结核分枝杆菌黏附素HBHA抗结核作用的动物实验研究

目的探讨结核分枝杆菌黏附素HBHA在免疫预防和治疗中作用方法(1)实验动物分组将实验动物随机分为以下4组：CpG免疫治疗组,HBHA免疫治疗组,CpG HBHA免疫治疗组和对照组。(2)给药方法攻毒后14d给CpG免疫治疗组腹腔注射每只小鼠CpG 30ug,HBHA免疫治疗组腹腔注射每只小鼠HBHA 5ug,CpG HBHA免疫治疗组腹腔注射CpG 30μg和HBHA 5μg,对照组在攻毒后14d注射100μl生理盐水。2周后加强免疫1次。(3)结核病小鼠模型的建立取在改良罗氏培养基上生长良好的结核分枝杆菌H37Rv2周的培养物,用     

MBL免疫治疗结核病小鼠的实验研究

目的观察甘露聚糖结合凝集素（mannan-bindinglectin,MBL）对结核分枝汗菌感染小鼠的免疫治疗作用。方法将BALB／c小鼠18只随机分成MBL免疫治疗组、微卡治疗组和结核菌感染对照组．每组6只。小鼠感染结核分枝杆菌．感染2周后分3次分别腹腔内注射MBL、微卡或生理盐水。治疗结束后第3周处死小鼠，观测小鼠体重以及肺、脾脏湿重，观察肺脏病理改变，取肺、脾组织进行结核菌培养和菌落计数。结果治疗后第3周，治疗组小鼠体重和脾脏重量高于对照组，肺脏重量低于对照组，且肺部病变较轻。MBL减轻结核病小鼠体重下降．减少结核病小鼠肺和脾脏结核菌数量。结论MBL对结核病小鼠具有一定的免疫治疗作用。     

MBL免疫治疗结核病小鼠的实验研究

目的 观察甘露聚糖结合凝集素(mannan-binding lectin,MBL)对结核分枝杆菌感染小鼠的免疫治疗作用.方法 将BALB/c小鼠18只随机分成MBL免疫治疗组、微卡治疗组和结核菌感染对照组,每组6只.小鼠感染结核分枝杆菌后第14、21、28 d各组腹腔内分别注射MBL、微卡和生理盐水.治疗结束后第3周处死小鼠,观测各组小鼠体质量以及肺、脾脏湿重,观察肺脏病理改变,取肺、脾组织进行结核菌培养和菌落计数.结果 治疗后第3周,治疗组小鼠体质量和脾脏质量高于对照组,肺脏质量低于对照组,且肺部病变较轻.MBL减轻结核病小鼠体质量下降,减少结核病小鼠肺和脾脏结核菌数量.结论 MBL对结核病小鼠具有一定的免疫治疗作用.     

MBL免疫治疗结核病小鼠的实验研究

目的观察甘露聚糖结合凝集素(mannan-binding lectin,MBL)对结核分枝杆菌感染小鼠的免疫治疗作用。方法将BALB/c小鼠18只随机分成MBL免疫治疗组、微卡治疗组和结核菌感染对照组,每组6只。小鼠感染结核分枝杆菌后第14、21、28 d各组腹腔内分别注射MBL、微卡和生理盐水。治疗结束后第3周处死小鼠,观测各组小鼠体质量以及肺、脾脏湿重,观察肺脏病理改变,取肺、脾组织进行结核菌培养和菌落计数。结果治疗后第3周,治疗组小鼠体质量和脾脏质量高于对照组,肺脏质量低于对照组,且肺部病变较轻。MBL减轻结核病小鼠体质量下降,减少结核病小鼠肺和脾脏结核菌数量。结论MBL对结核病小鼠具有一定的免疫治疗作用。     

