义（P〈0.05）;宫颈癌组HPV DNA和EBV混合感染率为67.31%,显著高于对照组,差异有统计学意义（P〈0.05）。宫颈癌组患者分化程度：低分化组患者HPV＋EBV阳性表达率高于高中分化组（P＜0.05）;临床分期：Ⅲ＋Ⅳ期患者HPV＋EBV阳性表达率高于Ⅰ＋Ⅱ期患者（P＜0.05）;临床分型：浸润型患者HPV＋EBV阳性表达率高于其他三型患者（P＜0.05）;淋巴转移：淋巴转移组患者HPV＋EBV阳性表达率高于无淋巴转移组（P＜0.05）。且HPV（＋）＋EBV（＋）患者的存活率明显低于HPV（＋）组患者和EBV（＋）组患者（P＜0.05）。结论：在宫颈癌组织中EBV及HPV有较高的感染率,且HPV＋EBV＋感染与宫颈癌分化程度、临床分期、分型、淋巴转移及预后密切相关。     

姜黄素提高白血病KG1a细胞对同种异体NK细胞杀伤的敏感性及其分子机制探讨

目的：研究姜黄素作用前后白血病KG1a细胞对同种异体自然杀伤（NK）细胞杀伤的敏感性变化,并初步探讨其分子机制。方法：以对同种异体NK细胞杀伤高度敏感的白血病K562细胞为对照,乳酸脱氢酶释放法检测KG1a细胞对同种异体NK细胞杀伤的敏感性,流式细胞仪检测细胞表面NKG2D配体（MICA/B、ULBP1、ULBP2、ULBP3）和HLA-Ⅰ类分子蛋白表达,逆转录PCR法检测细胞表面NKG2D配体和HLA-Ⅰ基因mRNA的表达水平。CCK-8法检测姜黄素对KG1a细胞半数抑制量（IC50）,以此含量作用KG1a细胞,再次乳酸脱氢酶释放法检测姜黄素作用后的KG1a对同种异体NK细胞杀伤的敏感性,流式细胞仪检测姜黄素作用后的KG1a细胞表面NKG2D配体和HLA-Ⅰ类分子蛋白表达水平。结果：与K562细胞比较,KG1a细胞对同种异体NK细胞杀伤呈低度敏感,KG1a细胞表面NKG2D各配体蛋白表达阳性率均明显低于K562细胞（P〈0.01）,HLA-Ⅰ蛋白表达阳性率则明显高于K562细胞（P〈0.01）;在mRNA水平两种白血病细胞表面均有NKG2D配体和HLA-Ⅰ基因表达。当效靶比为5∶1、10∶1、20∶1时,姜黄素作用后NK细胞对KG1a细胞杀伤率明显高于作用前（P〈0.01）;作用后KG1a细胞各NKG2D配体表达率均明显升高（P〈0.05或0.01）,HLA-Ⅰ类分子无明显变化（P〉0.05）。结论：姜黄素能提高KG1a细胞对同种异体NK细胞杀伤的敏感性,其机制可能与姜黄素提高KG1a细胞表面NKG2D配体的表达有关。     

流式细胞术检测NK细胞活性在获得性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症诊断中的应用

本研究目的旨在建立一种准确、稳定的NK细胞杀伤活性检测方法,应用于获得性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症诊断。21例疑似患者及20例健康对照者纳入本研究。根据HLH-2004标准将疑似患者分为确诊组和排除组,将pEGFP—N1质粒转染人NK细胞的天然靶细胞K562,经过G418筛选后进一步单克隆,得到稳定、均一表达绿色荧光蛋白的EGFP—K562细胞,将EGFP—K562细胞与人外周血单个核细胞按10：1的比例混合孵育2小时后,用碘化丙啶（PI）标记,用流式细胞仪分析呈红、绿色荧光的细胞数,最后计算NK细胞的杀伤效率;同时采用LDH释放法测定外周血NK细胞对单纯K562细胞的杀伤活性,并进行比较。结果表明：获得了稳定表达绿色荧光蛋白的EGFP—K562细胞;流式细胞仪检测表明健康人NK细胞杀伤率与病人组之间存在明显差异,流式细胞仪技术检测NK细胞杀伤活性与传统LDH释放法检测NK细胞杀伤活性具有显著相关性。结论：EGFP—K562细胞株作为靶细胞用于流式细胞术检测NK细胞杀伤活性,无需预先染色和标记靶细胞,操作简便、省时、稳定、重复性高,可应广泛应用于获得性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症诊断。     

43例多发性骨髓瘤骨髓EB病毒DNA检测

目的用荧光定量PCR方法检测急性白血病（AL）与多发性骨髓瘤患者（MN）骨髓中EBV—DNA含量,并探讨其临床意义。方法采用荧光定量PCR技术检测38例急性白血病与43倒多发性骨髓瘤患者EBV感染情况,同时检测了32例对照组小细胞低色素性贫血和巨幼细胞性贫血患者骨髓EBV—DNA含量。结果多发性骨髓瘤患者EBV感染率为58．1％,急性白血病组EBV感染率为8．0％,对照组EBV感染率6．2％。AL组与对照组EBV—DNA阳性率无显著性差异（P〉0．05）,MM组与对照EBV—DNA阳性率有显著性差异（P〈0．01）,MM组与AL组EBV—DNA阳性率有显著性差异（P〈0．01）。结论AL患者的发病与EB病毒感染关系不大,MM患者的发病与EB病毒感染有关;应用荧光定量PCR方法对MM患者骨髓中,EBV—DNA舍量进行检测,对于揭示MM的发病与EBV感染之间的相关性提供了敏感可靠的检测方法。