细胞自噬在迷迭香酸促进鼻咽癌细胞凋亡中的作用研究

目的 观察迷迭香酸(RA)对人鼻咽癌CNE-1细胞增殖、凋亡的影响,并探讨自噬在其中的作用.方法 将体外培养的CNE-1细胞分别用不同浓度RA(0、20、40、80μmol/L)处理48 h,CCK-8法检测细胞增殖,Annexin V-PE/7-AAD染色流式细胞仪检测细胞凋亡,蛋白质印迹技术法检测自噬相关蛋白LC3...     

Bcl-2抑制剂S1诱导的卵巢癌细胞凋亡对自噬影响的实验研究

【目的】 凋亡与自噬密切相关,但二者之间的关系尚需进一步探究。本研究利用Bcl-2抑制剂S1建立卵巢癌细胞(SKOV3)凋亡模型,初步探究S1诱导的SKOV3细胞中凋亡对自噬的影响。 【方法】 培养SKOV3细胞。用MTT法检测S1对细胞生存率的影响。用流式细胞术检测细胞凋亡率。用蛋白质印迹方法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase3和自噬相关蛋白Beclin1、LC3的变化。用免疫荧光技术检测Beclin1及LC3蛋白的表达情况。在S1作用的基础上,应用广谱caspase抑制剂Z-VAD抑制caspase后,检测SKOV3细胞中自噬相关蛋白Beclin1、LC3的变化。 【结果】 S1能够降低SKOV3细胞的生存率;增加SKOV3细胞的凋亡率。与对照组(0 h)相比,S1组(2、4、8、12、24、48 h)中的Bcl-2蛋白表达持续降低,Bax及caspase3蛋白表达持续增高,呈现出明显的时间依赖性;S1组(2、4、8、12、24、48 h)中自噬的发生也呈时间依赖性,但自噬并不是持续增强的,在12 h时,自噬相关蛋白Beclin1和LC3蛋白表达水平最高,12 h后则呈下降趋势,Beclin1和LC3的荧光结果也表现出一致的现象。与S1单独作用(8、24 h)相比较,给予广谱caspase抑制剂Z-VAD,8 h结果显示 Beclin1及LC3蛋白的表达水平基本无变化,而24 h结果显示Beclin1及LC3蛋白的表达水平显著增高,同时荧光实验也显示出同样的结果。 【结论】 在SKOV3细胞中,S1通过抑制Bcl-2、促进Bax释放,诱导细胞发生凋亡,并呈时间依赖性增强。同时S1通过抑制Bcl-2,释放自噬起始基因Beclin1,诱导自噬发生。但是自噬并未始终呈时间依赖性增强,自噬水平在S1长时间作用下反而出现下降的趋势。据此推测,随着S1诱导凋亡的不断增强,大量活化的caspase可能通过裂解自噬起始基因Beclin1,从而抑制Beclin1诱导的自噬。     

飞燕草素通过AKT/mTOR通路诱导HER-2+乳腺癌细胞自噬

目的：研究飞燕草素对HER-2+乳腺癌细胞MDA-MB-453自噬的诱导作用及其分子机制。方法：以不同浓 度飞燕草素处理MDA-MB-453细胞,CCK-8检测细胞增殖情况;TdT介导的脱氧尿嘧啶缺口末端标记(TdT-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)和Western印迹检测细胞凋亡和与凋亡相关蛋白的表达;荧光斑点、免疫荧光和Western 印迹检测自噬的诱导情况和诱导机制。 结果：飞燕草素抑制MDA-MB-453细胞增殖,增加TUNEL阳性细胞数,下调 caspase-3 和caspase-9蛋白活性,上调裂解的caspase-3和裂解的caspase-9蛋白活性。飞燕草素增加GFP-LC3荧光斑点数、 LC3免疫荧光斑点数、LC3-II和ATG5蛋白表达。飞燕草素下调mTOR通路蛋白AKT,mTOR,eIF4E和p70s6k蛋白活 性。结论：飞燕草素诱导HER-2+乳腺癌细胞MDA-MB-453凋亡的同时通过抑制AKT/mTOR通路诱导细胞自噬。     

