抑制CDC25A表达的siRNA真核表达载体的构建

目的 在哺乳动物细胞中构建并鉴定抑制CDC25A表达的siRNA真核表达载体.方法 根据CDC25A的基因序列,设计特异性的siRNA,将合成的siRNA 核酸片段退火形成双链后连接到经Bam HI和HindⅢ双酶切后的psilencer4.1真核表达载体,命名为psilencer4.1-CDC25A以及psilencer4.1-Control,并进行酶切及测序鉴定.结果 通过酶切鉴定和序列测定,成功地构建出抑制CDC25A表达的siRNA载体及其阴性对照载体.结论 成功构建和验证了siRNA真核表达载体,为下一步研究奠定了良好的基础.     

靶向遗传印记基因PEG10 的siRNA 真核表达载体的构建及鉴定

 目的 构建并鉴定针对遗传印记基因PEG10的siRNA真核表达载体。方法 根据PEG10基因cDNA序列，设计针对目的基因的4个siRNA靶序列，将其插入H1启动子下游，克隆到真核表达载体psiRNA-hHlneo中，通过酶切鉴定和DNA测序鉴定。结果 酶切鉴定及DNA测序结果显示插入片断正确。结论 本研究成功构建针对PEG10的真核表达载体，可能成为肝癌基因治疗中的一种新型、高效的治疗载体。     

survivin启动子调控siRNA真核表达载体的构建及对HeLa细胞中stathmin基因的干涉作用

目的:探讨survivin基因启动子调控的siRNA真核表达载体对HeLa细胞中stathmin基因表达的肿瘤特异性封闭作用。方法:合成针对人stathmin基因的siRNA cDNA寡核苷酸链退火形成双链,连接入经BamHI和HindIII双酶切后的pSilencer4.1-CMV neo真核表达载体。PCR扩增suvivin基因启动子并测序,用EcoRI和BamHI分别双酶切,连接至经相同内切酶消化的载体,获得survivin启动子调控的siRNA真核表达载体,酶切及测序鉴定。脂质体法转染重组质粒入HeLa细胞,G418筛选。RT-PCR扩增stathmin基因,检测其对stathmin基因表达的干涉效果;流式细胞仪分析转染后HeLa细胞增殖周期的改变。结果:经酶切及测序鉴定,成功构建重组质粒;RT-PCR结果显示所构建的干涉载体可有效封闭stathmin基因表达;流式细胞仪分析结果显示,Hale细胞在stathmin siRNA作用下G2/M期细胞的比例明显增加。结论:survivin基因启动子调控的siRNA真核表达载体可有效地封闭HeLa细胞中stathmin基因表达并使HeLa细胞阻断于G2/M期,为以stathmin基因为靶点的恶性肿瘤生物治疗奠定了理论基础。     

人类Survivin基因真核表达载体的构建及其在K562细胞中的表达

 目的　构建带有绿色荧光蛋白的Survivin基因真核表达载体pIRES2-EGFP／Survivin,并转染K562细胞。方法　以 pDNR／Survivin质粒为模板,PCR扩增Survivin基因,T-A 克隆,亚克隆至pIRES2-EGFP上,并对重组表达载体进行酶切、测序鉴定。采用Superfect转染试剂转染K562细胞。提取细胞RNA,RT-PCR检测Survivin基因mRNA表达。结果　经限制性酶切鉴定及测序分析证实pIRES2-EGFP／Survivin载体序列正确;荧光显微镜下可见转染的K562细胞有绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR证实转染细胞中存在Survivin基因mRNA的表达。结论　pIRES2-EGFP／Survivin表达载体构建成功,并在K562细胞内成功表达。     

人类前列腺凋亡反应因子4基因真核表达载体的构建及其在K562细胞中的表达

 目的　构建带有绿色荧光蛋白的人类前列腺凋亡反应因子4（Par-4）基因真核表达载体pIRES2-EGFP／Par-4,并转染K562细胞。方法　以 pDNR／Par-4质粒为模板,PCR扩增Par-4基因,T-A 克隆,亚克隆至pIRES2-EGFP上,并对重组表达载体进行酶切、测序鉴定。采用Superfect转染试剂转染K562细胞。提取细胞总蛋白,Western blotting检测Par-4表达。结果　经限制性酶切鉴定及测序分析证实pIRES2-EGFP／Par-4载体序列正确;荧光显微镜下可见转染的K562细胞有绿色荧光蛋白的表达,Western blotting证实转染细胞中存在Par-4蛋白的表达。结论　pIRES2-EGFP/Par-4表达载体构建成功,并在K562细胞内成功表达。     

