RNA干扰抑制缺氧诱导因子1α表达对缺氧内皮细胞通透性的影响

目的 了解RNA干扰技术特异性抑制缺氧诱导因子1α(HIF-1α)表达对缺氧血管内皮细胞通透性的影响.方法 利用质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR构建针对人HIF-1α基因的RNA干扰表达载体.将VE细胞分为正常对照组、缺氧组(置于含体积分数1%O_2的混合气体环境中缺氧处理6 h)、转染组、转染缺氧组(转染载体后再进行缺氧处理).采用RT-PCR法检测正常对照组、转染组HIF-1αmRNA表达,采用蛋白质印迹法检测4组细胞HIF-1α蛋白表达.荧光分光光度计检测单层VE细胞的通透性.将上述缺氧处理替换为HIF-1α特异性诱导剂1 mmol/L二甲氧乙二酰甘氨酸(DMOG),分为DMOG组、转染DMOG组、正常对照组、转染组,采用蛋白质印迹法观察各组HIF-1α蛋白表达.除通透性检测数据用荧光强度值表示外,其他数据用密度比值表示.实验结果进行组间两两t检验.结果 正常对照组细胞HIF-1α mRNA相对含量为0.765±0.069,转染组细胞HIF-1α mRNA相对含量为0.093±0.007,组间比较,差异有统计学意义(t=16.696,P<0.05).转染缺氧组细胞HIF-1α蛋白含量为0.591±0.029,显著低于缺氧组(2.612±0.259,t=13.415,P<0.05);转染DMOG组HIF-1α蛋白含量为0.566±0.008,显著低于DMOG组(3.243±0.551,t=6.975,P<0.05).缺氧组单层血管内皮细胞通透性(41.6±11.1)较正常对照组(9.4±1.5)显著升高(t=6.238,P<0.05),转染缺氧组单层血管内皮细胞通透性(13.3±4.5)显著低于缺氧组(t=5.430,P<0.05).结论 采用特异性针对HIF-1α基因的RNA干扰技术,能有效抑制内皮细胞HIF-1α表达,并明显抑制缺氧引起的血管内皮细胞通透性增强.     

缺氧微环境对胰腺癌细胞发生上皮向间叶转化的诱导作用

目的 探讨胰腺癌细胞在缺氧微环境中通过发生上皮向间叶转化(EMT)从而获得侵袭性表型的可能机制.方法 在缺氧微环境下培养胰腺癌细胞Pane-1、Transwell侵袭小室对比检测细胞在缺氧微环境下侵袭能力的变化情况.Western blot、免疫荧光检测缺氧对Panc-1细胞上皮细胞标记分子E-cadherin、间叶细胞标记分子vimentin表达的影响;实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测缺氧对EMT诱导因子Snail表达的影响.将编码HIF-1α cDNA的真核表达载体pCD-NA 3.1-HIF-1α瞬时转染Panc-1细胞,Western blot检测HIF-1α对E-cadherin、vimentin表达的影响.结果 常氧组细胞每高倍镜视野穿透数为(84±3)个,缺氧组为(121±5)个,差异有统计学意义(P<0.01).Panc-1细胞在常氧、缺氧12 h、缺氧24 h、缺氧48 h条件下E-cadherin蛋白的相对值分别为(0.59±0.04、54.00±0.05、0.45±0.10、0.36±0.03);vimentin蛋白的相对值分别为:(0.36±0.05、0.41±0.04、0.48±0.06、0.58±0.05),缺氧同常氧组比较差异有统计学意义(P<0.05).缺氧微环境下Panc-1细胞Snail mRNA的表达量升高,在缺氧第3天后差异具有统计学意义(P<0.05).Panc-1细胞转染HIF-1α前后,E-cadherin蛋白的相对值分别为0.63±0.05、0.47±0.07;Vvi-mentin蛋白的相对值分别为0.47±0.07、0.32±0.04,转染前后差异有统计学意义(P<0.05).结论 缺氧微环境可能通过活化HIF-lα、Snail等转录因子,促进胰腺癌细胞发生上皮向间叶转化,产生侵袭性表型.     