AKT抑制剂对鼻咽癌细胞株CNE1的放疗增敏作用

【目的】 探讨Akt抑制剂124005对人鼻咽癌细胞CNE1放射增敏效应及其潜在机制。【方法】 CCK8法检测不同浓度124005对人鼻咽癌CNE1细胞的抑制作用,计算IC50值,选择低于IC50的药物浓度作为增敏浓度,集落形成实验检测放射线加或不加124005以及124005+放射线组联合或不联合自噬抑制剂3-MA对CNE1细胞生存曲线的影响,间接免疫荧光法检测γ-H2AX观察DNA损伤修复和GFP-LC3转染CNE1中自噬标志物LC3的聚集,流式细胞术检测细胞周期分布和凋亡、免疫印迹法(Western blot)检测Caspase-3、PARP、Beclin 1和LC3-Ⅱ的表达,并检测AKT及下游信号通路的表达,探索Akt抑制剂124005放射增敏效应及其潜在机制。【结果】 124005对CNE1 IC50值为30.5 μmol/L。集落形成实验显示,DEF值放疗+8 μmol/L 124005持续用药组为1.92,放疗+12.5 μmol/L 124005用药72 h组为1.12,共聚焦显微镜观察显示124005联合放疗显著增加了CNE1细胞照射后细胞核内γ-H2AX焦点的聚集和转染GFP-LC3质粒的CNE1细胞内LC3的点状聚集、流式检测124005可以明显提高放射线诱导的CNE1细胞凋亡,凋亡率最高达52.9%。Western blot显示124005可以显著抑制放射后p-AKT及下游p-GSK-3?茁和p-PRAS40的表达,增加放射引起的cleaved caspase-3和cleaved PARP以及Beclin 1和LC3-Ⅱ的表达,应用3-MA可降低124005处理后LC3-Ⅱ的表达水平?放射+124005再联用3 mmol/L 3-MA组的DEF值为1.69,明显低于单纯放射+124005组(DEF=1.97)。 【结论】 124005通过对AKT以及下游通路的抑制,抑制DNA损伤修复,同时增加凋亡和自噬来起到对CNE1细胞株放射增敏的效应。     

木犀草素促进鼻咽癌细胞凋亡和自噬的机制

目的：探讨木犀草素对鼻咽癌细胞增殖、凋亡和自噬的影响及可能的分子机制。方法：四氮唑蓝盐化合物(MTS法)检测木犀草素对人鼻咽癌细胞CNE-1增殖的作用。流式细胞法检测细胞凋亡,透射电镜观察细胞自噬小体,Western印迹检测木犀草素对CNE-1细胞凋亡抑制蛋白(Bcl-2)和自噬相关蛋白[自噬效应蛋白(Beclin-1)、微管相关蛋白轻链3蛋白(LC3B)、泛素结合蛋白(p62)]表达的变化并检测磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)蛋白磷酸化水平,检测PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白。结果：木犀草素可抑制CNE-1细胞活力,呈浓度和时间依赖性(P<0.05),同时木犀草素与对照组相比凋亡率增加(P<0.05)。透射电镜结果显示,木犀草素干预CNE-1细胞后,随着药物浓度的增加,细胞内自噬体出现不同程度的增加。Western印迹法结果显示,与对照组比较,木犀草素处理组细胞Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表达上调(P<0.05),Bcl-2、p62、磷酸化磷脂酰肌醇(p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)和磷酸化...     

