自噬在长春瑞滨诱导的肺癌细胞A549死亡中的作用

背景与目的已有的研究表明,很多药物可以诱导肿瘤细胞发生自噬。本研究旨在明确自噬在肺癌A549细胞长春瑞滨处理过程中的存在,研究自噬在长春瑞滨诱导的A549细胞死亡中的作用。方法MTT法检测细胞生存率;激光共聚焦显微镜和流式细胞仪分别定性及定量检测自噬特异性蛋白LC3的表达;AnnexinV-FITC流式细胞术检测细胞凋亡;自噬特异性阻断剂3-甲基腺嘌呤和长春瑞滨共同作用细胞后用MTT法和流式细胞术检测细胞死亡率和凋亡率的变化。结果长春瑞滨处理肺腺癌细胞早期(24h内)可出现明显的自噬性变化,自噬高峰期出现在长春瑞滨诱导(6-12)h,在长春瑞滨给药前阻断自噬,长春瑞滨对A549细胞的毒性作用增强,而在其给药后阻断自噬则长春瑞滨对A549细胞的细胞毒性作用有所减弱。结论长春瑞滨可以诱导肺癌A549细胞自噬,在长春瑞滨给药前期,自噬对细胞有保护作用,可以延迟凋亡的发生;而在长春瑞滨给药后期,自噬则作为一种细胞的的死亡程序,与凋亡一起促进细胞死亡。     

白藜芦醇对非小细胞肺癌细胞自噬和凋亡的影响

目的 探讨白藜芦醇（resveratrol,Res）对人非小细胞肺癌A549细胞自噬和凋亡的影响。方法 采用50 μmol/L白藜芦醇作用于非小细胞肺癌A549细胞（Res组）,对照组细胞用2% FBS的DMEM培养,培养24 h后采用倒置显微镜观察两组A549细胞形态的变化,激光扫描共聚焦显微镜观察细胞自噬小体的形成,Western blot检测自噬相关蛋白Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ、p62和凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、活化caspase-3的表达。结果 A549细胞培养24 h后, 倒置显微镜下可见Res组细胞形状较对照组变圆,细胞排列稀疏;激光扫描共聚焦显微镜下可观察到Res组A549细胞胞浆内大量自噬体形成。Western blot检测结果显示,与对照组比较,Res组A549细胞自噬相关蛋白Beclin 1、LC3 Ⅱ/Ⅰ表达升高（0.151±0.032 vs 0.093±0.013,P=0.011;3.644±0.122 vs 1.903±0.054,P＜0.001）,p62蛋白表达下降（0.032±0.002 vs 0.061±0.005,P=0.021）;促凋亡相关蛋白Bax、活化caspase-3表达升高（0.633±0.061 vs 0.423±0.053,P=0.011;0.154±0.004 vs 0.111±0.011,P=0.002）,而抑制凋亡蛋白Bcl-2表达下降（2.437±0.055 vs 3.503±0.138,P＜0.001）。结论 白藜芦醇可通过促进非小细胞肺癌A549细胞过度自噬而诱导细胞凋亡。     

沉默泛素结合酶E2O对人非小细胞肺癌细胞增殖和侵袭的影响

  目的  研究泛素结合酶E2O（ubiquitin-conjugating enzyme E2O,UBE2O）蛋白在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）细胞增殖、细胞周期、迁移、侵袭中的作用。  方法  通过慢病毒介导的shRNA靶向抑制人NSCLC细胞株A549中UBE2O基因的表达,应用CCK-8法、流式细胞术分别检测UBE2O对A549细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响,应用Transwell实验检测下调UBE2O表达后对A549细胞迁移、侵袭能力的影响,应用Western blot检测细胞上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）两种标志分子E-cadherin蛋白、N-cadherin蛋白和PI3K-Akt信号通路相关蛋白表达量的变化。  结果  下调UBE2O表达后,A549细胞UBE2O mRNA和蛋白表达均下调（均P < 0.01）,CCK-8实验结果显示沉默UBE2O可以抑制A549的增殖（P < 0.001）,Transwell实验显示下调UBE2O的表达能够抑制A549细胞的迁移、侵袭（均P < 0.001）。Western blot结果表明下调UBE2O的表达可使A549细胞中的E-cadherin蛋白表达水平升高、p-Akt蛋白表达水平下降。  结论  UBE2O蛋白能够促进NSCLC细胞侵袭和迁移,作用机制可能是通过诱导肺癌细胞发生EMT和促进pI3K-Akt信号通路的激活。      