Survivin特异性siRNA真核表达载体的构建

目的构建Survivin特异性siRNA真核表达载体，为以Survivin基因为靶点、小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）为手段的白血病和其它恶性肿瘤基因治疗的基础和临床应用提供良好的技术手段。方法根据GeneBank数据库提供的Survivin基因所有变异体的共同核苷酸序列，按照Tuschl设计原则，选择设计双链siRNA，再转化为能表达其小发卡结构RNA（small hairpin RNA，shRNA）的DNA序列，并与载体pSINsi-hU6定向连接，构建受控于启动子u6的真核表达载体pSIN／shRNA1、pSIN／shR-NA2，经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定。结果构建Survivin特异性siRNA真核表达载体pSIN／shRNA1、pSIN／shRNA2，经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计完全一致。结论Survivin特异性siRNA真核表达载体构建成功。     

Survivin基因siRNA真核表达载体的构建及其对转染膀胱癌细胞Survivin表达的抑制作用

目的构建针对Survivin基因的siRNA(smallinterferenceRNA)真核表达载体,并观察其对转染的膀胱癌细胞中Survivin基因表达和细胞凋亡的影响。方法应用siRNA设计软件设计针对Survivin基因的特异性短链寡核甘酸,化学合成后经退火形成双链siRNA模板,通过克隆到质粒pSilencer1.0-U6构建siRNA真核表达载体并用酶切和测序鉴定;然后将其转染人膀胱癌细胞株BIU-87,以反义Survivin寡核甘酸(ASODN)抑制效果为对照,分别采用噻唑蓝(MTT)比色法和DNA原位末端标记(TUNEL)法检测BIU-87细胞生长抑制率(IR)和凋亡指数(AI),半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Westernblot检测BIU-87细胞中SurvivinmRNA及其蛋白的表达。结果酶切和测序证实siRNA真核表达载体构建成功。siRNA对BIU-87细胞的IR和AI(62.14%和33.77%)均分别显著高于ASODN(39.33%和23.98%)和空白对照组(1.98%和3.75%),P均<0.05,SurvivinmRNA及其蛋白相对表达水平均显著低于ASODN和空白对照组。结论构建的siRNA真核表达载体能有效地抑制Sur-vivinmRNA的转录和表达,诱导BIU-87细胞凋亡和抑制细胞生长,为膀胱肿瘤的基因治疗提供新的方法和手段。     

Twist基因真核表达载体的构建和表达检测

[目的]构建Twist基因读码框架至真核表达载体pCDNA3．1，为进一步研究Twist蛋白的功能做材料准备。[方法]采用RT-PCR方法，以正常人子宫体组织cDNA为模板，扩增Twist基因全长读码框架，并构建到真核表达载体pCDNA3．1中。[结果]经过克隆测序结果证实，成功将Twist基因读码框架插入真核表达载体pCDNA3．1的相应位置：将pCDNA-Twist载体转染细胞系后，发现Twist蛋白在细胞中得到高水平的表达。[结论]Twist真核表达载体的成功构建，为深入研究Twist蛋白对肿瘤转移的作用提供了理想的材料。     

原发性肝癌中Fas表达及其与细胞凋亡的关系

目的：研究Fas蛋白在肝癌组织中的表达和意义，探讨Fas蛋白与细胞凋亡的关系。方法：应用SABC免疫组织化学染色方法和脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)技术，对41例肝癌组织中Fas蛋白、凋亡细胞表达进行原位观察和比较。结果：肝癌中Fas蛋白阳性率为31．71％，癌旁肝硬化Fas阳性率80．00％，癌细胞Fas表达较癌旁显著减少，肝癌组织Fas表达与性别、肿瘤大小、组织分级无关，Fas基因表达与门静脉癌栓发生率呈负相关。Fas表达阳性的肝癌组织细胞凋亡指数明显高于Fas蛋白表达阴性组。结论：Fas／FasL系统在原发性肝癌肿瘤免疫逃避中起重要作用，Fas蛋白在原发性肝癌门静脉癌栓形成中作用值得进一步研究。     