细胞自噬在三氧化二砷诱导肝癌细胞凋亡中的作用研究

【摘要】 目的 研究细胞自噬在三氧化二砷（ATO）诱导的肝癌细胞死亡中的作用,观察调控细胞自噬对ATO诱导的细胞凋亡有何影响。方法 以人肝癌HepG2细胞为研究对象,在ATO作用于HepG2细胞的基础上,加入自噬激动剂〔雷帕霉素（Rap）〕和自噬抑制剂〔三甲基腺嘌呤（3-MA）〕进行调控。以MTT法检测细胞生存率,透射电镜观察自噬体结构,免疫印迹法分析自噬相关蛋白LC-3和Beclin1的表达;流式细胞术检测细胞凋亡。结果 5~20 μmol/L ATO与10 mmol/L 3-MA联用时HepG2细胞存活率比同剂量ATO单独作用时降低（P <0.05）,凋亡率增加（P <0.05）,细胞内呈现典型凋亡反应特征,自噬蛋白LC3和Beclin1表达低于ATO单独作用组（P <0.05）。相反,5~20 μmol/L ATO与0.25 μmol/L Rap联用时,HepG2细胞的存活率比ATO单独作用时显著增加（P <0.05）,凋亡率降低（P <0.05）,细胞内出现大量自噬体结构,自噬蛋白LC3和Beclin1的表达较ATO单独作用组有增加趋势,但差异无统计学意义（P >0.05）。结论 特异性自噬抑制剂能显著增强ATO杀伤肝癌细胞的敏感性,其机制与增强肝癌细胞凋亡有关。     

ApoG2联合放疗对鼻咽癌CNE-2细胞自噬与凋亡的影响研究

目的探讨ApoG2联合放射治疗对鼻咽癌(NPC)的CNE-2细胞自噬与凋亡的影响。方法将人NPC CNE-2细胞株分成空白对照组(仅加培养液,不加细胞)、放射治疗组、ApoG2组、联合组(放射+ApoG2),采用CCK-8法测定ApoG2+放射治疗对细胞增敏的作用,Hoechst 33258染色观察细胞凋亡形态的变化,吖啶橙染色观察细胞自噬形态变化,检测细胞凋亡率的变化;Western bolt检测Beclin1、Bcl-2蛋白的表达情况变化。结果不同的放射剂量组间细胞增殖抑制率比较具有显著性差异(P<0.01),随着放射剂量的增加,鼻咽癌CNE-2细胞的抑制率也随之上升;不同的ApoG2药物浓度组间细胞增殖抑制率比较差异也具有显著性意义(P<0.01),随着药物浓度的增加,鼻烟癌CNE-2细胞的抑制率也上升。4组CNE-2细胞的凋亡率组间比较具有显著性差异,联合组凋亡率显著高于其他3组(F=140.2,P<0.01)。4组的Bcl-2、Beclinl的蛋白表达量组间比较差异具有统计学意义(Bel-2:F=71.24,P<0.01;Beclinl:F=107.53,P<0.01),其中联合组的Bcl-2蛋白表达量最低,Beclinl的蛋白表达量最高。结论ApoG2联合放疗能够通过诱导鼻咽癌CNE-2细胞的自噬与凋亡,从而抑制CNE-2细胞的增殖。     

选择性MAO-B抑制剂TM-5对胶质瘤U87细胞自噬和凋亡的影响

目的 探讨选择性单胺氧化酶B(MAO-B)抑制剂TM-5对胶质瘤U87细胞体外自噬及凋亡的影响。方法 正常培养胶质瘤细胞株U87,随机分为6组：对照组不做处理,5、10、25、50、100μmoL/L TM-5组分别予以5、10、25、50、100μmoL/L TM-5处理细胞,每组设3个复孔。采用噻唑蓝（MTT）法检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡;实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测促凋亡蛋白Bcl-2相关蛋白X(Bax)、抑凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)的基因表达;蛋白质免疫印迹（WB）检测细胞凋亡相关蛋白Bax和切割后半胱氨酸蛋白酶3(cleaved caspase-3)以及自噬相关标志蛋白Beclin-1、自噬相关蛋白1轻链-Ⅱ（LC3-Ⅱ）和P62表达。结果 与对照组比较,10、25、50、100μmoL/L TM-5组U87细胞存活率降低（P <0.05）,选取5、10、25μmoL/L TM-5组（细胞存活率>50%）进行后续实验。与对照组比较,10、25μmoL/L TM-5组相对细胞凋亡率、细胞中LC3-Ⅱ和Bax蛋白相对表达量升高,...     

