大鼠纤维化肝组织高亲水性蛋白质组二维电泳条件的确定

目的 初步探讨对大鼠纤维化肝组织高亲水性蛋白质组分离技术。方法 采用蛋白质分步抽提方法和二维聚丙烯酰胺凝胶电泳技术(2—DE)。结果 确立了大鼠纤维化肝组织高亲水性蛋白质组二维电泳条件及提示了注意事项。结论 大鼠肝组织蛋白质组种类繁多，且受多种因素的影响，因此正确选择蛋白质抽提方法和二维电泳分离条件至关重要。     

白念珠菌总蛋白质组二维电泳条件的建立和优化

目的:建立并优化白念珠菌总蛋白质组分析的二维电泳条件.方法:以白念珠菌国际标准菌株SC5314为材料,制备其总蛋白质组样品.以真菌细胞破碎方法、裂解液成分、上样量、固相pH梯度胶条的选择为侧重点,通过不同条件下电泳图谱的比较建立最佳二维电泳技术条件.结果:成功建立白念珠菌总蛋白质制备方法,优化了白念珠菌蛋白质组分析的二维凝胶电泳技术,获得重复性和分辨率都较理想的白念珠菌总蛋白质二维电泳图谱.结论:优化后的二维电泳条件符合白念珠菌的特点,为白念珠菌蛋白质组分析奠定基础.     

2型糖尿病患者唾液双向电泳图谱的建立和分析

目的:建立2型糖尿病患者唾液蛋白质双向电泳图谱,观察2型糖尿病患者与正常人唾液蛋白质差异表达情况.方法:以优化的双向电泳技术分离唾液蛋白质,银染后用专业软件进行分析,建立2型糖尿病患者与正常人唾液蛋白质双向电泳图谱,并采用二维电泳图谱专用软件对所得结果进行图谱分析.采用基质辅助激光解吸电离一飞行时间质谱法对两组间比较所得目标蛋白质点进行质谱鉴定.结果:分别建立了正常人和2型糖尿病患者唾液蛋白质双向电泳图谱.结论:对比正常人和2型糖尿病患者唾液蛋白质图谱,鉴定出7种差异蛋白,为进一步研究其发病机制及治疗手段提供实验基础.     

子宫肌瘤蛋白质组研究中二维电泳方法的建立

目的:建立并优化用于子宫肌瘤蛋白质组分析的二维电泳技术,提高其分辨率和重复性.方法:以固相pH梯度等电聚焦为第一向,采用垂直十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳为第二向,并对关键步骤如样品的溶解、上样量、电泳参数和染色方法进行一系列的优化.结果:获得质量较好的子宫肌瘤和正常肌层的二维电泳图谱.结论:采用蛋白溶解度增强的裂解液分步提取组织的蛋白质,有利于二维电泳图谱的完整性;RC DC蛋白定量方法是二维电泳较为理想的蛋白定量方法,直接关系到上样量;质谱兼容银染法并不降低蛋白斑点的分辨率;窄范围(pH 4～7)的IPG胶条较宽范围(pH 3～10)的IPG胶条具有较高的分辨率.     

正常人眼小梁组织的二维凝胶电泳及质谱分析

【目的】应用二维电泳和质谱对正常人眼小梁组织蛋白质组的进行初步分析。【方法】采用二维凝胶电泳对正常人眼小梁组织进行蛋白分离和图像分析。分别用(7cm×8cm、13cm×16cm、18cm×16cm)3种不同尺寸大小凝胶分离蛋白,并结合基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析及数据库搜索从而鉴定部分蛋白质斑点。【结果】建立小梁组织蛋白样品处理及二维凝胶电泳的实验条件及方法,获得正常人眼小梁组织二维凝胶电泳蛋白图谱。3种不同尺寸大小凝胶的蛋白质分离斑点数分别为230个、875个、1213个。质谱鉴定出14个蛋白点。【结论】完成人眼小梁组织蛋白质的二维电泳凝胶“标准”图谱并作质谱分析的方法性探索对同类研究具有参考意义,为分析小梁组织在青光眼发病过程中蛋白质表达改变研究提供了新的方法及途径。     

脾肾虚型重症肌无力患者血清双向电泳图谱的建立及分析

目的:建立脾肾虚型重症肌无力患者血清蛋白质双向电泳图谱,观察脾肾虚型重症肌无力患者与正常人血清蛋白质差异表达情况。方法:采用反复冻融法抽提血清蛋白质,以优化的双向电泳技术分离血清蛋白质,建立脾肾虚型重症肌无力患者与正常人血清蛋白质双向电泳图谱,并采用二维电泳图谱专用软件对所得结果进行图谱分析。采用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法对两组间比较所得目标蛋白质点进行质谱鉴定。结果:通过双向电泳,建立血清蛋白质双向电泳图谱,选取具有明显差异的蛋白点21个进行质谱鉴定,共鉴定出8种蛋白质。结论:通过蛋白质组技术快速建立脾肾虚型重症肌无力患者血清蛋白表达图谱及质谱分析,可为进一步研究其发病机制及治疗手段提供实验基础。     