应用结核病DNA疫苗治疗小鼠耐多药结核病的研究

目的 研究结核分枝杆菌Ag85A质粒DNA疫苗单独或联合药物治疗小鼠耐多药结核病的效果,为建立耐多药结核病的免疫治疗新策略和新方案奠定基础.方法 用结核分枝杆菌高耐利福平、低耐异烟肼临床分离株HB361尾静脉注射17～19 g的6～8周龄雌性BALB/C小鼠后,将小鼠随机分为6组,每组10只.感染后第2天开始,分别用pVAX1载体(A组)、利福平(B组)、吡嗪酰胺(C组)、Ag85A质粒DNA疫苗(D组)、Ag85A质粒DNA疫苗联合利福平(E组)、Ag85A质粒DNA疫苗联合吡嗪酰胺(F组)治疗60 d.治疗结束后4周,分别取肺、肝和脾观察病理改变,称取重量,做菌落计数.结果 小鼠感染4周后,肺内菌量达到1.5×107 CFU,脾内菌量达到1.1×106 CFU.A、B组小鼠死亡率均为10%,其余各组小鼠均存活.治疗结束后4周,肺组织病理显示,各治疗组肺组织病变均有不同程度减轻,病变局限,可见正常的肺泡结构,肺泡轮廓相对清晰.与A组比较,C、D、E、F组肺组织菌落数分别减少了1.18、1.35、1.38、1.08 logs,脾脏菌落数分别减少了0.91、1.00、1.26、1.03 logs(P＜0.01).结论 结核分枝杆菌Ag85A质粒DNA疫苗单独或联合药物治疗小鼠耐多药结核病均有显著疗效.Ag85A质粒DNA疫苗与抗结核药物联合治疗是治疗耐多药结核病的最有前途的免疫策略.     

不同感染途径建立的结核分枝杆菌急性肺感染小鼠模型的比较

目的 比较3种不同感染途径建立的结核分枝杆菌急性肺感染小鼠动物模型,为结核病研究中动物模型的建立、选择与实际应用提供实验依据.方法 将结核分枝杆菌标准株H37Rv稀释至1×106菌落形成单位(cfu)/mL,分别采用尾静脉注射、滴鼻、气雾攻击方式感染小鼠,感染后6周,观察肺组织病变情况、菌落计数,肺组织行HE染色、抗酸染色,免疫组织化学检测肺组织TNF-α单位面积表达量.数据行t检验.结果 气雾攻击组、滴鼻组和尾静脉组小鼠肺部结核分枝杆菌数分别为(6.290±0.028)、(6.150±0.021)和(6.120±0.008) lg cfu/mL,对照组肺部无结核分枝杆菌;各感染组与对照组比较,差异均有统计学意义(t=3.762,P＜0.01),但不同感染途径感染组间差异无统计学意义(P＞0.05).各感染组小鼠肺组织均有病理学改变,抗酸染色阳性.单位面积TNF-α表达量在尾静脉注射组、滴鼻组和气雾攻击组分别为0.049×106、0.759×106和1.042×106,差异有统计学意义(t=2.504,P＜0.05).结论 气雾攻击感染方式建立的小鼠急性肺结核病模型较尾静脉注射和滴鼻方式更为有效.     

Ag85A/B嵌合DNA疫苗治疗小鼠敏感结核病疗效的实验研究

目的研究结核分枝杆菌Ag85A/B嵌合DNA疫苗治疗小鼠敏感结核病的效果。方法用结核分枝杆菌标准株H37Rv尾静脉注射50只雌性BALB/c小鼠后,将小鼠随机均匀地分为5组,感染后第3 d开始,分别用生理盐水(A组)、pVAX1载体(B组)、利福平(C组)、草分枝杆菌F.U.36注射液(D组)、Ag85A/B嵌合DNA疫苗(E组)治疗,每2周肌肉注射1次DNA疫苗,共3次。在治疗结束后2周,杀鼠,取小鼠肺和脾观察病理改变、称取重量、做菌落计数。结果与A组比较,D组、E组肺脏病变有不同程度减轻,病变局限,3/5区域肺泡结构完整,清晰,细胞分布均匀。与A组相比,C、D、E组肺脏菌落数依次减少2.11 log、0.76 log、0.81 log;肝脏菌落数依次减少2.11 log、0.74 log、1.11 logs(P0.01)。结论 Ag85A/B嵌合DNA对小鼠敏感结核病具有较好的治疗效果。     

