贝氏柯克斯体sucB基因的序列分析

目的 通过sucB基因序列比较，了解贝氏柯克斯体分离株的一些遗传特征。方法 对16株贝氏柯克斯体分离株的sucB基因进行扩增、测序和分析。结果 sucB基因1137bp序列中，仅发现3个位置的碱基突变，引起3个氨基酸的改变，从3个碱基突变可大致将这些分离株分为两大群，结论 sucB基因在贝氏柯克期体是一个很保守的酶基因，群的划分似与分离株的质粒型有很大的相关性，而与疾病形式和分离株的地理分布相关性较少。     

毒力相关基因芯片分析感染单核细胞的贝氏柯克斯体毒力相关基因表达

目的 建立贝氏柯克斯体感染单核-巨噬细胞的细胞模型,利用建立的贝氏柯克斯体毒力相关基因芯片分析感染不同时期细菌的转录变化,尝试在分子水平上阐述感染早期贝氏柯克斯体的致病机制. 方法 选择贝氏柯克斯体九里株的166个毒力相关基因进行PCR扩增,制备贝氏柯克斯体毒力相关基因芯片.宿主细胞采用单核-巨噬细胞THP-1,用贝氏柯克斯体九里株感染细胞,在感染后的各时间点提取RNA,逆转录成cDNA,时间零点样品设定为参照组.采用双色荧光标记,待测DNA(即各感染后的各时间点得到cDNA)用Cy5标记,参照基因组DNA用Cy3标记.芯片杂交后,采用软件GenePixPro4.1,辅助以软件Excel,进行图片处理和数据分析. 结果 芯片分析发现贝氏柯克斯体16个基因在感染单核细胞的24h内得到显著表达. 结论 感染单核细胞得到显著表达的贝氏柯克斯体毒力相关基因与细胞内入侵、削弱吞噬细胞内杀菌抑菌作用、适应吞噬体/吞噬溶酶体内生存环境、增强菌体复制有关.     

贝氏柯克斯体毒力相关基因芯片对其他胞内寄生菌基因组DNA检测结果分析

目的用建立的贝氏柯克斯体毒力相关基因芯片研究贝氏柯克斯体与其致病性相似的专性胞内寄生菌(立克次体、埃立克体、新立克次体),以及与其密切相关的兼性胞内寄生菌(巴通体和肺炎军团菌)等病原菌的毒力基因的差异。方法贝氏柯克斯体国际标准株-九里株作为本研究参考株,从全基因序列中选取166个毒力及毒力相关基因进行PCR扩增,纯化后的产物制备基因芯片。采用双色荧光标记,待测DNA(即用于分析的各菌株基因组DNA)用Cy5标记,贝氏柯克斯体九里株参照基因组DNA用Cy3标记。芯片杂交后,采用软件GenePixPro4.1,辅助以软件Excel,进行图片处理和数据分析。结果芯片的166个基因片段中有165个存在于所有贝氏柯克斯体属的6个分离株中,另一锚定蛋白(AnkI)基因(CBU1213)仅存在于九里株及Grita株;立克次体属的5株菌株均与CBU1631和CBU1125杂交;埃立克体属的3种菌株与新立克次体属的3种菌株均含有基因CBU1125;东方属的1株菌株具有基因CBU1449,而巴通体属的菌株,军团菌和大肠杆菌与基因芯片均无杂交。结论贝氏柯克斯体种内基因组具有高度保守性,它的专性细胞内寄生菌的毒力相关基因与胞外寄生菌的毒力相关基因有非常显著差异。     

实时荧光定量PCR检测贝氏柯克斯体方法的建立

目的建立检测贝氏柯克斯体的Real-Time PCR方法。方法根据贝氏柯克斯体特有的htpAB基因相关重复序列（IS1111a）进行PCR扩增片断485bp,以克隆的IS1111a基因片断作标准DNA模板,建立Real-Time PCR检测方法。结果建立的Real-Time PCR标准曲线的循环阈值（Ct）与模板拷贝数呈良好的线性关系（r=0.999）;重复性测试Ct变异系数CV≤6.1%;其灵敏性约为普通PCR的10倍;以其它相关立克次体和病原菌DNA为模板应用于该方法,结果均为阴性。结论所建立的Real-Time PCR方法具有很好的特异性、灵敏性和重复性,可代替普通PCR用于贝氏柯克斯体的感染早期的快速定性、定量检测。     

