clpP基因缺陷对肺炎链球菌毒力表达降低的研究

目的 探索clpP基因缺陷对肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)毒力的影响.方法 用长臂同源多聚酶链式反应(LFH-PCR)方法 失活clpP基因,用PCR、Western blot鉴定缺陷菌株,通过RT-PCR分析白溶素(major autoly-sin A,lytA)、表面黏附A(pneumococcal surface adhesion A,psaA)、溶血素(pneumolysin,ply)和胆碱结合蛋白A(cholinebinding protein A,cbpA)的表达,并通过动物实验观察clpP基因缺陷株毒力改变情况.结果 RT-PCR显示clpP缺陷株的4个毒力因子mRNA表达水平均低于野生菌,两者比较有统计学差异(P<0.05);小鼠毒力实验表明野生菌株半数致死时间为22 h,而缺陷株半数致死时间为8 d,两者比较有统计学差异(P<0.01);缺陷菌在小鼠体内被清除速度也显著快于野生菌株(P<0.05).结论 clpP基因缺陷使S.pn多种毒力因子表达减弱,毒力降低.     

肺炎链球菌毒力相关基因检测及临床意义

目的:检测肺炎链球菌临床分离株毒力基因存在情况。方法:以临床分离出的91株肺炎链球菌作为研究对象,利用PCR法对肺炎链球菌5种毒力基因实施检测。结果:在全部的91株肺炎链球菌中LytA、PsaA、NanA、PspA、Ply这5种基因的检测阳性率分别为94.5%、85.7%、85.7%、61.5%、82.4%。结论:肺炎链球菌毒力因子是肺炎链球菌致病的基础,5种常见的毒力基因在肺炎链球菌检测中,其阳性率都比较高,此实验为进一步阐明毒力因子的作用机制并应用于指导抗肺炎链球菌新药和新型疫苗研制奠定了一定的基础。     

licD2基因缺陷导致肺炎链球菌毒力下降

目的:licD2是掌控肺炎链球菌生长所需物质胆碱代谢最重要的基因. 本研究探索licD2基因的缺陷是否影响细菌毒力. 方法:采用插入复制失活的方法缺陷licD2基因,通过相对定量RT-PCR分析其毒力因子表达情况,并利用动物体内试验观察licD2基因缺陷菌株毒力改变. 结果:RT-PCR显示licD2缺陷菌株毒力因子表达低于野生菌,两组比较P＜0.05;转化试验发现缺陷菌株转化力下降甚至消失;小鼠毒力试验结果野生菌株半数致死时间＜1 d,而缺陷菌株半数致死时间为>14 d, P<0.001,差异有显著性;缺陷菌在小鼠体内被清除速度也显著快于野生菌. 结论:结果提示licD2基因的缺陷使自然转化力下降,多种毒力因子表达减弱,细菌毒力降低.     

肺炎链球菌comX基因可影响细菌毒力基因表达

目的:探讨肺炎链球菌的转化相关基因comX与其毒力表达的关系.方法:采用插入失活的方法制备肺炎链球菌的相关基因缺陷菌株,通过小鼠毒力实验观察它们毒力的变化,并应用RT-PCR测定肺炎链球菌的主要毒力因子透明质酸酶(phd),分泌型IgA结合蛋白(sIgA),肺炎链球菌自溶酶(lytA),肺炎链球菌神经氨酸酶A (nanA)和肺炎链球菌溶血素(ply)在细菌感受态发生过程中的表达,并比较其在野生和缺陷菌株中的表达的异同.结果:野生菌株的毒力基因受感受态刺激因子(CSP)诱导表达增加;虽comX基因缺陷菌株与野生菌株感染小鼠的能力无显著差异,但其ply基因的表达与comE基因缺陷菌株一样显著低于野生菌株的表达.结论:comX可通过细菌转化的通路影响细菌毒力基因的表达.     