体外Akt基因转染对骨髓间充质干细胞葡萄糖转运载体-4表达和易位的影响

目的探讨葡萄糖转运载体(GLUT)-4是否参与骨髓间充质干细胞(MSCs)的葡萄糖转运以及Akt基因转染提高MSCs耐缺氧能力是否与GLUT-4易位和表达有关。方法将经Akt基因转染和未转染的MSCs均行常氧(5%CO2)和缺氧(94%N2、1%O2和5%CO2)37℃孵育8 h。放射同位素法检测氚标-脱氧葡萄糖(3H-G)的摄取量,免疫细胞化学染色、Western blot和RT-PCR分别检测GLUT-4的蛋白质和mRNA表达。结果①缺氧转染组的3H-G摄取量是缺氧非转染组的(1.39±0.13)倍(P0.05),但仍低于常氧非转染组(P0.05)。②MSCs在常氧或缺氧、Akt基因转染或无转染的条件下均可表达GLUT-4蛋白。与常氧非转染组比较,缺氧非转染组GLUT-4 mRNA和蛋白的表达水平明显降低(P0.05)。③与缺氧非转染组比较,缺氧转染组的GLUT-4 mRNA〔(1.756±0.152)倍〕和蛋白〔细胞总GLUT-4蛋白(1.653±0.312)倍,细胞膜GLUT-4蛋白(2.041±0.258)倍〕的表达水平明显提高(P0.05),且GLUT-4蛋白易位明显;但与常氧非转染组比较,其GLUT-4 mRNA和蛋白的表达水平仍较低(P0.05)。④MSCs的3H-G摄取量与细胞膜中GLUT-4蛋白的表达呈正相关(r=0.415,P=0.001)。结论GLUT-4可能参与MSCs的葡萄糖转运,Akt基因提高MSCs耐缺氧能力可能与提高GLUT-4的表达和易位有关。     

双链小片段干扰RNA抑制缺氧条件下乳鼠心肌细胞缺氧诱导因子1α表达

目的　构建含缺氧诱导因子 1α(HIF 1α)小片段干扰RNA(siRNA)靶序列的U6启动子表达框结构 ,观察其对缺氧条件下乳鼠心肌细胞HIF 1α表达的影响。　方法　分离培养乳鼠心肌细胞 ,分为常规培养液对照组、RNA干扰 (RNAi)组 (转染无效干扰序列Ⅳ )、RNAi抑制组 (转染有效干扰序列并按下游引物不同分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组 )。设计、合成 3对 (Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ )含HIF 1α编码基因片段(正、反义 )和 1对 (Ⅳ )随机序列 (正、反义 )的PCR下游引物。PCR法构建U6启动子表达框及相应正、反序列表达框 ,同时转染心肌细胞。每组每时相点 5皿细胞。于缺氧 1h后 ,用蛋白免疫印迹法(Western blot)测定其蛋白水平表达 ,免疫组织化学法检验干扰效果。缺氧 6h后采用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)法检测HIF 1αmRNA的表达。　 结果　筛选出的最佳抑制片段为Ⅱ组序列。缺氧 1h,对照组、RNAi组心肌细胞HIF 1α蛋白水平显著增高 ,Ⅰ、Ⅱ、ⅢRNAi抑制组HIF 1α蛋白水平较对照组明显降低 ,其中Ⅱ组降低最为显著 (P <0.0 1);缺氧 6h,RNAi组心肌细胞HIF 1αmRNA水平较常氧条件下明显增高 (P <0.0 1);RNAi抑制Ⅱ组未见明显增高 (P >0.0 5 )。　 结论　构建的HIF 1αⅡ组表达框能有效地抑制缺氧乳鼠心肌细胞HIF 1α表达     

缺氧诱导因子-1和凋亡信号调节激酶1在肝癌细胞SMMC-7721缺氧时化疗耐药形成中的作用

目的 研究不同氧气条件下肝癌细胞HIF-1和ASK1表达水平在化疗过程中的变化.方法 噻唑蓝(MTT)比色法检测肝癌细胞生长情况和药物中效浓度(IC50).逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法检测HIF-1α和ASK1表达水平,比较氧气、化疗药物、HIF-1抑制等因素对他们表达的影响.结果 化疗对肝癌细胞常氧时抑制效果较缺氧时更明显,常氧和缺氧IC50存在明显差异.缺氧时两者表达水平均升高,HIF-1α在IC50缺氧组中翻译水平最高,ASK1在IC50常氧组中翻译表达最多.结论 HIF-1α可能在缺氧时通过对ASK1蛋白水平的抑制实现肝癌细胞化疗耐药形成.     