1997～2000年我国华东地区HIV-1分离株抗原决定簇氨基酸及其编码核苷酸序列的变化

①目的 对1997-2000年来自华东地区52例HIV-1分离株env基因C2-V3区序列及其V3环顶端主要中和抗原决定簇（PND）氨基酸序列的变化规律进行分析。②方法 以来自同时期上述地区的HIV-1感染者PBMC基因组为模板，采用套式PCR扩增HIV-1env基因C2-V3区片段，产物经克隆，测序。DNA测序结果经DNA Star软件分析HIV-1分离株的基因分型，比较HIV-1膜蛋白V3环顶端PND相关用八肽氨基酸及其编码核苷酸序列的变化特征及出现频率并测其共享序列。③结果 1997-2000年华东地区HIV-1分离株的基因分型有7个，分别属于HIV-1M亚群的A-G亚型。分离株间的基因离散率为1.2%-5.8%。同时发现了env基因双V3区变异的HIV-1自然突变朱（Genbank AF220245)。分析52株PND相关八肽基因序列，其中以第2、3、7位氨基酸及其编码核苷酸的变化最为显著，分别为11.5%，9.6%，9.6%，且3组共享序列相关的八肽亲水性有明显差异。④结论 1997-2000年华东地区HIV-1流行呈现多个型别共同，混合流行的特征，膜蛋白PND的八肽基因序列呈现多样性变化，新的HIV-1膜蛋白双V3区变异株的发现可能与病毒重组，免疫逃避及致病机制有关。     

PCR-SSCP分析Q热立克次体中国分离株16S-23S rDNA基因间区

目的 建立快速分析Q热立克次体分离株16S-23S rDNA基因间区株间差异的PCR-SSCP方法。方法 用半套式PCR扩增7株中国分离株（七医、新桥、雅安、李、YS-8、YS-9和YH-11）和3株国际参考株（九里、Henzerling和Grita）的16S-23S rDNA基因间区,对扩增产物进行PCR-SSCP分析。结果 3株云南分离株（YS-8,YS-9和YH-11）与其它7株之间的差异较大。与此区域的序列分析结果一致。结论 Q热立克次体分离株的16S-23S rRNA基因间区由于适应不同的地理环境可发生变异,PCR-SSCP是快速分析这些变异的有效方法。     

云南瑞丽县IDUs人群HIV-1感染者毒株env基因C2-V3区序列的测定

①目的 了解云南瑞丽县１９９４年以后静脉药瘾（ＩＤＵｓ）人群ＨＩＶ－１感染者分离株的分子流行病学特征。②方法 运用套式聚合酶链反应扩增ＨＩＶ－１ｅｎｖ基因Ｃ２－Ｖ３区,将扩增片段纯化后与ｐＥＧＭ５ｚｆ（＋）载体连接,再克隆入大肠杆菌,提取重组质粒,使用ＤＮＡ自动测序仪进行序列测定。③结果 与此地区１９８９年分子流行病学资料比较,Ｖ３区变异不显著,未发现新的亚型与毒株。④结论 ５株ＨＩＶ－１毒株进化     

湖南长沙及湘西泡状带绦虫分离株线粒体cox1基因的克隆及序列分析

目的研究湖南省长沙及湘西泡状带绦虫分离株线粒体细胞色素c氧化酶第I亚基(cox1)基因部分序列(pcox1)的遗传变异情况,并用pcox1序列重构泡状带绦虫与其他带科绦虫的种群遗传关系。方法应用聚合酶链反应(PCR)扩增泡状带绦虫虫株的pcox1,应用ClustalX1.81程序对序列进行比对,然后用Phylip3.67程序MP法和Mage4.0程序NJ法绘制种系发育树,并用Puzzle5.2程序构建最大似然树;同时利用DNAstar5.0中的Megalign程序进行同源性分析,并与GenBankTM中已知泡状带绦虫相应基因序列进行比较分析。结果所获得的pcox1序列长度一致,均为343bp,与GenBankTM公布的带科绦虫序列进行比较分析表明,湖南长沙分离株1和湘西分离株5与已知泡状带绦虫相应基因的相似性分别为99.4%和99.7%,与其它带科绦虫的相似性均小于90.0%;湖南长沙1和湘西分离株5与已知泡状带绦虫相应基因遗传距离分别为0.006和0.003,与其他带科绦虫的遗传距离均大于0.100。种系发育树表明,2个分离株与已知泡状带绦虫位于同一分枝,Bootstrap值在97%以上。结论由于泡状带绦虫...     