内质网应激自噬参与葫芦素E诱导的结肠癌细胞凋亡

【摘要】目的 观察内质网应激和自噬反应对葫芦素E（CuE）诱导人结肠癌细胞系HT 29凋亡的作用。方法 采用0001、001、01、1、10 μmol/L的CuE分别处理培养的HT 29细胞24、48及72 h,对照组仅用DMEM培养液。Annexin V FITC/PI双染色流式细胞分析法检测细胞凋亡,蛋白免疫印迹法检测内质网应激相关蛋白CHOP、Grp78以及自噬相关蛋白Beclin1、LC3表达水平。结果 Annexin V FITC/PI双染色流式细胞分析结果表明,随着CuE浓度升高,作用时间延长,凋亡细胞占总细胞比例明显升高（P＜005）,呈时间与剂量依赖性。蛋白印迹分析结果显示,用CuE处理HT 29细胞24 h后,与对照组相比,内质网应激相关蛋白CHOP及Grp78蛋白表达明显升高（P＜005）,自噬相关蛋白Beclin1表达逐渐增（P＞005）,胞浆型LC3（LC3 Ⅰ）发生酶解,转变为自噬体膜型LC3 Ⅱ,且LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值大小呈现出先上升（P＜005）后下降（P＞005）的趋势。结论 内质网应激和自噬反应参与介导了CuE引起的人结肠癌细胞HT 29凋亡,其可能是CuE诱导结肠癌细胞凋亡的重要途径。     

塞来昔布对人鼻咽癌细胞凋亡的促进作用

目的 研究塞来昔布对人鼻咽癌CNE细胞凋亡的促进作用.方法 以人鼻咽癌细胞株CNE为研究对象,设实验组（加入塞来昔布20mmol/L）及对照组,培养48h后,制备成超薄切片透射电镜观察塞来昔布对细胞凋亡的影响.取不同浓度塞来昔布（0 ×10-5mol/L、1.0 ×10-5mol/L、2.0 ×10-5mol/L、4.0 ×10-5mol/L）处理细胞,用流式细胞仪检测细胞周期分布及凋亡.TUNEL（DNA末端原位标记染色法）荧光染色法检测CNE细胞凋亡,计算凋亡率%=凋亡阳性细胞数/100个CNE细胞.结果 给予塞来昔布48 h后,透射电镜下CNE细胞染色质固缩边集,细胞器肿胀,胞浆内可见凋亡小体形成.流式细胞学结果显示塞来昔布对CNE细胞周期分布的影响S期细胞减少,G1期细胞增加,经浓度分别10mmol/L、20mmol/L、40mmol/L塞来昔布处理48h,随浓度增大,凋亡率增加.TUNEL结果显示：实验组凋亡细胞明显增多,CNE细胞凋亡百分比（4.3±2.21）%,明显高于对照组（0.9±0.99）%,差异有统计学意义（P〈0.01）.结论 本实验将塞来昔布作用于人鼻咽癌细胞株CNE细胞后,运用电镜观察到凋亡细胞增加.不同浓度的塞来昔布作用于人鼻咽癌细胞株CNE细胞后,流式细胞术、TUNEL荧光染色均证明环氧合酶-2抑制剂塞来昔布对凋亡有促进作用,塞来昔布（特异性环氧合酶-2抑制剂）已被认为肿瘤治疗新靶标,可为临床的肿瘤治疗提供新的方法.     