HIF-1α通过MMP-2/9途径介导缺氧环境下肝癌细胞侵袭的实验研究

目的:探讨缺氧环境下缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)对肝癌细胞侵袭的影响及机制。方法:选取肝癌SMMC-7721/Bel-7402细胞,Western blot检测HIF-1α蛋白在缺氧环境下的表达;将肝癌SMMC-7721细胞分为常氧组、缺氧组、缺氧+con sh RNA组、缺氧+HIF-1αsh RNA组,将慢病毒介导的HIF-1αsh RNA转染细胞,继续培养36 h,Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力,Western blot检测HIF-1α、MMP-1、MMP-2、MMP-9表达。结果:缺氧增强了肝癌细胞HIF-1α表达(缺氧组vs常氧组,均P0.01);缺氧条件下,侵袭细胞数目明显增多(缺氧组vs常氧组:218.33±5.51 vs 105.66±7.02,P0.01);HIF-1α降低后,细胞侵袭能力显著降低(缺氧+Con sh RNA组vs缺氧+HIF-1αsh RNA组:217.33±4.51 vs 127.66±3.06,P0.01);缺氧条件下,HIF-1α上调了MMP-2、MMP-9表达。结论:HIF-1α通过调控MMP-2/9表达增强了缺氧条件下肝癌细胞的侵袭能力。     

复氧方式对慢性缺氧幼年大鼠肺组织TNF-α、IL-1β和IL-10 mRNA表达的影响

目的观察不同复氧方式对慢性缺氧幼年大鼠肺组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-10(IL-10)mRNA的表达的影响。方法5周龄雄性SD大鼠54只,随机均分为三组Ⅰ和Ⅱ组大鼠分别在常压低氧(FiO2=10%)下持续缺氧2周后快速纯氧或21%O2复氧3h;Ⅲ组大鼠行间断缺氧(慢性缺氧同Ⅰ组,但每天暴露于空气中1h)2周后快速纯氧复氧3h。各组大鼠分别于复氧后0、1、3h留取肺组织标本。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测肺组织TNF-α、IL-1β、IL-10mRNA表达水平,光镜下观察肺组织病理改变。结果与复氧前相比,Ⅰ组大鼠肺组织TNF-α、IL-1βmRNA在复氧1、3h明显升高(P<0.01),IL-10mRNA表达在复氧3h后明显升高(P<0.01)。Ⅱ、Ⅲ组大鼠肺组织复氧1、3hTNF-α、IL-1βmRNA的表达和复氧3hIL-10mRNA表达均明显低于Ⅰ组(P<0.01)。肺组织病理检查见Ⅱ、Ⅲ组大鼠的肺损伤均较Ⅰ组明显减轻。结论慢性缺氧幼鼠肺组织复氧损伤早期存在炎症介质/抗炎介质失衡,21%O2复氧及复氧前间断吸入21%O2可明显减少复氧后炎性因子的表达和减轻复氧引起的肺损伤。     

缺氧通过抑制E-cadherin促进胰腺癌细胞侵袭的研究

目的 观察缺氧对胰腺癌细胞E-cadherin表达的抑制以及侵袭性生物学行为的影响,探讨E-cadherin表达抑制的调控机制.方法 分别在常氧和缺氧环境下培养胰腺癌细胞Pane-1,通过Western blot和TransweU技术对比观察E-cadherin表达的差异以及细胞侵袭能力的变化.体外转染表达HIF-α siRNA的真核表达载体pGenesil-1-HIF-1α以及对照载体,进一步检测沉默HIF-α之后,Pane-1细胞E-cadherin和细胞侵袭能力的变化.结果 缺氧可以抑制Pane-1细胞E-cadherin的表达,并增强其在体外的侵袭能力.而通过RNAi技术沉默了HIF-α之后,则町以部分恢复缺氧微环境对Pane-1细胞E-cadherin表达的抑制,同时降低其在体外的侵袭能力.结论 缺氧微环境中HIF-α的活化可抑制E-cadherin的表达并加强胰腺癌细胞侵袭能力.     

反义缺氧诱导因子-1α对胰腺癌细胞BxPC-3化疗敏感性的影响

目的： 观察反义缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)对胰腺癌细胞BxPC-3化疗敏感性的影响。方法：实验分组：（1）缺氧条件下(0.5% O2)体外培养4h，未转染反义HIF-1α质粒的BxPC-3细胞设为缺氧对照组；（2）常氧条件下体外培养，未转染反义HIF-1α质粒的BxPC-3 细胞设为常氧对照组；（3）缺氧条件下(0.5% O2)体外培养4h，稳定转染反义HIF-1α质粒的BxPC-3细胞设为实验组。采用逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR)和免疫印迹(Western Blot)检测各组的HIF-1α和survivin表达情况。 流式细胞术和MTT比色法检测不同剂量的化疗药物(5-氟尿嘧啶、阿霉素、吉西他宾)对各组的凋亡率和生长抑制率的影响。 结果：实验组HIF-1α和survivin的表达明显降低 (P<0.05)，与对照组相比，实验组的凋亡率、抑制率与剂量成正比，高剂量引起高抑制(P<0.05)。 结论：反义HIF-1α可能通过阻断survivin的表达而增强胰腺癌对化疗的敏感性。据此可望通过阻断HIF-1α的表达为胰腺癌基因治疗提供一种新途径。     