改进的一维二维电泳法分析疟原虫子孢子蛋白质的差异表达

目的建立及优化一维和二维凝胶电泳技术显示不同时期约氏疟原虫子孢子的蛋白差异表达的实验条件,为进一步研究疟原虫具有感染性的唾液腺子孢子和不具感染性的卵囊成熟子孢子间的差异表达蛋白研究奠定基础.方法采用优化的蛋白质抽提试剂、方法分别获得疟原虫具有感染性的唾液腺子孢子和不具感染性的卵囊成熟子孢子蛋白.采用一维和二维蛋白电泳技术对不同时期约氏疟原虫子孢子蛋白进行分析比较,建立约氏疟原虫子孢子蛋白质一维、二维电泳图谱.结果采用一维和二维蛋白电泳技术能够有效显示疟原虫具有感染性的唾液腺子孢子和不具感染性的卵囊成熟子孢子蛋白,为以后进一步研究子孢子侵入相关蛋白,进行功能学的分析奠定基础.结论所采用的一维和二维蛋白电泳相结合的方法对分离斯氏按蚊中约氏疟原虫唾液腺子孢子和卵囊成熟子孢子蛋白质具有较好的重复性和分辨率.     

尿道下裂大鼠与正常大鼠睾丸蛋白质二维电泳图谱分析

目的:探讨二维电泳技术在尿道下裂大鼠与正常大鼠睾丸差异表达蛋白研究中的应用.方法:孕SD大鼠10只,随机分为2组,妊娠12～19天,实验组和对照组分别予邻苯二甲酸二丁酯(DBP)500mg/(kg·d)、大豆油5 ml/d灌胃,第2l天取出仔鼠睾丸,提取总蛋白,进行二维凝胶电泳分离和图像分析.结果:按照5倍的表达量计算,发现有差异表达的蛋白质点9个,5个点在尿道下裂大鼠睾丸中高表达,而在正常大鼠睾丸为低表达;相反,在正常大鼠睾丸中高表达的4个点,在尿道下裂者为低表达.结论:初步建立了正常和尿道下裂大鼠睾丸的二维电泳图谱,并发现两者之间存在一些差异表达蛋白,为进一步进行尿道下裂大鼠睾丸差异表达蛋白的分离及鉴定奠定了良好基础.     

正常心肌缺血与糖尿病心肌缺血大鼠蛋白质组的差异

目的：运用蛋白质组学方法比较正常与糖尿病性大鼠心肌缺血再灌注损伤时心肌蛋白质组表达图谱的差异。方法：将SD大鼠随机分为心肌缺血再灌注组（IR组）和糖尿病心肌缺血再灌注组（DMIR组）。分别取各组左心室心肌蛋白进行二维电泳及凝胶染色后,用ImageMaster 2D Platinum软件对获得的蛋白图谱加以分析,寻找差异蛋白点。结果：二维电泳结果显示,IR组心肌蛋白二维电泳图谱与DMIR组相比共有29个显著差异点,其中6个点表达上调,6个表达下调,17个表达不匹配。结论：IR组与DMIR组大鼠心肌的二维电泳结果显示蛋白表达图谱有明显差异,但其差异蛋白为何种蛋白、起何种功能需要进一步的质谱数据进行分析。     

双向电泳技术分析大鼠感觉神经施万细胞与运动神经施万细胞蛋白表达差异

目的:建立正常大鼠感觉神经施万细胞(sensory nerve Schwann cell,snSc)与运动神经施万细胞(mo-tor nerve Schwann cell,mnSc)蛋白质分离的双向电泳(2-DE)技术体系,探讨运动神经施万细胞与感觉神经施万细胞存在的蛋白表达差异。方法:正常SD大鼠(180±20g)深度麻醉后打开椎管,取出运动神经和感觉神经,分别分离感觉与运动的施万细胞总蛋白,进行二维电泳和PDQuest软件分析。对其中表达有差异的蛋白质点,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间-串联质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)鉴定。结果:建立了正常大鼠感觉神经施万细胞与运动神经施万细胞的蛋白质二维凝胶电泳图像,通过PD Quest软件分析发现有12个表达差异的蛋白质点,利用MALDI-TOF/TOF-MS成功鉴定了其中3个蛋白质。     