肺炎链球菌感染的流行病学及毒力因子研究进展

肺炎链球菌感染在不同人群中的分布受各种因素影响,其流行以及菌株血清型的分布也都有明显的差异性。造成肺炎链球菌致病的各种毒力因子在致病过程中尽管作用不同,但都参与了该过程。深入了解近年来肺炎链球菌感染的流行情况及肺炎链球菌相关毒力因子的研究进展,对预防和治疗肺炎链球菌感染,研制新一代疫苗有着实际意义。     

广东省肇庆市肺炎链球菌分子分型及毒力基因检测

目的 了解肺炎链球菌常见血清型及其5种毒力基因的携带情况,为新型疫苗开发研究和提高临床诊断提供基础科学依据。方法 选取2016年4月—2018年12月肇庆市第一人民医院住院及门诊患者分离200株肺炎链球菌,采用多重PCR分子分型方法进行血清型分型,再用单因子血清对6A/6B型进行细分。利用PCR方法对肺炎链球菌5种毒力基因（ply、pspA、nanA、psaA、lytA）进行检测,使用SPSS 19.0进行统计学分析。结果 200株肺炎链球菌来自男性患者144例,女性患者56例。0~2岁的患者最多（占67.5%）,其次是≥50岁患者为16.5%。标本类型以痰为主,占92.0%。多重PCR法分型率为95.0%,血清型以19F（37.5%）、6B(12.0%)、23F(10.0%)、19A(9.0%)、3(6.5%)、14(6%)、15B/15C(5.5%)为主。5种毒力基因检测阳性率分别为ply 93.5%、pspA 85.0%、nanA 88.5%、psaA 90.5%、lytA 93.0%。8株血培养、1株脑脊液培养及19A、3和35A/35C/42三种血清型的5种毒力基因阳性率均为100.0%。血清型14型和5型的 5种毒力基因阳性率都较低。结论 肇庆市200株肺炎链球菌的血清型以19F、6B、23F、19A、3、14、15B/15C为主,2岁以下的儿童和老年人感染率高。5种毒力基因保守性高,大部分菌株均存在。血清型不同,5种毒力基因的存在也略有不同,可为新型疫苗开发及疾病预防提供有利的依据。     

肺炎链球菌毒力因子ClpP蛋白酶的体外表达及纯化

目的构建ClpP原核表达载体,获取原核表达的ClpP蛋白分子。方法分离培养TIGR4型肺炎链球菌,获取其染色体DNA,采用基因体外重组的方法将完整的ClpP读码框克隆到pET-32a原核表达载体,并经测序鉴定,所表达的抗原蛋白用Western blot鉴定,镍柱纯化并透析复性,真空冷冻干燥保存。结果测序结果证实克隆的基因与GenBank中的序列相符,Western blot证实获得了ClpP融合蛋白。结论获得了高表达的重组抗原蛋白,经镍柱纯化后纯度可达90％以上。     

肺炎链球菌dnaJ基因缺陷菌株的构建及毒力变化的初步研究

目的 构建肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)dnaJ基因缺陷菌株,并对其毒力作初步研究.方法采用长臂同源多聚酶链式反应( long flanking homology polymerase chain reaction,LFH-PCR)技术将dnaJ基因替换为红霉素耐药基因(erm...     

肺炎链球菌耐药性和TEM基因的研究

目的:分析肺炎链球菌感染的耐药及其机制,以有效的指导临床进行合理的治疗与用药.方法:对2003年7月1日至2003年12月31日就诊于儿童医院的上呼吸道感染儿童,进行的咽拭子培养,对分离出的肺炎链球菌,再进行耐药性方面的检测,用套式PCR对TEM基因进行检测.结果:32例标本中对青霉素敏感的为66%,安灭菌31%,头孢呋肟91%,头孢噻肟88%,菌必治94%,红霉素34%,复方新诺明44%,氟霉素97%,万古霉素100%,环丙沙星91%,克林霉素25%,阿奇霉素31%,同时对其中20例标本的TEM基因进行检测,其阳性率为50%.含有TEM基因的肺炎链球菌,其对β-内酰胺类药物中的青霉素耐药性较强,耐药率达到90%(9/10);TEM基因阴性的标本,其对β-内酰胺类药物的青霉素耐药性就比较弱,敏感率为90%(9/10),中介率10%(1/10).     