氯喹促进顺铂诱导胃癌SGC7901细胞凋亡及其机制

  目的  研究自噬对顺铂（cisplatin,DDP）诱导的胃癌SGC7901细胞凋亡的影响,并初步探讨其可能机制。  方法  DDP和（或）氯喹处理胃癌SGC7901细胞,MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,MDC染色后荧光显微镜观察自噬囊泡,West. ern Blot检测自噬和凋亡相关蛋白。  结果  5 mg/L的顺铂作用于胃癌SGC7901细胞24 h,细胞凋亡率为21.07%±2.12%,同时观测到自噬囊泡增多和LC3-Ⅱ蛋白表达升高;氯喹特异性抑制自噬活性后,提高了顺铂诱导的细胞凋亡率（30.16%±3.54%,P < 0.05）;检测到凋亡相关蛋白Caspase-3和P53表达增加,Bcl-2蛋白表达下降。  结论  自噬在顺铂诱导胃癌SGC7901细胞凋亡的过程中起保护作用,氯喹抑制自噬后,可能通过激活P53蛋白及灭活Bcl-2蛋白的表达来促进细胞凋亡,联合应用顺铂和氯喹有望成为胃癌治疗的新策略。      

抑制JNK信号通路下调A549中LRP表达可增强顺铂化疗敏感性

  目的  探讨在顺铂作用下的A549细胞中JNK信号通路与肺耐药蛋白LRP之间的相互关系。  方法  用SP600125抑制JNK信号通路的活化,CCK-8法检测顺铂药物敏感性,流式细胞术检测细胞凋亡率,用Western blotting法检测LRP、JNK、P-JNK的表达。  结果  顺铂可活化JNK信号通路,上调LRP的表达;用SP600125抑制JNK信号通路后,LRP的表达下调,增强了顺铂化疗敏感性,促进了细胞凋亡。  结论  在A549细胞中,活化的JNK信号通路上调LRP的表达促进化疗耐药,因此阻断JNK信号通路为肺癌提供新的治疗靶点。      

FUNDC1调控肺癌A549细胞及其干细胞的生长、自噬、凋亡和细胞干性的研究

目的:本实验旨在阐明线粒体自噬受体蛋白FUNDC1(FUN 14 domain containing 1)在肺癌病理进程中对肿瘤细胞生长死亡以及细胞干性的调控作用。方法:使用RT-qPCR分析FUNDC1在肺癌组织和细胞中的表达情况。siRNAs和过表达载体转染A549细胞以及诱导形成的A549干细胞团(A549/CSC)。采用CCK-8增殖试剂盒及集落形成实验分析不同处理对肺癌细胞增殖的影响。Western blotting检测FUNDC1、细胞自噬相关蛋白(Beclin-1、LC3-Ⅱ、p62)、凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2、caspase3)和细胞干性相关蛋白(CD133、Sox2、Oct4)的表达。细胞凋亡试剂盒(Elisa)用于测定细胞凋亡水平。流式细胞术分析CD133细胞阳性率。结果:FUNDC1在肺癌组织及细胞中表达上调,干扰FUNDC1抑制A549细胞增殖和保护性自噬,同时诱导细胞凋亡。此外,FUNDC1与CD133表达显著正相关,干扰FUNDC1可显著抑制细胞干性相关基因CD133、Sox2、Oct4的表达。A549/CSC细胞的FUNDC1表达高于正常A549细胞。干扰FUNDC1同样会抑制A549/CSC细胞增殖和保护性自噬,促进细胞凋亡。结论:FUNDC1调控肺癌细胞及CSC细胞的生长、自噬、凋亡及细胞干性。     