17-丙烯胺基-17-去甲氧基格尔德霉素诱导鼻咽癌细胞凋亡的实验研究

目的:研究17-丙烯胺基-17-去甲氧基格尔德霉素(17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin,17-AAG)对人鼻咽癌细胞株(Human nasopharyngeal carcinoma cell line,HNE1)增殖抑制和诱导凋亡的作用,探讨17-AAG在鼻咽癌临床治疗中的意义。方法:采用噻唑蓝(Thiazolyl blue,MTT)检测17-AAG对HNE1细胞的增殖抑制作用,流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化,Hoechst33528染色观察细胞的凋亡形态学变化并进行核碎片计数。结果:17-AAG抑制HNE1的增殖,诱导了细胞的凋亡,抑制作用具有浓度和时间依赖性。结论:17-AAG可诱导HNE1的凋亡,研究结果对药物治疗鼻咽癌有一定的临床指导意义。     

复发性鼻咽癌的自发及放疗后凋亡观察

目的：观察24例复发性鼻咽癌的自发与放疗后凋亡及分裂指数。方法：第一病例均观察放疗前和复发后的病理切片,光镜下计数凋亡指数和分裂指数。结果：结果表明,鼻咽癌的自发凋亡指数为0．55％,分裂指数为0．36％。放疗后复发时凋亡指数为0．63％,分裂指数为0．40％。结论：与其它肿瘤相比,．鼻咽癌属于低凋亡指数肿瘤,复发时凋亡指数和分裂指数与治疗前相比无明显差别。凋亡指数在鼻咽癌预后因素中的作用尚需进一步研究。     

鼻咽癌组织中X 连锁凋亡抑制蛋白及caspase-3 和Smac /DIABLO 的表达及意义

目的采用组织芯片技术研究鼻咽癌组织中X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)、caspase-3与其拮抗蛋白Smac/DIABLO的表达及其意义。方法以50例鼻咽癌患者鼻咽部活体组织石蜡标本和20例鼻咽部慢性炎症组织石蜡标本为研究对象,利用组织芯片技术同时采用SP免疫组织化学方法检测鼻咽癌组织芯片中XIAP、caspase-3和Smac/DIAB-LO的表达。结果鼻咽癌组织中XIAP的阳性表达高于鼻咽部慢性炎症组织,caspase-3和Smac/DIABLO的阳性表达明显低于鼻咽部慢性炎症组织,差别均有统计学意义(P<0.05)。XIAP阳性的鼻咽癌石蜡标本Smac/DIABLO阳性表达率低于XIAP阴性的鼻咽癌石蜡标本Smac/DIABLO阳性表达率,鼻咽癌组织中XIAP与Smac/DIABLO表达呈负相关(P<0.05)。结论 XIAP在鼻咽癌中高表达,caspase-3、Smac/DIABLO在鼻咽癌中低表达,鼻咽癌中XIAP和Smac/DI-ABLO表达呈负相关。XIAP、caspase-3和Smac/DIABLO可能是鼻咽癌细胞凋亡信号传导网络中的重要一环,与鼻咽癌的发生、发展密切相关。     

Pro-apoptotic effect of cecropin AD on nasopharyngeal carcinoma cells

Nasopharyngeal carcinoma （NPC） is one of the highly prevalent malignancies in Southeast Asia. Chemotherapy and radiotherapy are commonly administrated to treat nasopharyngeal carcinoma, but these therapies can not prevent the recurrence and metastasis of tumor cells. Furthermore, these therapies have severe side effects. Therefore, it is important to find a more effective therapy, e. g., a gene therapy for treatment of nasopharyngeal carcinoma. Cecropin AD （Cad） is a hybrid peptide that exhibits higher antibacterial activity than natural cecropin. It consists of 1-11 amino acid residues in the N-end of cecropin A and 12-37 amino acid residues in the c-end of cecropin D. The role of Cad in the malignant cells remains unclear. In this study, the Cad gene was cloned and transferred into NPC CNE2 cells and its pro-apoptotic effect were investigated.     