肺炎链球菌耐药性和TEM基因的研究

目的 :分析肺炎链球菌感染的耐药及其机制 ,以有效的指导临床进行合理的治疗与用药。方法 :对 2 0 0 3年 7月 1日至 2 0 0 3年 12月 31日就诊于儿童医院的上呼吸道感染儿童 ,进行的咽拭子培养 ,对分离出的肺炎链球菌 ,再进行耐药性方面的检测 ,用套式 PCR对 TEM基因进行检测。结果 :32例标本中对青霉素敏感的为 16 6 % ,安灭菌31% ,头孢呋肟 91% ,头孢噻肟 88% ,菌必治 94 % ,红霉素 34% ,复方新诺明 4 4 % ,氯霉素 97% ,万古霉素 10 0 % ,环丙沙星 91% ,克林霉素 2 5 % ,阿奇霉素 31% ,同时对其中 2 0例标本的 TEM基因进行检测 ,其阳性率为 5 0 %。含有 TEM基因的肺炎链球菌 ,其对β-内酰胺类药物中的青霉素耐药性较强 ,耐药率达到 90 % (9/ 10 ) ;TEM基因阴性的标本 ,其对β-内酰胺类药物的青霉素耐药性就比较弱 ,敏感率为 90 % (9/ 10 ) ,中介率 10 % (1/ 10 )     

儿童感染侵袭性肺炎链球菌耐药基因和毒力基因携带分析

目的 了解河北省侵袭性肺炎链球菌耐药基因和毒力基因携带情况,为利用全基因测序手段研究耐药机制及致病机理打下基础。方法 对2017—2018年收集从儿童病例分离并保存河北省疾病预防控制中心的75株侵袭性肺炎链球菌,使用普通PCR方法检测侵袭性肺炎链球菌菌株研究报道较多的耐药基因和毒力基因,并分析携带情况。结果 青霉素耐药相关pbp2b基因携带率为0,红霉素耐药相关ermB、ermA和mefA/E基因携带率分别为96.00%、0和33.33%,四环素耐药相关tetM、tetL、tetK和tetO基因分别为94.67%、84.00%、0和0,左氧氟沙星耐药相关gyrA基因97.33%;主要毒力基因携带率自溶酶和神经氨酸酶表达相关基因lytA、lytB、nanA均为100.00%;与菌体侵入机体过程相关的pav、ply、hysA、iga基因分别为97.33%、98.67%、93.33%、96.00%;与细菌粘附相关的rrgA基因为29.33%;肺炎链球菌表面蛋白相关基因pspA与pspC携带率为0%。血清14、19F、6、23F型菌株mefA/E基因携带率较高,携带rrgA基因的株菌中19F型最多（9/22）;不携带tetL基因的菌株中6型占33.3%。结论 河北省侵袭性肺炎链球菌携带ermB、tetM和tetL基因及gyrA基因比例较大,应警惕此类菌株对大环内酯类、四环素类、氟喹诺酮类抗生素的耐药性。lytA、lytB基因携带率高应慎用β-内酰胺类抗生素。菌株毒力基因携带率具有地区差异,建议结合临床表现,深入研究并长期监测。     

原白头翁素对铜绿假单胞菌群体感应系统调控的毒力因子表达量的影响

目的 研究原白头翁素对铜绿假单胞菌（PA）的生长及群体感应系统（QS系统）调控的毒力因子表达的影响。方法 测定原白头翁素对PA的最低抑菌浓度和生长曲线,以40 μmol/L的呋喃酮C-30作为阳性对照,测定原白头翁素（40、80 μmol/L）对铜绿假单胞菌标准株PAO1生长曲线的影响以及QS系统调控的毒力因子中胞外3种毒力因子（绿脓菌素、蛋白水解酶和弹性蛋白酶）表达量的影响。结果 在实验所采用的浓度下,原白头翁素对铜绿假单胞菌的生长未表现出明显的抑制作用,但对PAO1的3种毒力因子均有抑制作用,并呈现出剂量相关性。结论 原白头翁素抗感染的机制可能是作用于铜绿假单胞菌的QS系统,抑制毒力因子表达,从而降低该菌的毒力。     