结核分枝杆菌Ag85A/ESAT-6嵌合型质粒DNA疫苗和抗结核药物联合治疗小鼠耐药结核病的效果研究

目的研究结核分枝杆菌Ag85A/ESAT-6嵌合型质粒DNA疫苗和抗结核药物联合治疗小鼠耐药结核病的效果。方法用结核分枝杆菌高耐利福平低耐异烟肼临床分离株HB240尾静脉注射BALB/c小鼠1个月后,将小鼠随机分成2组,第1组用利福平(RFP)、异烟肼(INH)治疗12周,第2组用RFP、INH和结核分枝杆菌Ag85A/ESAT-6嵌合型质粒DNA疫苗(免疫5次)联合治疗12周;治疗结束后4和8周,分别取肺、肝和脾观察病理改变、称取质量、作菌落计数。结果治疗结束后4和8周,第2组小鼠体质量均超过第1组,但无显著性差异(P>0.05)。治疗结束后4周,第2组肺、脾脏指数(0.017,0.011)均略低于第1组(0.020,0.012)(P>0.05);治疗结束后8周,第2组肺、肝脏指数(0.021,0.047)均略低于第1组(0.022,0.048)(P>0.05);而第2组脾脏指数(0.008)显著低于第1组(0.012)(P<0.05)。治疗结束后4周,第2组有4例脾脏未见明显病变,第1组仅1例脾脏未见明显病变;治疗结束后8周,第2组有1例肺门淋巴结肿大,而第1组有3例;第2组有5例脾脏未见明显病变,第1组仅2例脾脏未见明显病变。治疗结束后4周,第2组肺菌落计数和脾菌落计数比第1组显著减少,分别减少70%和80%。结论DNA疫苗和抗结核药物联合治疗小鼠耐药结核病疗效高于单纯化疗。     

结核分枝杆菌黏附素HBHA在结核病免疫学诊断中的应用

目的 探讨结核分枝杆菌肝素结合血凝黏附素(Heparin-binding haemagglutinin adhesin,HBHA)在结核病免疫诊断方面的应用价值.方法 将在苏通培养基中培养至稳定期的卡介苗菌株(BCG)菌体超声裂解,离心后取上清并通过CL-6B层析柱,利用含0～500 mmol/L氯化钠的磷酸盐缓冲溶液(PBS)进行梯度洗脱后获得天然HBHA.以BCG基因组为模板PCR扩增结核分枝杆菌hbha基因片段,质粒pET-32a为载体,大肠杆菌作为宿主菌制备原核表达的HBHA重组蛋白.以纯化的天然HBHA蛋白和原核表达的HBHA蛋白为包被抗原,分别对肺结核组、肺外结核组、PPD阳性和PPD阴性健康对照组各47例血清通过ELISA方法检测抗HBHA的抗体水平.应用SPSS 11.5统计软件对各研究组数据进行方差齐性检验,然后进行t检验,并计算各研究组的敏感度和特异度.结果 含有375 mmol/L氯化钠的PBS洗脱液可以洗脱获得较纯的天然HBHA蛋白.利用重组HBHA所带的组氨酸标签进行特异分离、纯化.ELISA检测结果表明天然HBHA蛋白和重组HBHA蛋白、PPD阳性和PPD阴性健康对照组之间血清抗体水平差异不明显.肺结核组与肺外结核组的血清抗体ELISA检测的吸光度值在散点图中分布有明显差异,肺结核组吸光度值集中分布在0.30～0.40之间,肺外结核组吸光度值分布在0.35～0.45之间,经统计学检验结果差异具有统计学意义(t=12.224,P＜0.05).结核组(肺结核和肺外结核)与对照组(PPD阴性,PPD阳性)吸光度值分布具有显著不同,对照组全部小于0.30,结核组吸光度值则集中分布于0.30～0.45之间.经统计学检验(t=25.909,P＜0.05)血清抗体水平具有显著性差异.结论 结核分枝杆菌黏附素HBHA在结核病免疫学诊断的应用中具有较好的特异度和敏感度,有望用于结核病、尤其是肺外结核病的实验室辅助诊断.     