HSV1-tk报告基因真核表达载体的构建及其在人肺腺癌AGZY细胞中的表达

目的：构建含有HSV1-tk（ Herpes simplex virus type 1 thymidine kinase, HSV1-tk）基因的真核表达载体,并检测其在人肺腺癌AGZY细胞系中的表达。方法应用PCR反应从质粒pHSV106质粒中扩增HSV1-tk基因后与pMD18-T载体连接,构建重组质粒pHSV1-tk/18T。将测序正确的重组质粒插入plRES2-EGFP 载体内,通过LipofectamineTM 2000将表达载体转染人肺腺癌AGZY细胞。结果酶切鉴定结果表明扩增的HSV1-tk基因序列正确;用荧光显微镜观察HSV1-tk基因的转入和表达;RT-PCR和Western blot结果显示在AGZY细胞中HSV1-tk基因在转录水平和蛋白水平均可以正确表达。MTT结果显示转染后AGZY细胞与未转染细胞在细胞增殖能力方面无明显差别。结论成功构建HSV1-tk报告基因的真核表达载体,在人肺腺癌AGZY细胞中能有效表达。     

突变K-ras基因siRNA腺病毒载体的构建及其对人肺腺癌细胞株H441的影响

目的:构建含12密码子点突变的K-ras基因siRNA腺病毒载体,并研究其对人肺腺癌细胞株H441中突变K-ras基因表达的影响。方法:首先构建含有K-ras^V12 siRNA的人H1启动子真核表达载体pSilencerH1/siK-ras^V12;利用EcoRⅠ与HindⅢ双酶切将人H1载体启动子和K-ras^V12 siRNA序列亚克隆至经相同酶切的腺病毒穿梭质粒pAdTrack中,形成转移质粒pAdTrack-H1/siK-ras^V12,然后与腺病毒骨架质粒pAd/PL共转染至大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,酶切、序列鉴定。提取含目的基因的腺病毒重组体质粒,经PacⅠ酶切线性化后用脂质体转染293细胞,包装成重组腺病毒AdH1/siK-ras^V12,扩增、纯化,并对病毒滴度进行检测。利用得到的重组腺病毒感染人肺腺癌H441细胞株,采用Westernblot检测感染前后K-ras^V12蛋白表达水平的变化,观察AdH1/siK-ras^V12对人肺腺癌细胞K-ras^V12表达的影响。结果:成功构建K-ras^V12s iRNA腺病毒载体,该载体可明显抑制H441细胞中K-ras^V12蛋白的表达。结论:构建的AdH1/siK-ras^V12腺病毒能有效抑制突变K-ras基因在人肺腺癌细胞株H441中的表达,为肺癌的基因治疗提供了新的方法和材料。     

Fas和Fas配体基因启动子单核苷酸多态性与子宫颈癌的发病风险

目的 探讨凋亡相关基因Fas和Fas配体(Fas L)启动子区单核苷酸多态与宫颈癌发病风险的关系.方法 采用PCR-限制性片段长度多态性方法,检测314例宫颈癌患者和615例正常对照者的外周静脉血Fas-670A/G、Fas-1377 G/A和Fas L-844T/C多态位点的基因型.应用多因素Logistic回归分析基因多态与宫颈癌风险的相关性以及与宫颈癌临床病理特征的关系.结果 携带Fas L-844CC基因型者患宫颈癌风险较携带Fas L-844TY基因型者增加3.05倍(P<0.01);Fas-670A/G和Fas-1377G/A均与宫颈癌发病风险无关;Fas和Fas L基因多态间存在协同作用.分层研究显示,Fas-670G和Fas-1377A等位基因是患宫颈原位鳞癌的危险因素(OR分别为1.77和1.93:P<0.05).Fas L-844CC基因型携带者患宫颈浸润性鳞癌的风险较Fas L-844TT基因型携带者增加(OR=3.33;P<0.01).Fas和Fas L基因多态与宫颈癌临床分期、细胞分级、肿瘤大小和血清鳞状上皮细胞癌抗原等无关.结论 Fas和Fas L基因多态与子宫颈癌遗传易感性相关.     

Fas及Fas配体基因多态性与肿瘤发生风险的关系

肿瘤的发生与发展是多基因参与、多因素作用的复杂过程,是环境因素和遗传因素相互作用的结果。遗传因素是个体对肿瘤发生易感性的内因。肿瘤不仅是细胞增殖与分化异常的疾病,也是细胞凋亡异常的疾病。Fas及其配体FasL是凋亡相关基因,Fas／FasL系统的功能紊乱是肿瘤细胞逃避机体免疫防御反应的机制之一。     