clpE缺陷对肺炎球菌蛋白表达的影响

目的 了解ClpE对肺炎球菌蛋白表达的影响.方法 用长臂同源多聚酶链式反应(LFH-PCR)方法失活clpE基因,用PCR、测序鉴定缺陷菌株;通过固相pH梯度双向凝胶电泳(2D-PAGE)分别分离野生菌和clpE缺陷菌的总蛋白质;经凝胶银染色、PDQuest 2DE软件分析获得 2个菌株的蛋白质表达谱;选取差异蛋白质点进行MEDLI-TOF质谱分析,查询数据库,获取有意义的蛋白点.结果 以肺炎链球菌D39的图谱为参考,△clpE与其匹配率为61%.挑选17个有明显差异表达的蛋白点进行MALDI-TOF-MS分析,获得了17张肽质量指纹图,经数据库查询后,4个蛋白点获得了有意义的结果,分别为:次黄嘌呤鸟嘌呤核糖核酸转移酶(hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase),吡咯烷羧酸肽酶(pyrrolidone-carboxylate peptidasel),甲酸四氢叶酸连接酶(formate-tetrahydrofolate ligase)和双功能蛋白pyrR (bifunctional protein pyrR).结论 野生菌表达蛋白的种类和数量均高于突变菌株,提示clpE可通过影响某些特殊蛋白质的表达,帮助细菌适应宿主的不同环境,使宿主致病.

Abstract：

Objective To investigate the effect of ClpE on the protein expression profiles of Streptococcus pneumoniae.Methods clpE-deficient Streptococcus pneumoniae strain was constructed by long flanking homology-polymerase chain reaction (LFH-PCR) and identified by PCR and sequencing. The total bacterial proteins were analyzed by two-dimensional gel electrophoresis and imaging analysis, and the differentially expressed protein spots were excised by dot-gel digestion with trypsin. Peptide mass fingerprinting (PMF) was obtained by analysis of the fragment length by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). The PMF was analyzed using software to identify the proteins. Results The number of matched protein spots of the two gels was 61%. By sequence database searching, 4 out of the 17 differential protein spots were identified, namely hypoxanthine-guanine, pyrrolidone-carboxylate peptidasel,formate-tetrahydrofolate ligase, and bifunctional protein pyrR. Conclusion clpE gene-deficient Streptococcus pneumoniae expresses fewer kinds of proteins at also lower levels than the wild-type bacteria, suggesting that ClpE allows the bacteria to adapt to different host environments by inducing the expression of special proteins.     

Roles of virulence genes (PsaA and CpsA) on the invasion of Streptococcus pneumoniae into blood system

Background

Streptococcus pneumoniae (SP) is the major cause of childhood mortality worldwide, we need to understand virulence genes of SP so can better target the treatment.We investigated the expression of virulence genes PsaA and CpsA in different strains of SP interacting with monocyte cell line (THP-1) or pneumocyte cell line (A549) and the possible mechanism of SP invasion of the blood system.

Methods

A total of 23 strains of SP were collected from hospitalized patients (blood-derived and sputum-derived) in the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College. The strains and ATCC 49619 were cultured, and RNAs were extracted. THP-1 and A549 cells were stimulated by different SP and ATCC 49619 for 4 h and 8 h, respectively. Quantitative real-time PCR was used to analyze the mRNA expression of PsaA and CpsA. The data were analyzed by SPSS 17.0.

Results

The mRNA level of PsaA and CpsA were all significantly increased in clinical SP strains when compared to ATCC49619 after tedTHP-1 and A549 cells were stimulated. Clinical SPs showed higher virulence compared with ATCC49619.

Conclusions

The expression of CpsA is the basis of the pathogenicity of SP. The expression of virulence gene PsaA may be helpful to the invasion of SP to the blood system.     

肺炎链球菌临床分离株耐药性及红霉素耐药相关基因的研究

目的了解本院临床肺炎链球菌感染状况、耐药性以及耐药基因流行情况。方法2004年1月~2005年12月从患者不同标本分离鉴定肺炎链球菌,采用NCCLS标准K-B法对临床常用抗生素进行耐药分析、PCR检测红霉素耐药基因ermB和mefA。结果分离129株肺炎链球菌,其中青霉素敏感率为42.4%,红霉素耐药率为80.6%。104株红霉素耐药肺炎链球菌中,ermB基因检出率为97.1%,mefA基因检出率为41.3%,41株同时含有ermB和mefA基因。结论本院临床分离肺炎链球菌耐药性高,红霉素耐药基因主要为ermB。