莱姆病螺旋体中国分离株外膜蛋白C基因的克隆与序列分析

目的了解引起我国莱姆病的伯氏疏螺旋体外膜蛋白Ｃ（ＯｓｐＣ）基因变异情况。方法应用聚合酶链反应从２株莱姆病螺旋体中国分离株ＢＴ０１和ＢＪ－９０１１全基因组ＤＮＡ中将ＯｓｐＣ基因调出,并插入质粒ｐＧＥＭ－３ＺＦ（＋）中,构建重组质粒ｐＧＥＭ－３ＺＦ（＋）－ＯｓｐＣ,经Ｓａｎｇｅｒ双脱氧末端终止法测序,并将之与国外其它分离株进行同源性比较。结果除信号肽序列外,２株莱姆病螺旋体分离株ＢＴ０１和ＢＪ－９０１１的ＯｓｐＣ基因依次为５７９ｂｐ和５７６ｂｐ,分别编码１９３和１９２氨基酸,两者核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为８６％和８３％,与国外分离株（ＰＢｉ、ＰＫｏ及Ｂ３１）的同源性均较高,其中ＢＪ－９０１１株与国际标准株Ｂ３１株之间核苷酸及氨基酸同源性达９９％。结论伯氏疏螺旋体Ｏｓ－ｐＣ基因在国内２个分离株之间存在一定差异,其与国外分离株之间也存在一定差异     

Characterizations of Chinese isolates of Coxiella burnetii in the com1 gene sequence

Objective: To know some genetical characterizations of Coxiella burnetii Chinese isolates by comparing the coml gene sequence. Methods: com1 gene sequences of Chinese isolates were amplified, se-quenced, and analyzed by comparing our result and the previous published data. Results: Three different com1 sequences were identified in 7 Chinese isolates. Sequence comparison indicated that the isolates harboring the QpRS plasmid could be defined as a new group and, in addition, the isolates carrying the same plas-mid type showed similar com1 gene sequence. Conclusion: Study suggests that the classification of the group based on the coml gene sequence is highly associated with the plasmid type of the isolates and, however, little related to disease forms and geographical origins of the isolates.     

半套式PCR和DNA探针技术检测Q热立克次体

目的 建立半套式PCR和DNA探针技术由于检测Q热立克次体。方法 依据已知的Q热立克次体的16S和23S rRNA基因及其间区的序列。设计3条引物,建立了扩增16S－23S mRNA基因间区的半套式PCR方法,并将扩增片段制成探针,建立了斑点杂交技术。结果 10株Q热立克次体分离株均可扩增出572bp的PCR条带,而对照菌都为阴性,此半套式PCR方法的灵敏度高达1pg;用九里株扩增片段标记后制成的探针,与10个Q热立克次体分离株的全DNA呈阳性杂交,对照菌为阴性,此杂交方法的灵敏度为0．5ng。结论 基于Q热立克次体16S－23S rRNA基因间区的半套式PCR和DNA探针技术具有较好的特异性和灵敏度,可联合应用于Q热的病原学诊断。     

Q热立克次体DNA酶切片段的电泳分析

本文采用限制性核酸内切酶技术,对本室分离的Q热立克次体七医株,进行了DNA酶切片段的电泳分析,并以国外标准株(Grita株)作为参照。Q热立克次体经泛影葡胺密度梯度离心法进行分离纯化。提纯的立克次体DNA,用限制性核酸内切酶(HaeⅢ和BglⅠ)分别消解后,再经琼脂糖凝胶电泳法分析。本文结果证实,七医株和Grita株的酶切电泳图谱存在差异。这种差异在HaeⅢ酶谱上尤为明显。不仅两株立克次体DNA的绝大多数酶切片段的迁移距离不同,而且Grita株明显比七医株缺少包括4.3kb在内的几个HaeⅢ片段。     