rm hTNF-α联合吉西他滨杀伤人肺腺癌细胞A549作用研究

背景与目的 目前,晚期非小细胞肺癌患者化疗效果已达平台,生物治疗与化疗联合使用可明显改善此类患者的治疗效果.本课题旨在研究rmhTNF-α联合吉西他滨对人肺腺癌细胞A549的杀伤作用及其作用机制.方法 应用CCK-8法检测不同浓度rmhTNF-α及吉西他滨对A549细胞抑制率,应用细胞生长曲线描述经rmhTNF-α、吉西他滨干预过的A549细胞增殖情况,应用流式细胞仪检测各药物处理组48 h的细胞周期分布及凋亡率,并用光学显微镜及透射电子显微镜观察A549细胞形态及超微结构.结果 CCK-8检测结果及细胞生长曲线均提示rmhTNF-α不仅具有抑制A549细胞生长作用,而且可以增强吉西他滨对A549细胞杀伤作用;FCM显示两药联合组可促使A549细胞阻滞在S期,降低G2/M期比率;凋亡比率以吉西他滨 rmhTNF-α组最明显,光镜及电镜下观察结果均能明显观察到A549细胞呈凋亡形态学改变.结论 rmhTNF-α通过诱导人肺腺癌细胞A549细胞凋亡及细胞周期阻滞,从而增强吉西他滨对其的杀伤作用.     

MLN4924促进人肺腺癌细胞株A549凋亡的机制研究

  目的  观察MLN4924对人肺腺癌A549细胞增殖、凋亡的影响,探讨MLN4924促进凋亡的作用机制。  方法  不同浓度的MLN4924作用细胞不同时间后,采用CCK-8检测细胞增殖抑制率;Hoechst33342荧光染色、流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期;Western blot检测凋亡相关蛋白Caspase-3、NF-κB p65及CDT1相对表达量。  结果  MLN4924能够明显抑制A549细胞的增殖,并且具有浓度和时间依赖性。流式细胞仪检测结果显示药物作用后,细胞被阻滞在S期。Western blot结果显示药物作用后细胞内Caspase-3、CDT1蛋白的表达量增加,而NF-κB p65的表达量减少。  结论  MLN4924能够明显抑制A549细胞增殖、促进细胞凋亡,其相关机制为MLN4924可阻滞细胞于S期,增加Caspase-3蛋白表达,抑制NF-κB通路的激活。      

自噬在眼镜蛇神经毒素诱导A549细胞死亡中的作用

背景与目的已有的研究表明眼镜蛇神经毒素具有抗肿瘤作用,而其在肺癌中的作用罕有研究。本研究观察cobrotoxin对人肺A549腺癌细胞株的抗肿瘤作用,探讨自噬和P38-MAPK通路在这过程中的作用。方法应用MTT法观察cobrotoxin对A549细胞和HFL1人肺成纤维细胞的生长抑制作用以及用3-MA抑制自噬、SB203580抑制P38-MAPK通路后cobrotoxin对A549细胞的生长抑制作用;应用细胞集落平板克隆实验检测cobrotoxin对A549细胞的集落形成的影响;蛋白免疫印迹法(Western blot)测定单独cobrotoxin作用、cobrotoxin分别联合3-MA抑制自噬和SB203580抑制P38-MAPK通路活性后A549细胞内beclin-1、LC3、P62、P38及pP38等蛋白表达水平。结果不同浓度cobrotoxin对A549细胞的生长有明显抑制作用,对HFL1人肺成纤维细胞无明显抑制作用,3-MA、SB203580作用后cobrotoxin对A549细胞的抑制作用降低;不同浓度cobrotoxin可明显抑制A549细胞的集落形成;cobrotoxin作用后beclin-1、pP38蛋白表达水平明显提高,P62表达明显降低,II型/I型LC3比值增大,并有浓度依赖性,3-MA抑制自噬后beclin-1蛋白表达水平降低,P62表达增高、II型/I型LC3比值减小,SB203580抑制P38-MAPK通路后beclin-1、pP38蛋白表达水平降低,II型/I型LC3比值减小。结论 cobrotoxin对人肺A549腺癌细胞体外生长有抑制作用,可能通过活化P38-MAPK通路激活自噬参与抗肿瘤过程。     