白藜芦醇阻断信号通路对鼻咽癌细胞生长的影响

目的 通过体内和体外研究探讨白藜芦醇在人核孔复合物细胞（NPC）中的抗癌活性。方法 用 MTT 实验检测白藜芦醇对CNE-1 细胞和CNE-2Z 细胞（两种具有不同分化程度的NPC 细胞株）生长增殖 的影响。用流式细胞仪检测白藜芦醇诱导NPC 细胞凋亡情况和NPC 细胞周期分布变化。Western blot 检测 涉及细胞凋亡调控的数个重要基因和与细胞周期调控有关的数种Cyclins 的蛋白表达水平。在裸鼠体内进行 CNE-2Z 细胞移植瘤实验。结果 用白藜芦醇处理NPC 细胞后，白藜芦醇不仅以时间和剂量依赖的方式降低 NPC 细胞的增殖能力，还可以剂量依赖的方式诱导NPC 细胞的凋亡。流式细胞仪分析结果表明，白藜芦醇处 理可将NPC 细胞生长阻滞于S- 期和G2/M- 期。白藜芦醇处理可下调Bcl-2 和低氧诱导因子1（HIF-1）蛋白 的表达，上调Caspase-3 蛋白表达。此外，白藜芦醇处理不仅可以降低蛋白激酶B（Akt）、p70 核糖体S6 蛋白激 酶（p70S6K）和真核翻译起始因子4E- 结合蛋白1（4E-BP-1）的磷酸化水平，也可降低参与细胞周期调控的 数个细胞周期蛋白（Cyclins）的表达水平。白藜芦醇可抑制裸鼠体内NPC 移植瘤的生长，进一步确认白藜芦醇 对NPC 生长的治疗效果。结论 在人NPC 细胞株中，白藜芦醇可能是通过干扰Akt/p70S6K 信号通路而发挥有 效的抗增殖和促凋亡作用。     

诱导性一氧化氮抑制剂对鼻咽癌CNE-2细胞株作用的探讨

目的 观察诱导性一氧化氮合酶(iNOS)抑制剂S-甲基异硫脲(SMT)是否对鼻咽癌细胞株CNE-2有抑制细胞增殖的能力和促进凋亡的能力,探讨SMT对顺铂(DDP)的抗CNE-2细胞作用是否存在增敏效应及其分子机制.方法 选用鼻咽癌细胞株CNE-2作为研究对象,以A549作为对照,R.T-PCR测试CNE-2是否表达iNOS.用不同浓度的SMT、DDP和二者联合干预CNE-2细胞后,MTT试验及集落形成实验观察其对细胞活力的影响.Hoechst33258染色观察细胞凋亡的形态学变化.流式细胞仪检测细胞凋亡的水平.硝酸还原酶法测NO的含量.结果 以iNOS高表达的肺癌细胞株AS49为阳性对照,CNE-2细胞证实为iNOS阳性表达.SMT能以浓度依赖性的方式有效地抑制CNE-2细胞的增殖.0.5μmol/mL的SMT与6μg/mL的DDP共同干预CNE-2细胞,较之单用SMT或DDP抑制CNE-2细胞的凋亡形态学改变明显,凋亡小体以及核固缩现象增多,早期凋亡率增多(P＜0.05).0.5μ moi/mL的SMT与6μg/mL的DDP共同干预CNE-2细胞,与正常组相比,两组NO含量的差异有显著性(P＜0.05).结论 SMT能够有效地和浓度依赖性地抑制CNE-2细胞的增殖.SMT对DDP的抗CNE-2细胞作用具有化疗增敏效应,其机制可能与NO含量有关,但具体增敏机制还有待进一步研究.