DNA sequence analysis of the triose phosphate isomerase gene from isolates of Giardia lamblia

目的：为了探讨来源于中国和其它国家不同地理位置贾第虫分离株之间的遗传学关系。方法：从贾第虫滋养体和包囊提取总DNA。对磷酸丙糖异构酶基因进行PCR扩增。PCR产物经限制性内切酶消化、序列测定及分析。对所得DNA序列数据用DNAstar软件处理并与登录基因库虫株的序列比较。结果：在来自我国（C1、C2、CH2、CH3）,柬埔寨（CAM）、澳大利亚（A1、A2）和美国（BP、CDC）的9株蓝氏贾第虫中,A1、A2和CAM属于第1型（WB）;CH2和CH3属于第2型（JH）;C1、C2、BP和CDC属于第3型（GS）。结论：贾第虫分离株基因型的确定可分为本虫分子系统进货和分子流行病学研究提供重要资料。     

利用RD技术对HCV-1b基因片段的克隆与分析

目的：利用限制性显示(RD)技术对丙型肝炎病毒1b亚型(HCV-1b)基因片段进行克隆与分析。方法：用限制性内切酶Sau3AⅠ消化HCV-1b cDNA，所得的限制性内切酶片段物进行RD-PCR扩增，扩增后的产物克隆至pMD18-T载体并进行快速鉴定。结果：得到20个大小均一(200—1000bp)的限制性片段，测序结果表明，属于HCV-1b基因。结论：RD技术能快速收集大量长度适宜、大小相对均一的病毒基因片段，能很好地用于建立cDNA文库及制备诊断芯片探针。     

人牙髓细胞DPDP-2基因的克隆、测序及序列分析

目的:在人牙髓细胞中克隆DPDP-2基因,研究其可能的功能.方法:体外培养HDPC和人牙龈成纤维细胞(HGF),应用基于PCR的改良消减杂交技术构建HDPC和HGF cDNA消减文库,批量克隆HDPC和HGF的差异表达基因并测序,使用GenBank的BLAST对测序结果进行同源序列比较,并运用计算机软件PC/GENE 6.60版对筛选到的DPDP-2基因进行结构和功能分析.结果:DPDP-2基因序列全长810 bp,没有一个完整的编码区. 可与KIAA0265 gene拼接成一个长6172 bp的完整序列,编码一个含有83个氨基酸的疏水性蛋白,其二级结构由螺旋结构、卷曲结构和伸展部分所组成. 它们可以通过α,β或α/β折叠而形成三级结构. 抗原表位分析发现它可能有3种抗原决定簇结构,即Glu-Asn-Lys-Arg-Thr-Gly,Leu-Ile-Glu-Arg-Leu-Lys和Glu-Leu-Ala-Trp-Glu-Lys. 该蛋白存在一种跨膜螺旋结构和线粒体运输肽结构. 进一步的分泌信号分析结果也证实它是一种非分泌蛋白. 经BLAST同源蛋白质搜索,在Non-redundant SwissProt sequences和PDB protein database中均未查询到同源蛋白质.结论:DPDP-2所编码的蛋白是一种跨膜蛋白,具有信号转导分子的结构特征,又具有CKⅡ的磷酸化位点,可能与细胞分裂、转录调节过程有关.     

沈阳市1份人类免疫缺陷病毒的基因序列分析

目的 :对 2 0 0 4年我院门诊检出的 1例艾滋病感染者体内的HIV 1病毒进行基因序列分析和亚型鉴定。方法 :从HIV 1感染者的全血标本中提取脱氧核糖核酸 (DNA)作为PCR扩增的模板 ,套式引物扩增HIV 1前病毒DNA的p17与p2 4交界部分的基因片断并进行测序。所测定序列与各亚型国际参考株及亚洲流行参考序列进行比较 ,确定被检标本的亚型 ,并进行基因序列分析。结果 :该患HIV 1病毒属于B’亚型毒株 ,经输供血途径感染。该毒株与泰国B’亚型参考株B TH 92 92TH0 14的基因距离最为接近。结论 :在沈阳市有效地控制艾滋病经输供血途径传播应引起我们高度的重视