MEX3A在非小细胞肺癌中的表达与功能研究

  目的  探究MEX3A基因在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中的表达水平及沉默MEX3A基因后对NSCLC增殖、侵袭、迁移和凋亡及周期的影响。  方法  通过mRNA转录组分析及癌症基因图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库信息分析，筛选出在NSCLC中显著高表达的MEX3A基因。通过qRT-PCR检测MEX3A在4种常见NSCLC细胞系中的mRNA表达水平，发现MEX3A在A549和NCI-H292中显著高表达。利用RNA干扰技术（RNA interference，RNAi）沉默A549和NCI-H292中MEX3A的表达，CCK8及Transwell试验检测沉默MEX3A表达后对NSCLC增殖、侵袭及迁移的影响，流式细胞术分析沉默MEX3A表达后对A549和NCI-H292细胞周期及凋亡的影响。  结果  MEX3A在A549和NCI-H292中高表达。沉默MEX3A后NSCLC增殖、侵袭及迁移被显著抑制，细胞周期阻滞于G2/M期，促进细胞凋亡。  结论  MEX3A作为NSCLC的促癌基因，参与了NSCLC的生长及增殖过程。      

Entinostat影响NK细胞对非小细胞肺癌杀伤作用的体外研究

  目的  观察Entinostat对非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）细胞A549和HCC-827表面NKG2D配体表达的影响，比较经Entinostat处理前后A549和HCC-827细胞对NK细胞杀伤作用的敏感性。  方法  通过MTT法检测Entinostat对A549和HCC-827细胞增殖的影响，流式细胞术检测NKG2D配体表达的变化，RT-PCR检测配体在mRNA水平的变化，并用ELISA检测细胞培养上清中可溶性MICA的含量。乳酸脱氢酶释放实验检测Entinostat作用后的A549和HCC-827细胞对NK细胞杀伤作用的敏感性。  结果  Entinostat对A549和HCC-827细胞的生长抑制作用具有时间-剂量依赖性。以0.5、1 μmol/L Entinostat诱导A549和HCC-827细胞48h后，细胞表面NKG2D配体表达水平升高，MICA和MICB的mRNA转录水平升高。1 μmol/L Entinostat提高了A549细胞培养上清中可溶性MICA表达水平。0.5、1 μmol/L Entinostat增强了HCC-827细胞对NK细胞杀伤作用的敏感性。  结论  Entinostat通过上调NSCLC NKG2D配体的表达，提高NK细胞对NSCLC的杀伤作用，为探讨NSCLC的治疗提供了新的方法和理论依据。      

Hsa-miR202通过下调IL-10的表达抑制肺癌A549细胞的增殖

  目的  探讨Hsa-miR202(人微小非编码RNA-202)对肺癌A549细胞增殖的影响及分子机制。  方法  将Hsa-miR-202序列与ppG/miR/eGFP/Blasitidin质粒定向连接, 构建靶向Hsa-miR-202基因的真核表达载体pmiR-202, 运用脂质体将pmiR-202转染至A549细胞, WST-8法检测细胞增殖率, RT-PCR检测IL-10、miR-202的相对表达水平, Western blot与ELISA检测IL-10蛋白的表达水平, 构建荧光素酶报告基因载体验证miR-202与IL-10的相互结合作用。  结果  经DNA测序证实与设计完全一致, 测序结果显示成功构建了miR-202的真核表达载体(pmiR-202), pmiR-202对A549细胞的增殖抑制率(24、48、72 h)分别为12%、38%、52%, 并具有时间效应关系, 较空白对照组及阴性对照组比较, 差异有统计学意义(P < 0.05);RT-PCR结果显示, 转染pmiR-202后, miR-202的表达水平增加; 过表达miR-202能下调IL-10基因及蛋白的相对表达水平, 其相对水平分别为25%、0.75, IL-10活性的相对表达量为3.26±0.43 pg/mL, 较空白对照组及阴性对照组比较, 差异有统计学意义(P < 0.05):荧光素酶活性结果显示, 克隆IL-10-3'UTR的质粒与miR-202 mimics共转染293T细胞, 引起荧光素活性的减低。  结论  pmiR-202有效抑制A549细胞的增殖, 并具有时间-效应关系, 其机制可能是miR-202通过靶向结合IL-10的3'UTR从而下调其在A549细胞的表达有关。      