DNA疫苗治疗小鼠耐多药结核病的研究

目的研究结核分枝杆菌DNA 疫苗治疗小鼠耐多药结核病的效果。方法用结核分枝杆菌耐利福平和异烟肼临床分离株HB361尾静脉注射60只雌性BALB/c小鼠后,将小鼠随机均匀地分为6组,感染后第3d开始,分别用生理盐水（A组）、pVAX1载体（B组）、利福平（C组）、HSP65 DNA疫苗（D组）、Ag85A DNA 疫苗（E组）、Ag85A/ESAT6嵌合DNA疫苗（F组）治疗60d,DNA疫苗每隔15d肌肉注射1次,共5次。治疗结束后3周,分别取肺和脾观察病理改变、称取重量、做菌落计数。结果治疗结束后3周,与对照组比较,D组、E组和F组肺脏病变有不同程度减轻,病变局限,2/3区域可见正常的肺泡结构,肺泡轮廓相对清晰,细胞分布均匀。与A组相比,D组、E组和F组肺脏菌落数分别减少了0.34、0.50 和0.26 logs;脾脏菌落数依次减少了0.37、0.46 和0.28 logs（P<0.05,P<0.01）。结论Ag85A DNA 疫苗治疗小鼠耐多药结核病效果优于HSP65 DNA和Ag85A/ESAT6嵌合DNA疫苗。     

圣露丸的抗结核作用初步实验研究

目的 评价中药圣露丸的体外及小鼠结核病模型中的抗结核活性。方法 在7H9液体培养基、7H10固体培养基中分别测定圣露丸对结核分枝杆菌标准株H37Rv的最低抑菌浓度(MIC)。气溶胶感染方式采用结核分枝杆菌标准株H37Rv先后感染SPF级BALB/C小鼠46只和36只,分别建立小鼠急性结核病模型。均为感染第10天开始给予药物治疗,随机分组,每组10只。其中圣露丸组每只小鼠每次剂量为3g/kg;异烟肼(INH)组,每次剂量为25mg/kg,同时设无药空白对照组。各组均口服灌胃给药,每周给药5次,分别给予3周和6周药物治疗。治疗结束后次日处死各组小鼠,称重,无菌操作下解剖,做肺组织活菌计数。结果 圣露丸在7H9液体培养基中对H37Rv的MIC为2.5mg/ml,在7H10固体培养基中对H37Rv的MIC为<5mg/ml。小鼠感染及治疗过程中各组耐受性良好,无死亡。给予3周共计15次(每次给予“圣露丸”3g/kg)剂量治疗后,圣露丸组小鼠全肺的CFU为 (6.81±0.71)lg CFU,较空白对照组降低0.39lg CFU。应用圣露丸治疗6周后,圣露丸组的小鼠全肺的CFU为 (4.33±0.51)lg CFU,较空白对照组降低1.10lg CFU。结论 在本研究条件建立的小鼠结核病模型中,中药圣露丸显示出抗结核活性,值得进一步研究。     

氯法齐明抗结核分枝杆菌的体内外活性研究

目的 评价氯法齐明(clofazimine,CLF)在体外及体内抗结核分枝杆菌的活性,为临床应用提供依据.方法 应用微孔板指示剂法,测定氯法齐明对结核分枝杆菌标准株H37Rv及临床分离耐多药结核分枝杆菌(30株)的MIC;建立小鼠静脉感染H37Rv的结核病模型(105 CFU/只),根据氯法齐明的不同剂量,分为3个治疗组:20 mg/kg,每周给药5次(CLF-1组);10 mg/kg,每周给约5次(CLF-2组);20 mg/kg,每周给药2次(CLF-3组);治疗30 d后进行肺、脾组织活菌计数,应用单冈素方差分析,比较氯法齐明在小鼠体内的抗结核分枝杆菌活性.结果 氯法齐明对结核分枝杆菌H37Rv的MIC为0.12～0.24 μg/ml;对30株耐多药结核分枝杆菌临床分离株的MIC为0.12～1.92 μg/ml.在小鼠结核病治疗模型中,3个治疗组的小鼠肺活菌计数分别较空白对照组降低2.92、1.78和1.39 lg CFU,均具有统计学意义(F=74.09,P＜0.01).结论 氯法齐明具有较好的体外及体内抗结核分枝杆菌活性,值得进一步研究.     