Fas、FasL在非小细胞肺癌中的表达及其与肿瘤免疫的关系

[目的]探讨Fas／FasL系统在非小细胞肺癌（NSCLC）发生发展中所起的免疫逃逸作用,为临床早期诊断肺癌、判断预后、设计新的治疗策略提供依据。[方法]采用免疫组织化学方法检测Fas、FasL在NSCLC组织及正常肺组织中的表达,同时采用抗CD45RO抗体检测肿瘤组织中浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes,TIL）的数量。[结果]与正常肺组织比,Fas在肺癌组织低表达（51．25％vs．100．00％）并存在异位表达,表达率与细胞分化有关。FasL在肺癌组织中高表达（67．50％vs．0）,表达率和细胞类型及淋巴结转移相关,与TIL浸润程度呈负相关。[结论]NSCLC组织中普遍存在Fas表达的下调、异位表达及FasL高表达,导致癌细胞逃脱机体免疫系统的监视．参与NSCLC的发生和发展。     

宫颈癌Fas阳性表达细胞株的建立

目的　将Fas基因转入宫颈癌细胞 ,建立Fas基因表达株。方法　采用分子克隆技术将Fas基因插入表达载体 pBC的多克隆位点 ,用脂质体介导将Fas基因转入宫颈癌细胞株HeLa中 ,用G4 18筛选克隆细胞 ,扩增并检测Fas基因的表达。结果　成功地构建了表达载体 pBC -FascDNA ,用脂质体介导转入HeLa中 ,可见抗性克隆产生 ,随机挑选 2个克隆扩增培养 ,获得 1株稳定的抗性细胞 ,从而建立了Fas基因表达株 (HeLaFasceells) ,杂交结果表明转导株Fas蛋白表达明显高于非转导株。结论　Fas基因在宫颈癌细胞中处于低表达 ,通过表达载体介导 ,可将Fas基因转入宫颈癌细胞并过表达。     

膀胱癌患者尿中可溶性Fas和可溶性FasL表达水平的意义

 目的　探讨可溶性Fas(sFas)和可溶性FasL(sFasL)在膀胱癌病人尿中的表达及其临床意义。方法　应用双抗体夹心ELISA法检测 4 3例膀胱癌病人术前、术后和 12例正常人尿中sFas和sFasL的表达水平。结果　膀胱癌病人尿sFas和sFasL水平均高于正常对照组 ,sFas与肿瘤临床分期、病理分级正相关 ,sFasL仅与肿瘤临床分期正相关。肿瘤切除术后sFas和sFasL水平均降低 ,而且复发者术后sFas水平显著高于无复发者。结论　sFas和sFasL参与膀胱癌的发生、发展 ,在一定程度上可以反映膀胱癌生物学行为。     

DFMO通过Fas/FasL通路诱导人肺癌细胞凋亡的研究

背景与目的:Fas/FasL系统是细胞凋亡的重要通路。为了解Fas/FasL系统在肿瘤多胺生物合成抑制导致恶性表型逆转中的作用,本研究拟探讨多胺生物合成抑制剂α-二氟甲基鸟氨酸(α-difluoromethylornithine,DFMO)对人肺癌A549细胞生长、凋亡的影响及其与人肺癌相关抗原、rasP21蛋白及Fas/FasL表达的相关性。方法:用MTT法观察细胞生长,流式细胞仪分析细胞周期,DNAladder电泳法观察细胞凋亡,SP免疫组化法及RT-PCR法检测细胞蛋白及基因表达。结果:DFMO可抑制A549细胞生长并诱导凋亡,使G1期细胞增多(61.0±2.08)%,S期细胞减少(21.2±0.88)%,出现DNAladder;同时下调A549细胞人肺癌相关抗原及rasP21蛋白表达,上调Fas基因mRNA及蛋白表达。结论:DFMO通过Fas/FasL通路诱导肺癌A549细胞的凋亡,并可能与人肺癌相关抗原及rasP21蛋白表达调控有关。     

化疗对肝癌患者血清可溶性Apo-1/Fas水平的影响及其临床意义

目的：评价肝癌患者化疗前后血清可溶性Apo-1/Fas(sApo-1/Fas)水平变化的临床意义。方法：采用酶联免疫吸附试验法（ELISA）检测30例正常人及58例肝癌患者化疗前后血清sApo-1/Fas水平，并作对比分析。结果：肝癌患者血清sApo-1/Fas水平明显高于正常对照组（P＜0．01），Ⅲ期肝癌血清sApo-1/Fas水平明显高于Ⅱ期（P＜0．01），化疗后有效（完全缓解和部分缓解）患者血清sApo-1/Fas水平明显低于化疗前者（P＜0．01），血清sApo-1/Fas水平与肝癌患者性别、年龄均无相关。结论：血清sApo-1/Fas可能参与调控肝癌的发生、发展过程，可作为化疗疗效和判断预后观察指标。