反义缺氧诱导因子-1α对胰腺癌生长转移的影响

目的观察反义缺氧诱导因子（HIF）-1α对胰腺癌生长、转移的影响及其与β1-integrin的关系。方法缺氧条件下（0.5％O2）体外培养4h，未转染反义HIF-1α质粒的BxPc-3细胞设为缺氧对照组；常氧条件下体外培养，未转染反义HIF-1α质粒的BxPc-3细胞设为常氧对照组；缺氧条件下（0．5％O2）体外培养4h，稳定转染反义HIF-1α质粒的BxPc-3细胞设为实验组。采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot检测HIF-1α和β1-integrin的表达情况。Transwell侵袭室方法检测BxPc-3细胞侵袭能力。裸鼠皮下接种BxPc-3细胞8周后，观察各组肿瘤生长情况。结果实验组HIF-1α和β1-integrin的表达明显降低，迁移的细胞数远少于对照组（P〈0．05）；实验组肿瘤的体积、重量、生长速度远低于对照组（P〈0.05）。结论反义HIF-1α可能通过阻断β1-integrin的表达而抑制胰腺癌的生长和转移。因此，阻断HIF-1α的表达为胰腺癌基因治疗提供了新途径。     

Hypoxia and spermatogenesis

This review mainly focuses on our understanding of spermatogenesis in physiological and pathological hypoxic condition. Real hypoxia is closely related to vascular changes and an increase in testicular temperature. Both induce a reduction in sperm count and can be related to the increase in germ cell apoptosis. On the other hand, change in the temperature, and oxygen levels in the microenvironment have influence on spermatogonial stem cell function and differentiation. The initial connection between hypoxia and a factor critical for stem cell maintenance is alteration in Oct-4 expression, and these data may be a useful strategy for modulating stem cell function. Unilateral testicular ischemia-induced cell death can be accompanied by an increase in germ cell apoptosis in the contralateral testis. The injury of contralateral testis following unilateral testicular damage is controversial, and it can contribute to the reduction in fertility.     

乏氧与放射敏感性的研究进展

大多数肿瘤细胞生长迅速,但血管的生长速度不能完全满足其对生长的需求,以至内部肿瘤细胞出现供血不足,从而导致乏氧。     

Hypoxia and polytrauma]

The importance of polytrauma and hypoxia, resp., is discussed by the authors with regard to the mortality and the common effect of these is analysed. It was found that in the mortality of the patients suffered polytraumatism the first place (59,4%) is taken by such lesions, in which simultaneous lesion of the skull and the thorax occurs. The values of the blood gas and the acid-base balance of the patients who had suffered polytraumatism, were examined in the 12th--24th hours proceding the death. It was found that whereas--using the possibilities of the intensive therapy--the values of pH, paCO2 and BE could be kept in a part of the cases between the physiological limits--the paO2 value was under the normal value in all cases--moreover 2/3 of the values fell into the domain between 40--60 mmHg--signifying severe hypoxia. On the basis of the analysis it may be presumed that in the process leading to death of the patients who had suffered polytraumatism the anoxic hypoxy plays considerable role. This is supported also by the earlier data published by the institute, according to which the mortality in itself high--33.8%--of polytraumatism increases to 71.4%, if it is associated hypoxy. Consequently the aim of the therapy must be to exert the greatest activity in order to prevent or to combat, resp., the anoxic hypoxy.     

Hypoxia following interscalene block.

BACKGROUND AND OBJECTIVES: Interscalene brachial plexus block is often used for surgeries involving the shoulder and upper arm. Known complications include phrenic nerve paralysis, intravascular injection, and cervical epidural block. We report a patient who developed acute hypoxia immediately following this block, presumably secondary to an acute pulmonary thromboembolus (PTE) coupled with phrenic nerve paralysis. CASE REPORT: A 43-year-old man with end-stage renal disease secondary to hypertension was scheduled for primary placement of a left upper extremity arteriovenous fistula. A technically unremarkable interscalene brachial plexus block was performed using a 22-gauge regional block needle and 35 mL of 1.5% mepivacaine. Immediately following injection, the patient's oxygen saturation decreased from 99% to 85%, and he complained of chest pain and shortness of breath and developed hemoptysis. Workup revealed an elevated hemidiaphragm, but no pneumothorax or evidence of local trauma. A spiral computed tomogram (CT) suggested acute pulmonary thromboemboli as the etiology of the hypoxia and hemoptysis, although the diagnosis was uncertain. CONCLUSIONS: This case report suggests that manipulations and vasodilation related to an interscalene block may have facilitated the dislodgement of a pre-existing upper extremity thrombus.