不同感染途径和接种菌量对建立SD大鼠结核菌感染模型的影响

目的　探讨建立SD大鼠结核病模型的方法 ,比较不同感染途径和接种菌量在建立SD大鼠结核病动物模型的影响。方法 用标准人型结核菌株H₃₇Rv 0.1、1、10 mg 3种接种菌量分别经尾静脉和腹腔途径注入SD大鼠。6周后剖杀大鼠,并比较肺、肝、脾的脏器质量指数,观察肺、肝、脾大体病变和镜下特点,肺、肝、脾的组织匀浆涂片做抗酸染色及结核菌培养。结果 肺、肝、脾组织切片HE染色见不同程度增殖性结核结节。随着接种量的增加,其脏器组织病理改变越显著。肺、肝、脾组织切片抗酸染色见炎性结节及多核巨细胞内散乱排列的红色短小抗酸杆菌。接种菌量一致的情况下,尾静脉感染组肺、肝、脾组织病理改变较腹腔感染组显著,肺、肝、脾组织匀浆的结核分枝杆菌培养阳性率较腹腔感染组高（P<0.05）。结论 建立SD大鼠肝、脾、肺结核杆菌感染模型,尾静脉感染途径优于腹腔感染途径。SD大鼠对结核菌敏感,可作为结核病实验的动物模型。     

实验性大鼠结核病模型的特点

目的　探讨感染了结核菌的Wistar大鼠的实验特点。方法 用标准人型结核菌株H₃₇Rv 0.01mg经尾静脉注入Wistar大鼠,6周后剖杀大鼠,观察肺、肝、脾组织大体病变及镜下特点,肺组织匀浆培养有无结核菌落生长。结果 实验组大鼠肺组织可见明显的结核病变,感染成功率100%,肝、脾组织无结核病变。结论 Wistar大鼠对结核菌敏感,可作为结核病实验的动物模型。     

Protective efficacy of BCG Tokyo 172 in the guinea pig model of pulmonary tuberculosis

BCG Tokyo 172 strain was examined for its protective efficacy against pulmonary tuberculosis in a guinea pig model. Guinea pigs were vaccinated with an intradermal injection of 10(3) CFU of BCG Tokyo 172 strain. BCG Copenhagen 1331 was employed as a control strain. Eight weeks after the vaccination, the animals were infected with about 10 CFU of M. tuberculosis H37Rv by a respiratory route in an aerosol chamber. Five weeks after infection, the animals were euthanized and their spleens, lungs and livers were obtained for enumeration of M. tuberculosis H37Rv and histopathological examinations. The mean log10 CFU of M. tuberculosis H37Rv recovered from right lower lung lobes of guinea pigs vaccinated with BCG Tokyo 172 (frozen), BCG Tokyo 172 (freeze-dried), BCG Copenhagen 1331 (freeze-dried) and placebo were 4.72, 4.23, 4.35 and 5.76, respectively. The mean log10 CFU of the bacteria recovered from spleens were 2.11, 1.51, 1.37 and 5.90, respectively. There was a significant difference in bacterial recovery from both lung and spleen between the vaccinated and the non-vaccinated groups. No significant difference was seen among the groups vaccinated with different strains of BCG in any organ. The lungs exhibited just small granulomatous nodules and the spleens showed no granulomatous nodules in the BCG-vaccinated guinea pigs. On the other hand, the lungs and spleens from non-vaccinated guinea pigs showed much larger granulomatous nodules with central necrosis. These histopathological difference between the vaccinated and the non-vaccinated guinea pigs was consistent with the difference of bacterial growth between them. The results of this study have clearly indicated that BCG Tokyo 172 strain possesses a significant protective efficacy against M. tuberculosis as well as BCG Copenhagen 1331 strain. These results have also shown that the respiratory infection model in guinea pigs is very useful to evaluate efficacy of vaccines against pulmonary tuberculosis.     