白血病细胞蛋白质组学研究技术体系的建立

目的：建立白血病细胞HL60蛋白质组学研究的技术体系。方法：提取白血病细胞HL60的蛋白质，建立固相pH梯度双向电泳图谱，应用图像扫描仪及图像分析软件获得蛋白质斑点的数字化和匹配性信息，对需鉴定的HL60细胞的蛋白斑点A，经胶内酶切后，行基质辅助激光解吸／电离飞行时间质谱(MALDI-TOF—MS)分析，将检测出的肽质量数输入质谱数据库获得需鉴定的蛋白质信息。结果：成功构建出HL60细胞的双向电泳图谱，并用MALDI—TOF—MS成功鉴定出HL60细胞的一个蛋白质点。结论：HL60细胞蛋白质组学研究体系的建立，为进一步研究白血病的蛋白质组学奠定了基础。     

CD34^＋造血干／祖细胞蛋白质组双向电泳图谱的建立

OBJECTIVE: To investigate the differential expression of proteins in bone marrow (BM) and mobilized peripheral blood (MPB) CD34+ cells. METHODS: Immunomagnetic beads were used to separate and purify CD34+ cells from the BM and the MPB mononuclear cells (MNCs) mobilized by granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) of normal subjects. The whole cell proteins in CD34+ cells were extracted by freeze-thaw lysis, and applied for two-dimensional electrophoresis (2-DE), the results analyzed with image analysis software. RESULTS: The average purity of CD34+ cells was 92.33%+/-2.65% in output, with an average cell number of (1.12+/-0.42) x 10(6). 2-DE techniques were optimized, which yielded satisfactory 2-DE profiles of the proteome, showing the different expressions of the proteins between different CD34+ cells. CONCLUSIONS: Immunomagnetic beads in combination with 2-DE is applicable for research of hematopoietic stem/progenitor cells proteome. There are differences in the protein expressions between BM- and MPB-derived CD34+ cells.     

肝纤维化组织相关功能蛋白质组的差异分析

目的建立肝纤维化组织双向凝胶电泳图谱,初步分析蛋白质组的变化与差异表达。方法利用2-DE分离肝纤维化组织和正常肝组织总蛋白质后,经图像分析识别差异表达的蛋白点,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定差异蛋白质,并用Western印迹方法对其中3个蛋白质的表达水平变化进行验证。结果比较分析肝纤维化组织和正常肝组织的2-DE图谱,找到差异蛋白点59个,其中在肝纤维化组织表达上调30个,下调29个。并对其中15个表达差异3倍以上的蛋白点进行了肽质量指纹图分析,鉴定出10个与细胞信号转导、细胞增殖、氧化应激有关的蛋白质,14-3-3β、DJ-1及PEBP蛋白的Western印迹验证结果与2-DE的检测结果相一致。结论肝纤维化组织和正常肝组织之间存在一些差异表达的蛋白质,为进一步阐明肝纤维化的发生机制奠定基础。     

吗啡耐受大鼠脊髓蛋白质组双向电泳图谱的建立与差异蛋白鉴定

目的：建立吗啡耐受大鼠腰段脊髓组织蛋白质组双向凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)图 谱,比较分析吗啡耐受大鼠腰段脊髓组织中蛋白质组的变化和差异表达,鉴定出差异表达的蛋白质点并进行验证。 方法：将16只鞘内置管雄性SD大鼠随机分为吗啡耐受组(MT组,n=8)和生理盐水组(NS组,n=8),取其腰段脊髓组织 蛋白以固相pH梯度等电聚焦(immobilized pH gradients isoelectric focusing,IPGIEF)为第一向,十二烷基硫酸钠-聚丙烯 酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electroporesis,SDS-PAGE)为第二向进行2-DE,应用PDQuest分析 软件对考马斯亮蓝染色的2-DE图谱进行图像分析,对差异蛋白质点进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrixassisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)分析,并利用Mascot查询软件搜索Swiss- Prot数据库进行生物信息学分析。采用蛋白质印迹法验证部分差异蛋白。结果：MT组和NS组大鼠脊髓组织2-DE图谱 中各分离出约1 000个清晰的蛋白质点,其中明显差异表达的蛋白有36个。采用MALDI-TOF-MS分析,并利用Mascot查 询软件搜索Swiss-Prot数据库,共搜索到14个蛋白质,与NS组比较,MT组中表达下调的蛋白质点有2个,表达上调的 蛋白点有12个。采用蛋白质印迹法对其中的NADH脱氢酶及伽玛烯醇化酶蛋白质点进行验证,结果与蛋白质组学结 果一致。结论：初步建立了吗啡耐受大鼠脊髓组织蛋白质组双向电泳图谱,证明吗啡耐受可以引起脊髓中多种蛋白 质的表达改变。     