细胞因子诱导的杀伤细胞逆转耐顺铂肺腺癌细胞系A549/DDP耐药性的研究

  目的  观察细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer, CIK)对耐顺铂(DDP)人肺腺癌细胞系A549/DDP的耐药逆转作用及其逆转A549/DDP耐药的可能机制。  方法  A549/DDP与CIK细胞采用Transwell非接触共培养。四氮甲唑兰比色法(MTT法)验证A549/DDP的DDP耐药性及检测共培养前后A549/DDP对DDP耐药性的变化。RT-PCR法筛选A549与A549/DDP有差异表达的基因作为检测耐药性变化的观察指标, 并检测共培养前后A549/DDP中基因表达水平的变化; Western blot检测A549及共培养前后A549/DDP中基因蛋白水平的变化。  结果  A549/DDP的耐药系数为14.5, 具有较强的DDP耐药性。RT-PCR筛选出A549与A549/DDP表达有差异的耐药相关基因为谷胱甘肽转移酶(glutathione-S-transferase, GST-π)基因、人类铜离子转运蛋白(human copper transporter1, hCTR1)基因, A549/DDP中GST-π表达量明显增加, hCTR1表达量明显降低。与CIK细胞共培养后, A549/DDP对DDP的耐药性明显下降, 共培养20h后耐药逆转倍数约为4.93倍, 细胞内GST-π基因及蛋白水平的表达明显降低(P < 0.05)。  结论  CIK细胞对A549/DDP有逆转DDP耐药的作用, 其机制可能与下调GST-π基因及蛋白水平的表达有关。      

扶正抑瘤汤通过PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制非小细胞肺癌增殖、凋亡及自噬

目的 探讨扶正抑瘤汤对非小细胞肺癌细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡、自噬以及PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响。方法 采用不同浓度（12.5 mg/mL、25 mg/mL、50 mg/mL、100 mg/mL、200 mg/mL、400 mg/mL）扶正抑瘤汤体外培养非小细胞肺癌A549细胞, CCK-8法测定细胞增殖抑制率;Transwell小室侵袭实验检测细胞侵袭能力;划痕实验检测细胞迁移能力;流式细胞仪检测细胞凋亡率;Western blot检测细胞自噬相关蛋白以及PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白的表达水平;透射电镜下观察自噬溶酶体形成情况。结果 200 mg/mL和400 mg/mL扶正抑瘤汤作用后A549细胞增殖抑制率增加（均P<0.05）。200 mg/mL扶正抑瘤汤作用后A549细胞侵袭和迁移能力降低（均P<0.05）;细胞凋亡率增加（P<0.05）;Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白的表达水平升高（均P<0.05）,P62蛋白的表达水平降低（P<0.05）;A549细胞自噬溶酶体数量增加;p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR蛋白的表达降低（均P<0.05）。结论 扶正抑瘤汤可以抑制A549细胞增殖,并促进细胞凋亡和自噬,可能与PI3K/Akt/mTOR信号通路失活有关,是治疗非小细胞肺癌的潜在药物。     

长链非编码RNA FTH1P3靶向miR-218降低人肺癌顺铂耐药细胞对顺铂的化疗敏感性

  目的  研究长链非编码RNA铁蛋白重链1假基因3（ferritin heavy chain 1 pseudogene 3,FTH1P3）对人肺癌顺铂（cisplatin,DDP）耐药细胞株（A549/DDP）DDP化疗敏感性的影响,并探究其潜在的分子机制。  方法  采用荧光定量PCR检测FTH1P3与miR-218在A549和A549/DDP细胞中的表达。采用MTT法、流式细胞术、Hoechst 33258染色及CASP3活性试验评估细胞对DDP化疗敏感性的影响。采用荧光素酶报告基因和RNA蛋白免疫沉淀试验分析FTH1P3对miR-218的调控作用。  结果  与A549细胞相比,A549/DDP细胞中FTH1P3表达上调,而miR-218表达下调（P<0.05）。与si-NC相比,si-FTH1P3增加A549/DDP细胞对DDP的化疗敏感性,表现为半抑制浓度（IC₅₀）降低,多药耐药关联蛋白1（multidrug resistance-associated protein 1,MRP1）和ATP结合家族亚家族B成员1（ATP binding cassette subfamily B member 1,ABCB1）mRNA表达下调,细胞生长能力降低、凋亡增加及CASP3活性升高（P<0.05）。FTH1P3直接结合miR-218并抑制其表达（P<0.05）。与NC 抑制物相比,miR-218 抑制物能够逆转经si-FTH1P3处理的A549/DDP细胞对DDP的化疗敏感性（P<0.05）。  结论  FTH1P3在A549/DDP细胞中表达上调,FTH1P3降低A549/DDP细胞对DDP的化疗敏感性,其机制与miR-218表达下调有关。