结核分枝杆菌潜伏感染豚鼠模型的建立

目的 建立MTB潜伏感染豚鼠模型,研究MTB体内增殖动力学及与PPD试验的关系.方法 62只豚鼠按随机数字表法分成对照组(20只)和模型组(42只),模型组又分为4周组(12只)、8周组(21只)和12周组(9只).采用恢复毒力的H37Rv株500 CFU经豚鼠腹股沟皮下注射攻毒,攻毒后2周,模型组给予异烟肼(10 mg/kg)和吡嗪酰胺(40 mg/kg)每周3次灌胃,控制MTB增殖,分别于4周、8周和12周停药.模型4周组停药后观察结核病自然复发情况,模型8周组和12周组停药后观察结核病自然复发和地塞米松诱导复发情况.在建立模型过程中进行PPD试验,检测豚鼠的脾、肺荷菌量及组织切片病理,分析PPD试验与结核病活动或潜伏感染的关系.结果 对照组豚鼠攻毒后2周脾荷菌量为3.3 lgCFU,6周后出现腹股沟淋巴结肿大,脾、肺荷菌量分别为4.5和1.8 lg CFU,18周时脾、肺荷菌量分别达5.3和5.4 lg CFU.观察期间,模型4周组停药后结核病均自然复发;模型8周组有结核病自然复发和地塞米松诱导复发;模型12周组无结核病自然复发,但地塞米松可诱导结核病复发.PPD试验反应越强,结核病越容易复发,PPD试验反应阴性豚鼠则无结核病复发.结论 H37Rv攻毒豚鼠后,用异烟肼和吡嗪酰胺联合化疗可抑制MTB增殖,成功建立豚鼠MTB潜伏感染模型,潜伏感染可致豚鼠结核病的自然复发或地塞米松诱导复发.PPD试验反应强弱与结核病复发有关.     

实验性糖尿病结核动物模型的建立

目的　建立糖尿病合并结核的动物模型。方法 腹腔一次性注射2%链脲佐菌素(60mg/kg体重)建立Wistar大鼠糖尿病模型,再经大鼠尾静脉注射结核分支杆菌H₃₇Rv0.01mg/0.4ml建立糖尿病结核模型。分别测定血糖值、肺脏病变指数和肺泡巨噬细胞吞噬的结核分支杆菌数,观察肺、肝、脾及胰腺组织的病理学改变。结果 实验组不仅血糖≥16.65mmol/L,胰岛受损,且肺、脾组织有明显结核病变。结论 实验表明我们建立的糖尿病结核动物模型是成功的。     

母牛分支杆菌菌苗对结核病小鼠IFN-γ和IL-4m RNA表达影响的研究

目的　从基因水平探讨母牛分支杆菌的抗结核保护性免疫机理。方法 BALB/C小鼠随机分为三组:结核病模型组(A);攻毒后微卡免疫组(B)及正常对照组(N)。感染四周后将全部小鼠处死。小鼠肺组织做病理切片进行HE染色,脾脏组织进行RTPCR以检测IFN-γ和IL4的mRNA表达。结果 三组小鼠脾脏中均可检测到IFN-γ的mRNA表达,但以B组表达最强;只有A组可检测到IL4mRNA表达,其余两组未见目的带;B组小鼠肺部病变较A组轻而且局限。结论 母牛分支杆菌菌苗可以通过促进IFN-γ的mRNA表达抑制IL4的mRNA表达来增强机体的抗结核保护性免疫。     

Comparative analysis of mycobacterial infections in susceptible I/St and resistant A/Sn inbred mice.

SETTING: The availability and appropriate use of animal models is of significant importance for a better and more detailed understanding of the genetic, immunological and pathological mechanisms underlying the development of mycobacterial disease in humans. OBJECTIVE: To define a mouse model for tuberculosis severity that can be easily adapted to genetic and immunological analysis of host response to Mycobacterium tuberculosis infection. DESIGN: We describe here two inbred strains of mice, I/St and A/Sn (both Nramp1'), that differ vastly in commonly used parameters of susceptibility to infection with virulent and attenuated strains of M. tuberculosis. RESULTS: Following infection with a high dose of virulent H37Rv. M. tuberculosis and compared to their resistant A/Sn counterparts, I/St mice displayed more than a 2-fold shorter mean survival time and a more rapid onset and progression of severe body weight loss (cachexia). Moreover, I/St mice supported 20-100-fold higher multiplication of M. tuberculosis following challenge with H37Rv over a large range of infectious inocula. The high susceptibility of I/St mice was also reflected by more severe lung histopathology as evidenced by larger and more numerous lung granuloma and macrophage dominated cellular infiltrates. Finally, we determined that I/St are also unable to control infection with attenuated H37Ra M. tuberculosis and two strains of M. bovis (BCG and Ravenel) indicating hyper-susceptibility of the I/St mouse strain to mycobacterial infections. CONCLUSIONS: The results of our experiments suggest that comparative analysis of resistant A/Sn and susceptible I/St mice provides an ideal way to study host dependent aspects of tuberculosis susceptibility under the controlled conditions provided by an animal model.