M2-PK蛋白在宫颈及癌变组织中的差异表达

目的：筛选、验证肿瘤标志物M2 PK在宫颈及癌变组织中的差异表达。 方法：选择永生化的人宫颈粘膜上皮细胞株H8和人宫颈癌细胞株Caski,采用双向凝胶电泳技术通过比较二者的双向电泳图谱筛选明显差异表达的蛋白质,并行MALDI TOF MS质谱鉴定;Western blot法检测差异蛋白质M2 PK在宫颈及癌变组织中的表达。结果：获得H8和Caski细胞的双向电泳图谱;蛋白M2 PK在Caski细胞中的表达量明显高于H8细胞;M2 PK在宫颈的正常组织、癌前病变组织和癌组织中的表达逐渐增加。结论：筛选出H8细胞和Caski细胞间的差异蛋白M2 PK,M2 PK在宫颈及癌变组织中的表达量不同。     

HeLa细胞蛋白质组双向电泳技术的建立

目的:建立和优化HeLa细胞蛋白质组分析所需的样品处理方法和双向电泳技术.方法:用三种不同配方的裂解液提取HeLa细胞中的蛋白质,进行双向凝胶电泳,用Amersham ImageMaster VDS-CL型凝胶成像系统获取凝胶图像,以PDQuest(7.4.0)软件进行比较分析.结果:联合使用硫脲和尿素有利于蛋白质的提取,增加碱性蛋白点的检出数量;广谱蛋白酶抑制剂的使用可大大增加双向电泳可检出的蛋白点数,同时使可检出的碱性蛋白点明显增加.结论:本文建立了HeLa细胞双向电泳分析方法,提高了2-DE图谱中蛋白位点的分辨率和重复性,获得了较为理想、清晰的双向电泳图谱,为其蛋白质组学进一步研究奠定了基础.     

蛋白酶体抑制剂PS-341诱导骨髓瘤细胞凋亡的 蛋白质组学研究

目的：比较蛋白酶体抑制剂PS-341处理多发性骨髓瘤细胞U266前后蛋白质组的差异,探究PS-341潜在的药物靶点,为多发性骨髓瘤的临床治疗提供理论依据。方法：用蛋白酶体抑制剂PS-341处理骨髓瘤细胞U266,应用双向凝胶电泳技术分离PS-341处理前后的U266细胞的蛋白质,ImageMaster 2D Platinum图像分析软件识别药物处理前后U266细胞的差异表达蛋白质点,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定差异表达的蛋白质。Western印迹法检测差异蛋白质BAG-2在药物处理前后U266细胞中的表达水平。结果：建立了PS-341处理前后U266细胞蛋白质的双向凝胶电泳图谱,找到55个差异表达的蛋白质点,鉴定了31个差异表达的蛋白质,有27个蛋白质在PS-341处理后下调。Western 印迹分析证实BAG-2在药物处理前后U266细胞中的表达水平存在差异。结论：处理后下调的一些蛋白可能是蛋白酶体抑制剂PS-341潜在的药物靶标。     

应用激光捕获显微切割技术纯化的鼻咽癌蛋白质表达谱的建立

目的：建立鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)蛋白质表达谱,为NPC蛋白质组学研究奠定基础。方法：应用激光捕获显微切割（laser capture microdissection,LCM）技术从NPC组织纯化NPC细胞,应用二维凝胶电泳（2-DE）分离LCM 纯化NPC细胞的蛋白质,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定蛋白质,利用生物信息学资源构建NPC的2-DE蛋白质组数据库。 结果：建立了NPC蛋白质2-DE参考图谱,2-DE图谱共显示（1 312±30）个蛋白质点,共鉴定了427个蛋白质点,包括241个非冗余蛋白质,并构建了NPC的2-DE蛋白质组数据库,这些数据可从本实验室网站(http://www.xyproteomics.org)上进行查询。结论：首次建立了LCM纯化NPC细胞2-DE蛋白质表达谱,为NPC蛋白质组学研究提供了重要的信息和资料。     

HepA瘤可溶性蛋白质组分析及树舌多糖GF注射液对其影响的研究

目的:分析HepA瘤细胞可溶性蛋白质组的变化并探讨树舌多糖GF注射液(GAPSGF)对其影响.方法:以超速离心制备HepA瘤可溶性蛋白,双向电泳分离瘤组织可溶性蛋白,银染显色,扫描仪获取凝胶图像并应用PDQuest软件对其进行分析.结果:肿瘤组分离得到101个蛋白质点,树舌多糖组分离得到85个蛋白质点.仅在肿瘤组出现的蛋白质点有54个,仅在树舌多糖组出现的蛋白质点有38个,肿瘤组争树舌多耱组共有的蛋白质点中表达量相差两倍以上的点有14个.结论:树舌多糖GF对HepA瘤细胞可溶性蛋白质组表达具有显著影响.